一种具有多重活性的重组融合蛋白及其用途的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及具有多重活性的重组融合蛋白，其药物组合物、制备方法和用途。

背景技术：

1、成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，fgf21)是一种代谢调节激素，主要在肝脏中表达，通过激活fgf受体(fgfr)和共受体β-klotho发挥作用，改善胰岛素敏感性、促进葡萄糖摄取和利用、促进脂肪酸氧化和脂解、降低甘油三酯和胆固醇水平、增加能量消耗、减少体重、调节食欲和食物摄入，从而调节葡萄糖代谢、脂质代谢和能量平衡。fgf21与肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病和心血管疾病等代谢性疾病密切相关，已开发出多种长效fgf21类似物，例如efruxifermin在临床试验中表现出显著的肝脏和代谢改善作用，特别是在减少肝脏脂肪、炎症和纤维化方面。

2、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，glp-1)是一种重要的肠促胰岛素激素，主要由肠道l细胞分泌，glp-1(7-36)是其主要活性形式。glp-1通过与glp-1受体(glp-1r)结合发挥作用，促进胰岛β细胞分泌胰岛素、延缓胃排空、减少餐后血糖波动、增加饱腹感、减少食物摄入、降低心血管疾病风险，在调节血糖、食欲和能量代谢中起关键作用。glp-1因其多重代谢调节作用，已成为治疗2型糖尿病和肥胖的重要靶点，开发了多种glp-1r激动剂，包括如利拉鲁肽、司美格鲁肽等glp-1类似物。

3、胰高血糖素(glucagon，gcg)是一种由胰腺α细胞分泌的多肽激素，主要在低血糖状态下发挥作用，通过促进肝糖原分解和糖异生来升高血糖。gcg通过与胰高血糖素受体(gcgr)结合发挥作用，在低血糖状态下维持血糖稳态，并且可以通过促进脂肪分解、增加能量消耗影响体重。

4、如何合理利用各靶点之间的代谢调节效应以获得优异的疾病治疗效果，仍是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种具有多重活性的重组融合蛋白，其同时显示出fgf21、glp-1以及gcg活性，从而通过共激动glp-1r、gcgr以及fgf21受体(fgf21r)三个靶点发挥药效，并且具有延长的体内半衰期以进一步改善药物治疗效果。

2、在一个方面，本发明提供了一种具有多重活性的重组融合蛋白，其包含结构域p1和结构域p3，其中p1为具有glp-1/gcg双重活性的结构域，p3为具有fgf21活性的结构域；任选地，所述重组融合蛋白进一步包含半衰期延长结构域p2。

3、在一些实施方案中，所述p1具有glp-1r/gcgr双激动活性，p3具有fgf21r激动活性。

4、在一些实施方案中，所述p1包含选自(1)或(2)中的任一个氨基酸序列：

5、(1) hgqgtftsdyskyldekrakefvqwlx1x2x3x4x5xa(seq id no.1)，x1选自m、i、l、q中的任一个氨基酸，x2选自n、d、r中的任一个氨基酸，x3选自t、s、y、a中的任一个氨基酸或者x3缺失，x4选自a、v、s中的任一个氨基酸或者x4缺失，x5选自g、a、v、s中的任一个氨基酸或者x5缺失，并且，

6、当x5存在时，xa代表的氨基酸序列为gpssgappps(seq id no.2)；

7、当x5缺失时，xa代表的氨基酸序列为ggpssggpssggpss(seq id no.3)且x4缺失，或者，xa且x4缺失；

8、(2) hgqgtftsdyskylderaakdfix6wlesa(seq id no.7)， x6选自k、a、q、e中的任一个氨基酸。

9、在一些具体实施方案中，x1为m，x2为n，x3为t或x3缺失。在一些优选实施方案中，x1为m，x2为n，x3缺失。

10、在一些具体实施方案中，x1至x3选自下表16种组合中的任一种组合，表中“-”代表x3缺失：

11、，

12、优选自组合1、3、4-8、12-14中的任一组，更优选自组合3、4、6或8中的任一组。

13、在一些优选实施方案中，x6为k。

14、在一些具体实施方案中，x4选自a、v、s中的任一个氨基酸，x5为g，以及xa代表的氨基酸序列为gpssgappps(seq id no.2)。在一些具体实施方案中，x4缺失，x5选自g、a、v、s中的任一个氨基酸，以及xa代表的氨基酸序列为gpssgappps(seq id no.2)。在一些具体实施方案中，x5和x4缺失，xa代表的氨基酸序列为ggpssggpssggpss(seq id no.3)。在一些优选实施方案中，x4为a或者x4缺失，x5为g，以及xa代表的氨基酸序列为gpssgappps(seq idno.2)。

15、在一些具体实施方案中，所述p1选自表1.1所列的氨基酸序列中的任一个，优选p1-02、p1-03、p1-05、p1-17、p1-18、p1-20、p1-22中的任一个所示的氨基酸序列，更优选seqid no.17、18、20、32、33或35。

16、在一些实施方案中，所述p3为fgf21类似物。在一些实施方案中，所述p3包含的氨基酸序列与野生型fgf21蛋白相比，存在以下氨基酸取代中的任一个或任意多个的组合：r19v、l98r、p171g、a180e、n121q、m168l。

17、在一些实施方案中，所述p3包含的氨基酸序列与野生型fgf21蛋白相比，存在以下氨基酸取代：r19v、p171g和a180e，可选地，进一步存在l98r、n121q、m168l中的任一个氨基酸取代或其任意组合。在一些实施方案中，所述p3包含的氨基酸序列与野生型fgf21蛋白相比，存在以下氨基酸取代：r19v、l98r、p171g和a180e，可选地，进一步存在n121q和/或m168l。在一些实施方案中，所述p3包含的氨基酸序列与野生型fgf21蛋白相比，存在以下氨基酸取代：r19v、p171g和a180e，可选地，进一步存在n121q和/或m168l。所述fgf21野生型的氨基酸序列具有ncbi参考序列号np_061986.1。在一个具体的实施方案中，所述野生型fgf21为表1.3中p3-06所示的氨基酸序列。在本发明中，fgf21涉及的所有氨基酸取代均以其在野生型fgf21(例如p3-06)中的位置为基准进行编号，例如，在p3-06所示氨基酸序列中的第一个组氨酸(h)编号为1，第二个为2，以此类推至最后一个氨基酸为181。

18、在一些具体实施方案中，所述p3选自表1.3所列的氨基酸序列(包括seq idno.54-59)中的任一个，优选p3-01或p3-02所示的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述p3为seq id no.55所示的氨基酸序列。

19、在一些实施方案中，所述p2包含哺乳动物的免疫球蛋白的fc片段，例如人igg1、igg2、igg3或igg4的fc片段。在一些实施方案中，所述p2包含fc片段的变体，优选人igg1的fc变体，所述fc变体具有改变的fc片段所介导的效应子功能(例如adcc和/或cdc活性，与fcγriiia和/或c1q的亲和力)、延长半衰期、促进多肽链二聚体化和/或增加治疗功效。在某些实施方案中，所述fc变体与野生型人igg1 或igg4 fc片段相比具有至少一个氨基酸取代，例如，在野生型人igg1或igg4 fc片段中的约1-10个氨基酸取代、或约2-7个氨基酸取代、或约3-5个氨基酸取代。所述fc变体可以与野生型人igg1 fc片段具有至少约80％、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%的同一性。fc片段的氨基酸取代实例参见例如国际公开号wo 02/060919、wo 98/23289和wo 97/34631，以及以及美国专利号5,869,046、6,121,022、6,277,375、7,658,921和6,165,745，其全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，所述fc变体与其所源自的野生型人igg1 fc片段相比具有以下一种或任意多种氨基酸取代：l234a、l235a、p329a、p329g、d265s、m252y、s254t、t256e、m428l、n434s (根据eu编号系统的位置)，例如，l234a、l235a、p329g依次对应于表1.2中p2-01所示的氨基酸序列的第14位、第15位、第109位；优选以下氨基酸取代组合中的一种或任意多种：(1)l234a/l235a(lala)；(2) l234a/l235a/p329a(lalapa)；(3) l234a/l235a/d265s(lalads)；(4) l234a/l235a/p329g(lalapg) ；(5) m252y/s254t/t256e(yte)；(6) m428l/n434s(ls)；更优选地，氨基酸取代包括lala、lalapa、lalads、lalapg中的任一种和/或yte、ls中的任一种。在一些实施方案中，所述fc变体包含l234a、l235a和p329g。在一些实施方案中，所述fc片段包含表1.2中任一所示的氨基酸序列(包括seq id no.46-53)，或者与表1.2中任一具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述fc片段包含与表1.2中任一所示的氨基酸序列相比发生至多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个或0个突变的氨基酸序列，以及，所述fc片段包含lala、lalapa、lalads中的任一种和/或yte、ls中的任一种。在一些实施方案中，所述fc片段包含与p2-01所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或98％同一性的序列，并且具有l234a、l235a和p329g。在一个具体实施方案中，所述fc片段包含表1.2中p2-02(seq id no.47)所示的氨基酸序列。

20、在一些实施方案中，按照从n端至c端的顺序，p1、p2和p3具有以下连接关系：

21、(a) p1-la-p2-lb-p3；或者，

22、(b) p3-la-p2-lb-p1；

23、其中， la和lb独立地表示肽接头，“-”表示肽键；可选地，la和/或lb不存在。

24、在一些优选实施方案中，按照从n端至c端的顺序，p1、p2和p3具有以下连接关系：p1-la-p2-lb-p3；其中， la和lb独立地表示肽接头，“-”表示肽键；可选地，la和/或lb不存在。

25、在一些实施方案中，所述肽接头可以是柔性接头，例如选自富含甘氨酸(g)、丝氨酸(s)和/或丙氨酸(a)的氨基酸序列，或者使用来自抗体重链铰链区的氨基酸序列作为接头。例如，参见wo1996/34103。在一些实施方案中，肽接头为人igg1、igg2、igg3或igg4铰链或其变体。在一些实施方案中，所述肽接头富含甘氨酸-丝氨酸，典型地选自seq id no.4：(ggggs)n或seq id no.5：(gs)n，其中n为至少是1的整数，例如n为1、2、3、4、5或6，优选n为1、2或3，更优选n为1或3，例如 seq id no.6：(ggggs)3或gs。在一些实施方案中，所述肽接头富含甘氨酸-丙氨酸，典型地选自seq id no.8：(gggga)n，其中n为至少是1的整数，例如n为1、2、3、4、5或6，例如seq id no.9：(gggga)3。在一些实施方案中，所述肽接头富含丙氨酸-丝氨酸，或者所述肽接头选自其它本领域已知的柔性接头，例如seq id no.10：(g)1-30、seqid no.11：kesgsvsseqlaqfrsld、seq id no.12：egkssgsgseskst、seq id no.13：gsagsaagsgef。在一些实施方案中，所述肽接头的长度为2-26个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽接头的长度为2-20个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽接头的长度为2-15个氨基酸，或者3-15个氨基酸，或者5-15个氨基酸，优选15个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽接头使得两个相邻的结构域在空间或功能上彼此互不影响。

26、在一些实施方案中，所述la和lb可以相同，例如均包含seq id no.4：(ggggs)n或seq id no.8：(gggga)n，优选地n=3。在一些实施方案中，所述la和lb可以不同，其中la包含seq id no.4：(ggggs)n，lb包含seq id no.5：(gs)n或seq id no.8：(gggga)n。在一个具体实施方案中，la包含seq id no.6：(ggggs)3，lb包含gs。在一个具体实施方案中，la包含seqid no.6：(ggggs)3，lb包含seq id no.9：(gggga)3。在一个具体实施方案中，la不存在，lb包含seq id no.4： (ggggs)n，优选n=3。

27、在一些实施方案中，所述重组融合蛋白包含多肽链，所述多肽链包含如前述(a)所示的结构，所述多肽链选自表2所示氨基酸序列中的任一个，优选fgg02、fgg03或fgg05所示氨基酸序列。

28、在一些实施方案中，所述多肽链包含如下所示氨基酸序列中的任一个：hgqgtftsdyskyldekrakefvqwlx(1)x(2)x(3)ggpssgapppsggggsggggsggggsdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsggggshpipdsspllqfggqvrqvylytddaqqteahleiredgtvggaadqspesllqlkalkpgviqilgvktsrflcqrpdgalygslhfdpeacsfrerlledgynvyqseahglplhlpgnksphrdpaprgparflplpglppappeppgilapqppdvgssdplsmvggsqgrspsyes(seq id no.14)，其中x(1)至x(3)选自下表16种组合中的任一种组合，表中“-”代表x(3)缺失：

29、，

30、优选地，x(1)至x(3)选自组合1、3、4-8、12-14中的任一组。在一些优选实施方案中，所述多肽链包含表1.4所示氨基酸序列中的任一个。

31、在一些实施方案中，所述多肽链包含如下所示氨基酸序列中的任一个：hgqgtftsdyskyldekrakefvqwlldaggpssgapppsggggsggggsggggsdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalgapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkx(5)hpipdsspllqfggqvrqvylytddaqqteahleiredgtvggaadqspesllqlkalkpgviqilgvktsrflcqrpdgalygslhfdpeacsfrex(6)lledgynvyqseahglplhlpgx(7)ksphrdpaprgparflplpglppappeppgilapqppdvgssdplsx(8)vggsqgrspsyes(seq id no.15)，其中x(5)至x(8)选自下表10种组合中的任一种组合：

32、。

33、在一些优选实施方案中，所述多肽链包含表7所示氨基酸序列中的任一个，优选seq id no.80或81。

34、在一些实施方案中，所述重组融合蛋白是同源多聚体(例如同源二聚体)，其由至少两条相同的前述多肽链构成。多肽链之间主要通过非共价相互作用和/或二硫键彼此结合，例如通过fc片段中铰链区的二硫键彼此结合。在一个具体实施方案中，所述重组融合蛋白由两条相同的前述多肽链构成，并通过fc片段二聚化。

35、在一些实施方案中，所述重组融合蛋白保留野生型glp-1活性或野生型glp-1对glp-1r激动活性的至少0.001%、至少0.01%、至少0.1%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100%。在一些实施方案中，所述重组融合蛋白保留野生型glp-1活性或野生型glp-1对glp-1r激动活性的0.1%-100%，0.1%-50%，0.1%-40%，0.1%-35%，0.1%-30%，0.1%-25%，0.1%-20%，0.1%-15%，0.1%-10%，0.1%-5%，1%-50%，1%-40%，1%-35%，1%-30%，1%-25%，1%-20%，1%-15%，1%-10%，5%-50%，5%-40%，5%-35%，5%-30%，5%-25%，5%-20%,10%-50%，10%-40%，10%-35%，10%-30%，10%-25%，10%-20%，20%-50%，20%-40%，20%-35%，20%-30%，30%-50%，或者30%-40%。在一些实施方案中，所述重组融合蛋白相较于survodutide具有更佳的glp-1活性或glp-1r激动活性。

36、在一些实施方案中，所述重组融合蛋白保留野生型gcg活性或野生型gcg对gcgr激动活性的至少0.001‰、至少0.01‰、至少0.1‰、至少1‰、至少0.01%、至少0.1%、至少0.5%、至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%或至少50%。在一些实施方案中，所述重组融合蛋白保留野生型gcg活性或野生型gcg对gcgr激动活性的0.01‰-0.1‰，0.1‰-1‰，1‰-0.01%，0.01%-0.1%，0.1%-1%，1%-10%，10%-20%，20%-30%，30%-40%，40%-50%，0.1%-0.5%，0.5%-1%，1%-5%，5%-10%，10%-15%，15%-20%，20%-25%，或者25%-30%。

37、在一些实施方案中，所述重组融合蛋白保留野生型fgf21活性或野生型fgf21对fgf21r激动活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少160%、至少170%、至少180%、至少190%、至少200%、至少210%、至少220%、至少230%或者至少240%。在一些实施方案中，所述重组融合蛋白保留野生型fgf21活性或野生型fgf21对fgf21r激动活性的80%-100%，100%-150%，150%-200%，200%-240%，130%-160%，或者180%-210%。在一些实施方案中，所述重组融合蛋白相较于efruxifermin具有更佳的fgf21活性或fgf21r激动活性。

38、在一些实施方案中，所述重组融合蛋白的glp-1/gcg活性比或者所述重组融合蛋白对glp-1r激动活性是对gcgr激动活性的至少1倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍或至少500倍。在一些实施方案中，所述重组融合蛋白的glp-1/gcg活性比或者所述重组融合蛋白对glp-1r激动活性是对gcgr激动活性的1-10倍，1-20倍，1-50倍，50-100倍，50-150倍，100-200倍，150-250倍，200-300倍，250-350倍，300-400倍，350-450倍、或者400-500倍。

39、在一些实施方案中，所述重组融合蛋白与参考物相比具有更好的活性，所述活性包括但不限于：

40、(1) glp-1r、gcgr、fgf21r激动活性中的任一种或其任意组合，优选glp-1r和/或fgf21r激动活性；或者，glp-1、gcg、fgf21活性中的任一种或其任意组合，优选glp-1和/或fgf21活性；

41、(2) 降低血糖；

42、(3) 减轻体重或减少体重增加；

43、(4) 减少脂肪量；

44、(5) 减少肝脂肪变性或降低肝中甘油三酯水平；

45、(6) 降低ast、alt和/或alp水平；

46、(7) 降低或缓解肝纤维化；

47、(8) 降低食欲或减少食物摄取；

48、(9) 增加胰岛素敏感性或脂联素；

49、(10) 降低甘油三酯和胆固醇水平。

50、在一些实施方案中，所述参考物选自：survodutide、efruxifermin、dr10624、efinopegdutide。在一些实施方案中，所述参考物选自专利文献cn109836504b记载的三效活性蛋白，例如c382l13f8l10m2、c462l13f8l10m2、c495l13f8l10m2。

51、在一个方面，本发明提供一种glp-1和gcg双受体激动剂，其包含前述结构域p1；任选地，所述双受体激动剂进一步包含前述半衰期延长结构域p2，和/或，所述双受体激动剂从n端至c端具有以下结构：p1-la-p2，其中，la是肽接头，选自前述任一种肽接头。

52、在一些实施方案中，所述la包含seq id no.4：(ggggs)n或seq id no.8：(gggga)n，优选地n=1、2或3。

53、在一些实施方案中，所述p1选自seq id no.17、18、20、32、33或35，所述p2选自igg1 fc或igg4 fc或其fc变体，所述la选自(ggggs)n或(gggga)n或gs，其中n=1、2或3。

54、在一些实施方案中，所述双受体激动剂包含选自seq id no.91或92所示的氨基酸序列。

55、在一些实施方案中，所述双受体激动剂包含选自由seq id no.79的第1-282位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.80的第1-271位残基组成的序列、由seq id no.81的第1-281位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.82的第1-282位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.83的第1-282位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.84的第1-282位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.85的第1-281位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.86的第1-281位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.87的第1-281位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.88的第1-281位氨基酸残基组成的序列、由seq id no.89的第1-281位氨基酸残基组成的序列或由seq id no.90的第1-281位氨基酸残基组成的序列。

56、在一个方面，本发明提供一种fgf21类似物，其包含前述结构域p3；任选地，所述类似物进一步包含前述半衰期延长结构域p2，和/或，所述类似物从n端至c端具有以下结构：p2-lb-p3，其中，lb是肽接头，选自前述任一种肽接头。

57、在一些实施方案中，所述lb包含seq id no.4：(ggggs)n或seq id no.8：(gggga)n，优选地n=1、2或3。

58、在一些实施方案中，所述p3选自seq id no.55所示的氨基酸序列，所述p2选自igg1 fc或igg4 fc或其fc变体，所述la选自(ggggs)n或(gggga)n，其中n=1、2或3。

59、在一些实施方案中，所述fgf21类似物包含由seq id no.79的第56-478位氨基酸残基组成的序列。

60、在一个方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明的重组融合蛋白或本发明的glp-1和gcg双受体激动剂或本发明的fgf21类似物。本发明的多核苷酸可以是，例如dna或rna，并可包含或可不包含内含子序列。在优选实施方案中，所述多核苷酸为cdna分子。本发明的多核苷酸可基于本发明的重组融合蛋白的氨基酸序列的信息通过已知的方式制备或获得，例如通过自动dna合成和/或重组dna技术。

61、如本领域中所熟知，多个密码子可编码相同氨基酸。因此，编码蛋白质序列的核酸包括具有密码子简并性的核酸。本发明所述的氨基酸序列可由多种核酸编码。遗传密码为通用且熟知。编码本发明所述的任何氨基酸序列的核酸可基于本领域的公知常识容易地构思出，且可经优化以进行生产。尽管编码给定氨基酸的核酸序列的可能数目很大，给定遗传密码的标准表下，且在计算器的辅助下，本领域技术人员可容易地产生编码给定氨基酸的核酸序列的每种可能的组合。

62、在一个方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的多核苷酸。所述载体能够递送并优选在宿主细胞中表达一个或多个目标基因或序列的构建体。所述载体包括真核表达载体、原核表达载体、病毒载体，例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

63、在一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或载体。所述宿主细胞能够产生或分泌完整的本发明的重组融合蛋白或本发明的glp-1和gcg双受体激动剂或本发明的fgf21类似物。所述宿主细胞包含原核细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞，如cho细胞、293细胞、ns0细胞或其它哺乳动物细胞，大肠杆菌或其他原核细胞，酵母细胞或其他真菌细胞。

64、在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的重组融合蛋白或本发明的glp-1和gcg双受体激动剂或本发明的fgf21类似物或本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的宿主细胞，以及一种以上药学上可接受的载体。

65、在一些优选实施方案中，所述药物组合物含有治疗有效量的本发明的融合蛋白或本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的宿主细胞，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。

66、在一些实施方案中，药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂或其组合。在如下中教导了选择和使用合适的赋形剂，gennaro编著，remington: the science and practice of pharmacy，第20版（lippincott williams&wilkins 2003），以引用的方式将其公开内容并入本文。

67、在一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含本发明的重组融合蛋白或本发明的glp-1和gcg双受体激动剂或本发明的fgf21类似物或本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物。

68、在一个方面，本发明提供预防、治疗或缓解疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的重组融合蛋白或本发明的glp-1和gcg双受体激动剂或本发明的fgf21类似物或本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物。

69、在一个方面，提供本发明的重组融合蛋白或本发明的glp-1和gcg双受体激动剂或本发明的fgf21类似物或本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物在制备药物中的用途。在一些实施方案中，所述药物作为fgf21r、glp-1r和/或gcgr的激动剂，例如，glp-1/gcg双受体激动剂或glp-1/gcg/fgf21三受体激动剂或fgf21单受体激动剂。在一些实施方案中，所述药物用于治疗疾病。

70、在一些实施方案中，所述疾病选自fgf21、glp-1和/或gcg的代谢失调引起的疾病，代谢综合征，纤维化疾病，心血管疾病。在一些实施方案中，所述疾病选自糖尿病、脂肪肝、肥胖、胰腺炎、血脂异常、高血压、肝脂肪变性、非酒精性脂肪肝(nash)、非酒精性脂肪肝病(nafld)、代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(mash)、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病、卒中。

71、在一些实施方案中，所述药物用于以下一种或任意多种中：

72、(1) 降低血糖(例如空腹血糖)的水平；

73、(2) 减重或减少体重增加或减少脂肪量；

74、(3) 改善肝重、肝脂，例如降低肝脏重量、减少肝脂肪变性或降低肝中甘油三酯水平；

75、(4) 改善肝功能，例如降低ast、alt和/或alp水平；

76、(5) 降低或缓解肝纤维化；

77、(6) 降低食欲或减少食物摄取；

78、(7) 增加胰岛素敏感性或脂联素；

79、(8) 改善血脂。

80、为清楚起见，本文定义了在化合物的描述中所使用的通用术语。

81、除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

82、如本文所用，术语“fgf21r”意指已知或疑似fgf21在体内形成的多聚受体复合物。在多个实施方案中，fgf21r包括(i)fgfr，例如，fgfr1c、fgfr2c、fgfr3c或fgfr4，和(ii)β-klotho。fgf21信号传导通过其与包含βklotho和fgfr的受体复合物的相互作用介导(ogawa等人(2007)，proc.natl.acad.sci.usa 104:7432-7437；suzuki等人(2008)，mol.endocrinol.22:1006-1014)。

83、术语“fgf21类似物”表示野生型fgf21蛋白质(例如seq id no.59)的一部分氨基酸被取代，其能激活fgf21受体。

84、术语“glp-1/gcg双受体激动剂”指能同时激活glp-1受体和gcg受体的物质。

85、如本文所用，术语“半衰期延长结构域”指直接或经接头与活性结构域连接(融合或缀合)的药学上可接受的部分，半衰期延长结构域积极影响药代动力学或药效动力学行为的机制包括但不限于(i)预防或减轻活性结构域的体内蛋白酶降解或其他降低活性的化学修饰，(ii)通过降低肾过滤、减少受体介导的清除或增加生物利用率来改善半衰期或其他药代动力学特性，(iii)降低毒性，(iv)改善溶解度，(v)增加活性结构域的生物活性和/或目标选择性。

86、如本文所使用的，术语“fc区”、“fc片段”、“fc”可互换使用，是指免疫球蛋白(例如igg)的可结晶片段(fragment crystallizable，fc)。可以通过从免疫球蛋白去除两个抗原结合区(fab片段)获得fc片段。去除fab片段的一种方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因此，fc区由两条重链的恒定区(ch)的大致相同大小的片段形成，其通过非共价相互作用并且任选二硫键连接。fc片段可以包括铰链区并且经ch2和ch3向抗体的c末端延伸。在一些实施例中，fc区是人igg1、igg2、igg3或igg4 fc区。在一些实施例中，fc区是igg1 fc区。

87、如本文所使用的，术语“肽接头”是指可用于连接两个蛋白质结构域以在两个蛋白质结构域之间提供空间和/或柔性的氨基酸或多肽。

88、如本文所使用的，术语“二聚体”或“二聚化”通常是指蛋白质-蛋白质相互作用的一种形式。例如，其可包括两个相关亚单位组成的蛋白质-蛋白质复合物。在本发明中，术语“同源二聚体”通常是指由两个相同的亚单位(例如，两条相同的多肽链)构成的二聚体。

89、如本文所用，术语“融合蛋白”，是指包含一个以上结构域的蛋白质，例如，通常来自不同来源(例如，不同的蛋白质、多肽、细胞等)，所述结构域通过肽键共价连接。在一些实施方案中，重组产生融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白的结构域通过将编码每个结构域的基因序列连接成单个核酸分子而共价连接。

90、如本文所用，术语“信号肽”在本文中定义为以符合阅读框的方式连接(融合)至具有生物活性的多肽的氨基n端且指导该多肽进入细胞的分泌途径的肽。信号肽也可以称为“前导肽”、“多肽前体”、“前肽”等。使用信号肽来指导蛋白质的分泌在本领域中是已知的(例如美国专利us8658174，其内容通过引用整体并入本文)。信号肽的序列可以使用本领域已知的技术来确定(参见，例如，zhang和henzel,2004,protein science[蛋白质科学]13:2819-2824)。典型地，信号肽的长度为约10-60个氨基酸，更常见的长度为15-50个氨基酸。

91、如本文所用，术语“变体”、“突变体”可以互换使用，是指衍生自野生型或亲本多肽并在一个或多个位置包含至少一种突变(例如取代、插入、缺失)的多肽。可以通过本领域公知的各种技术获得变体。特别地，用于改变编码野生型蛋白的dna序列的技术的示例包括但不限于：定点诱变、随机诱变和合成寡核苷酸构建体。因此，本文所用的相对于具体位置的术语“突变”，是指与野生型蛋白或亲本多肽中该具体位置的氨基酸相比，至少该具体位置的氨基酸已被突变(例如，被取代)。

92、如本文所用，术语“取代”是指氨基酸残基被另一氨基酸残基替代。优选地，术语“取代”是指氨基酸残基被选自天然存在的标准的20种氨基酸残基、罕见天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、6-n-甲基赖氨酸、n-乙基甘氨酸、n-甲基甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、n-甲基异亮氨酸、n-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和通常是合成制备的非天然存在的氨基酸残基(例如环己基丙氨酸)的另一个替换。优选地，术语“取代”是指氨基酸残基被选自天然存在的标准的20种氨基酸残基(g、p、a、v、l、i、m、c、f、y、w、h、k、r、q、n、e、d、s和t)的另一个替换。在本文中，使用以下术语指定取代：r19v表示亲本序列或野生型序列第19位的氨基酸残基精氨酸(r)被缬氨酸(v)取代。取代可以是保守或非保守取代。保守取代是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸的相互替换。保守取代的示例包括碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。

93、如本文所用，术语“重组”是指通过基因工程化制备的核酸构建体、载体、多肽、或细胞。

94、如本文所用，术语“表达”是指涉及制备多肽的任何步骤，诸如转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、或分泌。

95、如本文所用，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“蛋白”是指通过肽键连接的氨基酸链，而与形成所述链的氨基酸数目无关。“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“蛋白”在文中可互换使用。

96、如本文所用，术语“氨基酸序列”是指氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序，氨基酸序列只能按照一个方向读取。氨基酸有100多种不同类型，其中20种常用，本发明不排除氨基酸链上有其他物质，例如糖类、脂类等修饰，本发明也不限于20种常用的氨基酸。

97、如本文所用，术语“eu编号”是指针对抗体恒定区的eu编号规则，如edelman,g.m.等人,proc.natl.acad.usa,63,78-85(1969)和kabat等人,sequences ofproteins ofimmunological interest,u.s.dept.health and human services,第5版,1991中所描述的，这些文献均以全文引用的方式并入本文。

98、如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，并且是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。该核酸可以是dna(cdna或gdna)、rna或其混合物。可以是单链形式或双链形式或其混合物。可以是重组、人工和/或合成来源的，并且可以包含修饰的核苷酸，包括例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的糖。本发明的核酸可以是分离的或纯化的形式，并且可以通过本领域已知的技术，例如cdna文库的克隆和表达、扩增、酶促合成或重组技术来制备、分离和/或操作。核酸也可以通过已知的化学合成技术在体外合成，例如在belousov(1997)nucleic acidsres.25:3440-3444中所述的。

99、如本文所用，术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。

100、本文术语“同一性”和“序列……一致性”可以互换，通过以下方式计算获得：为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

101、术语“ic50”意指半数最大抑制浓度，其量测物质(例如融合蛋白)抑制特定生物或生物化学反应的效能。ic50越小，指示物质的效果越强。

102、术语“ec50”意指半数最大有效浓度，其量测物质(例如融合)诱导特定生物或生物化学反应的效能。ec50越小，指示物质的效果越强。

103、术语“受试者”包括任何人类或非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，比如，非人类的灵长类动物、啮齿类动物、家兔、猪、狗、猫、鸡、两栖动物和爬行动物，尽管哺乳动物比如非人类的灵长类动物、啮齿类动物是优选的。

104、术语“治疗有效量”是指足以预防或改善与疾病或病症(例如肥胖、mash)有关的症状和/或减轻疾病或病症严重程度的本发明的重组融合蛋白或glp-1和gcg双受体激动剂或fgf21类似物的量。治疗有效量应在所治疗的病症的背景下理解，其中本领域技术人员可以容易地识别出实际的有效量。

105、术语“代谢失调引起的疾病”通常是指在体内因生物化学过程发生障碍，某些代谢物质(例如糖、脂质、蛋白质、嘌呤等)堆积或缺乏而引起的疾病。代谢失调引起的疾病可由先天因素引起的或由后天因素引起的。所述先天因素可包括先天性遗传缺陷。所述后天因素可包括内脏的病理变化和功能障碍、药物、食物在内的外界因素，例如，进食含过多脂肪和/或胆固醇食物引起的肥胖。

106、术语“肥胖”意味着过量脂肪组织在身体中积累，并且身体质量指数(bmi)在25以上被认为是肥胖。肥胖通常由能量失衡引起——当饮食摄入量长期超过能量消耗量时。肥胖是影响全身的代谢疾病，并且增加糖尿病、高脂血、性功能障碍、关节炎和心血管疾病的风险，而且在一些情况下与癌症发生有关。

107、术语“激活”或“激动”用于指受体或受体复合物以反映直接和/或通过参与多组分信号转导级联产生的生物学效应，该生物学效应是对配体的结合响应，由激动剂配体结合至受体引起的。

108、本发明使用的结构域p1的氨基酸序列列于表1.1中，结构域p2的氨基酸序列列于表1.2中，结构域p3的氨基酸序列列于表1.3中，部分示例性的重组融合蛋白的氨基酸序列列于表1.4中，表中“-”代表不存在任何氨基酸取代。

109、表1.1 p1的氨基酸序列

110、

111、表1.2 p2的氨基酸序列

112、

113、表1.3 p3的氨基酸序列

114、

115、表1.4 示例性的重组融合蛋白的氨基酸序列

116、

117、通过下面的详尽描述和实施例，本发明所公开的其它特征和优点将变得显而易见，其不应被解释为限制性的。在本技术全文中引用的所有参考文献、genbank条目、专利和公开的专利申请的内容以引用的方式明确地并入本文。