一种缓解心衰的胶原蛋白肽筛选制备及其应用

本发明属于生物活性肽，具体涉及一种缓解心衰的胶原蛋白肽筛选制备及其应用。

背景技术：

1、射血分数保留型心力衰竭（heart failure with preserved ejectionfraction，hfpef）是心力衰竭的主要亚型之一，其特征为舒张功能受损、运动耐量下降、慢性低度炎症和代谢异常，但左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，lvef）≥50%。流行病学数据显示，hfpef占全部心力衰竭患者的比例高达50%以上，且随着全球人口老龄化进程加速，hfpef的患病率正呈现显著的上升趋势，已成为心血管疾病领域日益严峻的公共卫生挑战。

2、目前，hfpef的临床管理仍以基础疾病控制、生活方式干预和有限的药物治疗为主。由于hfpef涉及代谢紊乱、炎症激活、心肌重构和血管功能异常等多环节病理过程，现有治疗手段在改善患者预后方面效果有限。因此，开发具有安全性高、适合长期辅助干预的食源性活性物质具有重要意义。

3、近年来，食源性生物活性肽因其分子量小、易吸收、生物相容性好且毒副作用低，在心血管代谢疾病的防治中展现出巨大潜力。胶原蛋白是一种高分子功能性蛋白质，广泛存在于动物皮肤、骨、软骨和结缔组织中，其酶解产物富集甘氨酸（gly）、脯氨酸（pro）和羟脯氨酸（hyp）等残基，具有良好的食用安全性、生物相容性和多靶点调控潜力。现有研究多关注其骨关节、皮肤、肌肉或代谢调节作用，针对hfpef的功能验证与机制阐明仍不足。

4、因此，筛选并验证能够改善hfpef相关代谢异常、炎症反应和心脏舒张功能障碍的胶原蛋白肽，对于开发新型营养干预产品、功能食品或辅助改善制剂具有重要应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种结构明确、稳定性强、体内外均能显著缓解射血分数保留型心力衰竭的胶原蛋白源多肽及其筛选制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种具有缓解射血分数保留型心力衰竭功能的胶原蛋白源九肽，其氨基酸序列为ala-gly-phe-pro-gly-ala-pro-gly-gln，单字母缩写为agfpgapgq，如seq id no:5所示，简称为aq9，分子量为800 da。

4、第二方面，本发明提供一种胶原蛋白肽混合物在制备用于缓解射血分数保留型心力衰竭的产品中的应用，所述胶原蛋白肽混合物来源于天然食品副产物，通过虚拟酶解和机器学习活性预测筛选获得，所述缓解包括提高心脏舒张功能、增强运动耐量、改善糖脂代谢、抑制心肌肥大和心肌纤维化中的至少一种。

5、在优选的实施方式中，所述产品为药物组合物、功能食品或营养补充剂。

6、在优选的实施方式中，所述胶原蛋白肽混合物通过akt/mtor-sirt1/pgc-1α能量代谢轴和nlrp3相关炎症通路发挥缓解作用。

7、在优选的实施方式中，所述虚拟酶解采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中的至少一种进行；所述机器学习活性预测包括对抗炎、抗氧化、辅助降压和辅助调节糖代谢四个维度的评分。

8、第三方面，本发明提供上述胶原蛋白源九肽在制备用于缓解射血分数保留型心力衰竭的产品中的应用，所述缓解包括提高心脏舒张功能、增强运动耐量、改善糖脂代谢、抑制心肌肥大和心肌纤维化、降低氧化应激与线粒体功能障碍、抑制炎症反应中的至少一种。

9、在优选的实施方式中，所述九肽能够提高atp水平、降低ros产生、抑制tnf-α、il-6和il-1β炎症因子表达，从而缓解射血分数保留型心力衰竭。

10、在优选的实施方式中，所述九肽通过靶向结合gsk3b蛋白，调节p-gsk3b(ser9)/gsk3b信号通路，抑制心肌细胞肥大和成纤维细胞活化。

11、在优选的实施方式中，所述九肽在模拟胃液中消化2小时后保留率约90%，在模拟肠液中进一步消化后保留率约70%，且无溶血风险，对心肌细胞和成纤维细胞无显著毒性。

12、第四方面，本发明提供一种具有改善射血分数保留型心力衰竭功能的胶原蛋白源九肽的筛选方法，包括以下步骤：

13、（1）对胶原蛋白肽混合物进行lc-ms/ms肽组学分析，获得肽段组成信息；

14、（2）通过网络药理学分析，将候选肽预测靶点与射血分数保留型心力衰竭疾病靶点取交集，获得重叠靶点；

15、（3）通过多种拓扑算法筛选核心靶点；

16、（4）将候选肽与核心靶点进行分子对接，根据结合能力筛选高活性肽；

17、（5）通过体外射血分数保留型心力衰竭细胞模型验证，确定具有显著缓解功能的九肽。

18、在优选的实施方式中，步骤（2）中所述网络药理学分析包括go功能富集分析和kegg通路富集分析；步骤（3）中所述拓扑算法包括degree、mcc、epc、stress和radiality算法中的至少两种；步骤（4）中所述分子对接采用cdocker模块进行。

19、在优选的实施方式中，步骤（5）中所述体外细胞模型包括：

20、高糖高脂诱导的心肌细胞或成纤维细胞模型，其中含有终浓度为12.5 mm葡萄糖和0.2 mm棕榈酸的培养基；

21、和/或，巨噬细胞条件培养基联合异丙肾上腺素共培养的心肌细胞或成纤维细胞模型，其中巨噬细胞经200 ng/ml lps处理6小时和2 mm atp处理30分钟后收集培养基，并加入20 μm异丙肾上腺素。

22、第五方面，本发明提供一种药物组合物，包含有效量的上述胶原蛋白源九肽或胶原蛋白肽混合物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

23、在优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型为口服制剂、注射制剂或缓释制剂。

24、第六方面，本发明提供一种功能食品或营养补充剂，包含有效量的上述胶原蛋白源九肽或胶原蛋白肽混合物，以及食品学上可接受的辅料。

25、第七方面，本发明提供上述胶原蛋白源九肽的制备方法，采用fmoc固相合成法合成，纯度不低于98%。

26、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

27、1. 本发明首次将天然食品副产物来源胶原蛋白肽用于hfpef改善，并以细胞实验、动物实验证明其可抑制心肌细胞肥大、成纤维细胞活化、胶原沉积和巨噬细胞浸润，机制上与akt/mtor-sirt1/pgc-1α能量代谢轴和nlrp3相关炎症通路调控有关，为hfpef的改善提供了一种新的辅助干预策略。

28、2. 本发明首次基于lc-ms/ms肽组学、网络药理学、分子对接和实验验证相结合的技术方案，从胶原蛋白肽混合物中筛选获得结构明确的具有显著活性的胶原蛋白源九肽aq9，克服了传统活性肽筛选盲目性大、效率低的问题。

29、3. 经实验证实，aq9肽具有优异的模拟胃肠液消化稳定性，无溶血风险，对细胞无显著毒性，体内急性吸收效果良好，生物安全性高，适合长期辅助干预。

30、4. 在细胞水平上，aq9肽显著抑制细胞肥大和纤维化，降低炎症水平，抑制氧化应激与线粒体功能障碍；在动物水平上，aq9肽显著提升了心脏舒张功能和整体运动耐量，具有缓解心肌肥大、间质纤维化的功能，且高剂量组作用更为显著。