用于棉花DNA指纹图谱构建的SNP位点组合、KASP引物及其应用

本发明涉及植物遗传育种，具体涉及用于棉花dna指纹图谱构建的snp位点组合、kasp引物及其应用。

背景技术：

1、棉花（gossypium spp）是我国重要的经济作物之一，目前，棉花品种鉴定主要依赖田间表型鉴定及简单序列重复（simple sequence repeat，ssr）分子标记技术。然而，传统ssr标记检测通常依赖凝胶电泳或毛细管电泳进行片段分析，实验流程复杂、检测效率有限，且不同实验室间数据整合难度大，在大规模、高通量品种鉴定中的应用受到较大限制。近年来，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，snp）因基因组分布广泛、数量丰富、遗传稳定性高及适于自动化高通量检测等优点，逐渐成为植物品种鉴定的重要分子标记。基于snp开发的基因芯片在棉花遗传研究与分子育种中得到广泛应用，但其检测成本较高，依赖大型检测平台，难以在基层种业企业和常规检测中推广应用。

2、然而，现有技术中仍存在以下技术问题：（1）传统snp位点筛选方法大都依赖单一数据源或单一质量指标，覆盖区域有限，易遗漏关键变异区域，导致筛选出的标记集无法全面反映样本遗传多样性，品种鉴别效率低；（2）核心snp位点的数量确定多凭经验选取，缺乏科学的数量确定方法，标记数量过多导致检测成本升高，数量过少则品种区分能力不足；（3）缺乏适用于棉花品种dna指纹图谱构建的标准化核心snp位点组合及配套的kasp检测体系，制约了棉花品种鉴定工作的规范化开展和规模化应用。因此，开发一种基于核心snp位点的棉花kasp指纹图谱构建方法，对于棉花品种真实性鉴定、种子纯度检测、种质资源管理具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供用于棉花dna指纹图谱构建的snp位点组合、kasp引物及其应用，以解决现有技术中snp位点筛选方法单一导致标记集遗传代表性不足、核心位点数量确定缺乏科学依据难以兼顾鉴别效率与检测成本，以及缺乏适用于棉花的标准化核心snp位点组合及kasp检测体系的问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：用于棉花dna指纹图谱构建的snp位点组合，所述snp位点组合由以下26个核心snp位点组成：a02_2198127、a02_6551077、a03_103423966、a04_79410894、a04_75510070、a05_6526611、a06_43274017、a08_119076232、a09_14286848、d02_5778414、d02_1231245、d04_2753129、d05_54798658、d05_13296669、d05_15195826、d05_860461、d05_859033、d05_12748666、d05_56872688、d07_21485004、d07_12158735、d09_8614926、d10_4758937、d10_59804947、d10_62797734、d12_12899667；

3、所述26个核心snp位点均匀分布于棉花a亚组的7条染色体和d亚组的7条染色体，共覆盖14条染色体；所述a亚组的7条染色体为chra02、chra03、chra04、chra05、chra06、chra08和chra09，所述d亚组的7条染色体为chrd02、chrd04、chrd05、chrd07、chrd09、chrd10和chrd12。

4、进一步地，所述kasp引物组合针对上述的26个核心snp位点设计，每个snp位点设计3条引物：带有vic荧光标签序列的第一等位基因特异性引物f1、带有fam荧光标签序列的第二等位基因特异性引物f2和通用反向引物r；

5、所述vic荧光标签序列为5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’，所述fam荧光标签序列为5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’；

6、所述kasp引物组合中各位点的引物序列如seq id no:1～seq id no:78所示。

7、本发明还公开了snp位点组合在棉花dna指纹图谱构建中的应用。

8、本发明还公开了kasp引物组合在棉花dna指纹图谱构建中的应用，包括以下步骤：

9、s1、提取待测棉花样本的基因组dna，将dna浓度调整为10 ng/μl；

10、s2、以s1获得的基因组dna为模板，利用所述kasp引物组合进行pcr扩增，获得扩增产物；

11、s3、读取扩增产物的vic荧光信号和fam荧光信号，根据荧光信号进行基因分型，获得待测棉花样本在26个核心snp位点上的基因型信息；

12、s4、基于s3获得的基因型信息构建待测棉花样本的dna指纹图谱。

13、进一步地，所述pcr扩增采用touchdown梯度降温退火策略，pcr扩增程序为：

14、预变性：94℃，10 min，1个循环；

15、变性：94℃，20 sec，10个循环；

16、复性/延伸：温度从61℃以-0.6℃/循环降至55℃，45 sec，10个循环；

17、再次变性：94℃，20 sec，35个循环；

18、再次复性/延伸：55℃，45 sec，35个循环。

19、进一步地，所述pcr扩增的反应体系总反应体积5μl，组分为：2×taq dnapolymerase mix 2μl，10×snp primer mix 1μl，dna样品2μl；每块反应板设置2个以ddh2o替代dna模板的无模板对照。

20、进一步地，所述s3中基因分型的判读标准为：在vic荧光强度为x轴、fam荧光强度为y轴的散点图中，vic强/fam弱判读为aa纯合型，fam强/vic弱判读为bb纯合型，vic/fam信号居中判读为ab杂合型。

21、本发明还公开了所述的snp位点组合或所述的kasp引物组合，在棉花品种真实性鉴定、棉花种质资源管理、棉花植物新品种权保护、棉花育种材料身份确认、棉花种子质量检测中的至少一种场景中的应用。

22、与现有技术相比，本发明提供的用于棉花dna指纹图谱构建的snp位点组合、kasp引物及其应用，具有以下有益效果：

23、（1）本发明通过构建多维度综合质量评分体系，整合缺失率、maf、hardy-weinberg平衡检验值及shannon熵四项指标，采用双标准协同过滤策略对大规模重测序snp位点进行全面客观评估，改善了传统方法依赖单一指标的局限性，显著提升了标记集整体的数据可靠性与品种鉴别效率。

24、（2）本发明通过引入标记识别效率曲线分析方法，基于品种累积区分能力随标记数量变化的边际增益拐点精确确定核心位点数量，避免了凭经验选取的随意性，以最少26个标记数量实现最优品种区分效果，在保障品种鉴别效率的前提下大幅降低了检测成本。

25、（3）本发明针对26个核心snp位点设计了标准化的kasp引物组合，通过等位基因特异性引物尾部添加vic/fam荧光标签序列，结合page纯化保障引物质量，确保等位基因特异性识别与荧光信号准确区分，分型结果清晰、误判率低。

26、（4）本发明优化设计了touchdown pcr扩增程序，采用预变性94℃×10 min激活热启动酶、梯度降温退火策略，有效提升引物结合特异性、减少非特异性扩增，保障26个位点在多重体系中的均衡扩增。

27、（5）本发明建立了标准化的检测流程，通过统一dna起始浓度（10 ng/μl）、设置双ntc对照及明确的荧光信号判读标准（rfu差值≥2000），消除模板浓度差异干扰，构建污染监测体系，显著提高了结果的重复性与可靠性。

28、（6）本发明筛选的26个核心snp位点均匀分布于棉花a亚组和d亚组共14条染色体，遗传代表性强，仅需26个位点即可区分2882份样本中的2880份（区分度99.93%），在87份棉花样本中分型成功率≥99%，样本区分率达95.4%，能够有效支持棉花品种真实性鉴定、亲缘关系分析及遗传多样性研究，可广泛应用于棉花种质资源管理、品种鉴定及植物新品种权保护等领域。