犬小孢子菌SQLE突变位点的应用以及犬小孢子菌SQLE突变基因和突变蛋白

本技术涉及真菌耐药检测，尤其涉及一种基于犬小孢子菌角鲨烯环氧化酶（sqle）突变位点评估特比萘芬敏感性的方法、检测试剂盒及其应用。

背景技术：

1、犬小孢子菌（

microsporum canis）是一种重要的嗜动物性皮肤癣菌病原体，主要感染犬、猫等伴侣动物，可引起皮肤癣菌病（dermatophytosis），表现为皮肤脱毛、鳞屑、瘙痒及炎症反应等临床症状。同时，犬小孢子菌具有一定的人兽共患风险，可通过动物传播至人类，引起人类皮肤癣菌感染，因此其流行与防控受到广泛关注。已有研究表明，犬小孢子菌是犬猫皮肤癣菌病中最常见的病原之一，在不同地区的犬猫皮肤癣菌病例中具有较高检出率，部分研究报道其检出比例可超过80%，是伴侣动物皮肤癣菌病防治的重要目标。

2、特比萘芬（terbinafine）是一种临床常用的烯丙胺类抗真菌药物，对多种皮肤癣菌具有较强的杀菌作用。其主要通过特异性抑制角鲨烯环氧化酶（squalene epoxidase，sqle）的活性，阻断真菌麦角固醇生物合成途径，导致角鲨烯积累并破坏细胞膜结构，从而发挥抗真菌作用。因此，特比萘芬被广泛应用于犬猫皮肤癣菌病的治疗。

3、然而，随着特比萘芬在临床治疗中的长期和广泛应用，部分皮肤癣菌逐渐出现对该药物敏感性降低甚至耐药的现象，导致治疗周期延长、复发风险增加以及感染控制难度提高。现有研究表明，

sqle编码基因突变是皮肤癣菌产生特比萘芬耐受的重要分子机制之一。已有报道发现，sqle蛋白多个关键氨基酸位点的替换与特比萘芬mic升高及耐药表型相关，例如f395l等突变可在部分特比萘芬低敏感菌株中检测到。然而，由于不同真菌种类、地理来源及药物选择压力的差异，

sqle突变具有多样性，已报道突变位点难以完全覆盖临床样本中出现的新型变异。

4、目前，犬小孢子菌对特比萘芬敏感性的评价主要依赖传统体外药物敏感性试验，包括菌株分离、培养、药物暴露及最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，mic）测定等步骤。该方法通常需要较长检测周期，并依赖专业实验条件，难以满足临床快速筛查和精准用药需求。此外，基于已知耐药突变位点的检测方法通常针对单一或少数已报道突变，检测范围有限，对于携带新型

sqle变异的菌株可能存在漏检风险。

5、因此，亟需建立一种基于犬小孢子菌

sqle关键突变位点的快速分子检测方法，通过检测与特比萘芬敏感性降低相关的

sqle变异，实现对犬小孢子菌药物敏感性降低、高mic表型及潜在耐药风险的快速评价，为临床合理用药和耐药监测提供技术支持。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供一种基于犬小孢子菌角鲨烯环氧化酶（squaleneepoxidase，sqle）突变位点的特比萘芬敏感性评价方法、检测体系及其应用，以解决现有技术中犬小孢子菌特比萘芬敏感性评价主要依赖传统体外药物敏感性试验，存在检测周期长、操作复杂以及已知突变位点覆盖范围有限、难以及时识别携带新型

sqle变异菌株等问题，从而实现对犬小孢子菌特比萘芬敏感性降低、高mic表型及潜在耐药风险的快速评价。

2、为了解决上述技术问题，达到上述目的或者至少部分地解决上述技术问题，作为本技术的第一个方面，提供了犬小孢子菌

sqle突变位点作为检测靶点在评估犬小孢子菌对特比萘芬敏感性降低、高mic表型和/或潜在耐药风险中的应用。所述

sqle突变位点包括犬小孢子菌角鲨烯环氧化酶sqle蛋白第391位和/或第395位氨基酸替换的位点，或其对应的

sqle基因碱基突变的位点。可选地，所述

sqle突变位点包括l391f、l391s、f395i和f395l中的一种或多种，且不单独为f395l；例如l391f、l391s或f395i，又例如l391f和f395i，又例如l391f和f395l，又例如l391s和f395i，又例如l391s和f395l。

3、作为本技术的第二个方面，提供了一种基于犬小孢子菌

sqle突变检测评估其对特比萘芬敏感性的方法，包括：

4、（1）获取待测犬小孢子菌菌株的核酸样本；

5、（2）检测所述核酸样本中包含sqle蛋白第391位和/或第395位氨基酸编码区域的核苷酸序列；

6、（3）根据所述核苷酸序列确定是否存在导致sqle蛋白第391位和/或第395位氨基酸替换的

sqle基因突变；

7、（4）根据突变检测结果评估犬小孢子菌对特比萘芬的敏感性降低、高mic表型或潜在耐药风险。

8、作为本技术的第三个方面，提供了一种用于检测犬小孢子菌

sqle突变位点的检测试剂盒。所述试剂盒包括用于检测上述

sqle突变位点的检测试剂。

9、可选地，所述检测试剂包括pcr扩增检测体系、实时荧光定量pcr（qpcr）检测体系和/或crispr核酸检测体系。同时，本技术也对应提供了检测犬小孢子菌

sqle突变位点的试剂在制备评估犬小孢子菌对特比萘芬敏感性的试剂盒中的应用，所述犬小孢子菌

sqle突变位点参见本技术第一方面的记载。

10、可选地，所述pcr扩增检测体系包括用于扩增犬小孢子菌

sqle突变位点基因区域的pcr扩增引物，所述犬小孢子菌

sqle突变位点基因区域包含编码sqle蛋白第391位和/或第395位氨基酸的核苷酸区域，并可通过对pcr扩增产物进行序列分析确定所述

sqle基因是否存在对应突变。

11、可选地，所述qpcr检测体系包括用于扩增包含sqle蛋白第391位和/或第395位氨基酸编码区域的核酸片段的引物，以及用于区分所述犬小孢子菌

sqle突变位点野生型序列和突变型序列的等位基因特异性检测探针。所述等位基因特异性检测探针包括针对sqle蛋白l391位点的野生型探针，例如l391f突变型探针和/或l391s突变型探针，以及针对sqle蛋白f395位点的野生型探针，例如f395i突变型探针和/或f395l突变型探针，用于检测样本中是否存在与sqle氨基酸替换对应的核苷酸突变。对于f395l突变，本技术基于犬小孢子菌特异性背景以及与其他

sqle突变组合检测体系进行保护，具体参见本技术第一方面中记载的不同

sqle突变组合。

12、可选地，所述crispr核酸检测体系包括crispr相关核酸酶、靶向犬小孢子菌

sqle突变位点区域的crrna以及核酸报告分子。所述crrna靶向包含

sqle突变位点第1172位、第1173位和/或第1183位碱基的核酸区域，用于识别与sqle蛋白第391位和/或第395位氨基酸替换对应的基因突变。所述crispr相关核酸酶选自cas12a、cas12b及具有反式核酸切割活性的变体。

13、作为本技术的第四个方面，提供了一种用于评价抗犬小孢子菌药物活性的菌株模。所述菌株为携带

sqle突变位点的犬小孢子菌菌株。可选地，所述

sqle突变位点包括l391f突变位点，也可以理解为能够表达包含l391f氨基酸替换的sqle蛋白，所述菌株相对于

sqle野生型犬小孢子菌表现出降低的特比萘芬敏感性和/或升高的特比萘芬最小抑菌浓度（mic）。

14、作为本技术的第五个方面，提供了一种利用上述菌株筛选抗犬小孢子菌药物的方法。所述方法包括使候选药物与所述携带

sqle突变的犬小孢子菌菌株接触，检测所述候选药物对所述菌株生长、繁殖或存活的抑制作用，并根据所述抑制作用筛选具有抗犬小孢子菌活性的候选药物。

15、本技术通过将犬小孢子菌

sqle关键突变位点作为特比萘芬敏感性评价的分子检测靶点，建立了基于遗传标志物的快速检测策略，能够有效识别携带

sqle异常变异的犬小孢子菌菌株，弥补现有技术中依赖传统药敏试验及单一已知突变检测导致检测周期长、覆盖范围有限的问题。同时，本技术提供的pcr、qpcr及crispr核酸检测体系能够针对不同形式的

sqle突变进行快速检测，提高犬小孢子菌特比萘芬敏感性评价效率，为临床精准用药、耐药监测以及抗真菌药物筛选提供技术支持。