一种单一重组细胞因子骨修复注射液及其制备方法与流程

本发明涉及一种单一重组细胞因子骨修复注射液及其制备方法，属于医药。

背景技术：

1、目前临床上针对骨缺损、骨折愈合不良、骨不连、脊柱融合等疾病的治疗方案主要包括自体骨移植、异体骨移植、人工合成骨材料、复合生长因子凝胶和复合生长因子敷料等。现有技术存在以下缺陷：

2、一是复合生长因子类产品成分复杂，纯度低、杂质多、残留dna/宿主蛋白不可控，易引发免疫原性反应、异位骨化风险高；

3、二是现有产品多为凝胶、固体、颗粒或敷料形态，无法实现微创精准注射，临床使用受限；

4、三是活性成分无法准确定量，批间差异大、疗效不稳定、质量不可控；

5、四是国内尚无单一高纯度细胞因子注射液类骨修复产品上市，存在巨大临床空白；

6、五是传统植骨材料创伤大、来源有限、修复周期长，无法满足快速、微创、生物活性修复的临床需求。

7、因此，开发一种国产的、安全可控、精准定量、可微创注射的单一细胞因子骨修复注射液具有重要临床价值与市场意义。

技术实现思路

1、本发明的目的之一，是提供一种单一重组细胞因子骨修复注射液。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种单一重组细胞因子骨修复注射液，由如下质量百分数的组分组成：单一重组细胞因子0.001%-0.05%、甘露醇2%-5%、人血白蛋白0.5%-2%、磷酸盐缓冲液0.1%-0.3%和余量为灭菌注射用水。

3、本发明的单一重组细胞因子骨修复注射液的原理是：

4、现有技术中，并没有单一重组人源细胞因子、甘露醇、人血白蛋白、磷酸盐缓冲液和灭菌注射用水组合起来制备骨修复注射液的报道。在本发明中，各组分的作用如下：

5、单一重组人源细胞因子：识别并结合靶细胞表面对应受体、启动细胞内信号通路的作用。

6、甘露醇：保护蛋白活性作用。

7、人血白蛋白：保护重组蛋白、防止失活、调节渗透压、提高安全性、辅助抗冻、抗冻干损伤作用。

8、磷酸盐缓冲液：维持稳定ph环境、减少局部刺激、协同稳定蛋白结构作用。

9、灭菌注射用水：作为溶媒载体、保证注射液的纯度与无菌。

10、本发明经过多次试验，意外且惊喜地发现，采用上述五种原料并辅以相应的配比，得到的骨修复注射液性能优异，具有单一成分、高纯度、低杂质、低免疫原性、异位骨化风险低的技术效果。

11、本发明的单一重组细胞因子骨修复注射液的关键技术指标如下：

12、外观：无色/淡黄色澄明液体，无可见异物；ph：6.5-8.0；渗透压：280mosm/kg-320mosm/kg；纯度：≥95.0%（sec-hplc）；生物学活性：标示量的80%-120%；蛋白含量：标示量的90%-110%；无菌：符合《中国药典》要求；细菌内毒素：＜0.5eu/ml；支原体：阴性；残留dna：≤10ng/ml；宿主蛋白残留：≤100ppm；热原：合格。

13、本发明的单一重组细胞因子骨修复注射液的剂型与给药方式：

14、剂型：无菌注射液；规格：0.5ml、1.0ml、2.0ml；给药方式：骨缺损部位/骨折断端/骨不连部位/脊柱融合节段局部注射；储存条件：-20℃避光储存。

15、本发明的单一重组细胞因子骨修复注射液的有益效果是：

16、1、国内首创：国内首个单一细胞因子骨修复注射液，填补市场空白；

17、2、安全性大幅提升：单一成分、高纯度（≥95%）、低杂质、低免疫原性、异位骨化风险低；

18、3、质量高度可控：活性精准定量、批间一致性好、疗效稳定可预测；

19、4、临床优势显著：微创注射、精准定位、操作简便、创伤小、愈合快；

20、5、工艺成熟可产业化：全流程可工业化放大，成本可控、质量稳定；

21、6、合规性极强：完全符合三类医疗器械和创新医疗器械要求；

22、7、临床价值突出：显著提高骨愈合率、缩短愈合时间、减少患者痛苦。

23、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

24、进一步，由如下质量百分数的组分组成：单一重组人源细胞因子0.03%、甘露醇2.2%、人血白蛋白1%、磷酸盐缓冲液0.2%和余量为灭菌注射用水。

25、采用上述进一步的有益效果是：以上为最佳参数，得到的技术效果也最好。

26、进一步，由如下质量百分数的组分组成：单一重组人源细胞因子0.001%、甘露醇5%、人血白蛋白0.5%、磷酸盐缓冲液0.3%和余量为灭菌注射用水。

27、采用上述进一步的有益效果是：以上为最佳参数，得到的技术效果也最好。

28、进一步，由如下质量百分数的组分组成：单一重组人源细胞因子0.05%、甘露醇2%、人血白蛋白2%、磷酸盐缓冲液0.1%和余量为灭菌注射用水。

29、采用上述进一步的有益效果是：以上为最佳参数，得到的技术效果也最好。

30、进一步，所述单一细胞因子选自bmp-2、pdgf-bb、fgf-2和vegf中的任意一种。

31、采用上述进一步的有益效果是：上述细胞因子均可以用于制备本发明的单一重组细胞因子骨修复注射液。不同细胞因子具有不同的作用，分别对应不同的疾病症状，具体而言：

32、bmp-2，即骨形态发生蛋白-2，是tgf-β超家族的重要成员，在骨形成和修复中具有核心作用。本发明中，单一重组细胞因子采用bmp-2，具有抗炎修复的作用。

33、pdgf-bb，即血小板衍化生长因子bb，是一种在细胞生长、组织修复等生理过程中具有重要作用的细胞因子。本发明中，单一重组细胞因子采用pdgf-bb，具有抗病毒的作用。

34、fgf-2，即成纤维细胞生长因子2，也称为碱性成纤维细胞生长因子（bfgf），是一种在细胞生长、血管生成和组织修复中起关键作用的信号蛋白。本发明中，单一重组细胞因子采用fgf-2，具有调节血管生成、细胞增殖、组织再生的作用。

35、vegf，即血管内皮生长因子，也称为血管通透因子，是一种促进血管内皮生长的因子。本发明中，单一重组细胞因子采用vegf，具有组织修复与创面愈合的作用。

36、本发明的目的之二，是提供上述单一重组细胞因子骨修复注射液的制备方法。

37、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种单一重组细胞因子骨修复注射液的制备方法，包括如下步骤：

38、按如下质量百分数，分别取单一重组细胞因子0.001%-0.05%、甘露醇2%-5%、人血白蛋白0.5%-2%、磷酸盐缓冲液0.1%-0.3%和余量为灭菌注射用水，混合均匀后，调节ph与渗透压；除菌过滤,无菌灌装，即得到所述单一重组细胞因子骨修复注射液。

39、本发明的单一重组细胞因子骨修复注射液的制备方法的有益效果是：

40、1、本发明通过基因重组制备高纯度单一成骨性细胞因子，精准激活骨再生信号通路，定向诱导骨形成，实现骨缺损修复与骨重建。

41、2、本发明的制备方法简单，操作容易，成本低廉，市场前景广阔，适合规模化推广应用。

42、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

43、进一步，步骤1.1中，所述单一细胞因子选自bmp-2、pdgf-bb、fgf-2和vegf中的任意一种。

44、采用上述进一步的有益效果是：上述细胞因子均可以用于制备本发明的单一重组细胞因子骨修复注射液。不同细胞因子具有不同的作用，分别对应不同的疾病症状。

45、更进一步，所述单一细胞因子的制备方法，包括如下步骤：

46、步骤1：工程细胞构建

47、步骤1.1：目的基因密码子优化与片段获取

48、根据单一重组人源细胞因子的天然基因序列，针对大肠杆菌表达系统进行密码子偏好性优化，去除稀有密码子，优化mrna二级结构；对优化后序列进行全基因合成，上、下游分别引入限制性内切酶位点ncoi和xhoi及保护碱基，进行pcr扩增；pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒纯化，获得目的基因片段；

49、步骤1.2：目的基因与载体双酶切

50、将步骤1.1纯化后的目的基因片段与pet-28a(+)质粒，ncoi/xhoi双酶切验证，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分别回收线性化载体与目的片段；

51、步骤1.3：连接与转化大肠杆菌dh5α

52、线性化载体与目的片段混合，加入t4 dna连接酶，连接过夜；连接产物转化dh5α感受态细胞，涂布含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基，倒置培养；

53、步骤1.4：阳性克隆筛选、双酶切验证与双向测序

54、提取单菌落进行菌落pcr鉴定；阳性菌株扩大培养后提取质粒，ncoi/xhoi双酶切验证；将酶切正确质粒进行双向测序，测序结果与优化后序列100%比对一致，即为阳性重组质粒；

55、步骤1.5：转化表达大肠杆菌bl21 de3

56、将阳性重组质粒转化bl21 de3感受态细胞，涂布lb-kan平板培养；挑取单菌落，经菌落pcr、质粒双酶切验证正确，获得原始工程菌；

57、步骤1.6：菌种保存

58、原始工程菌接种lb-kan液体培养基，振荡过夜，冻存备用；

59、步骤2：诱导表达

60、步骤2.1：种子液制备

61、步骤1冻存工程菌划线lb-kan平板活化；挑取单菌落接种3ml-5ml的lb-kan液体培养基，过夜培养，获得种子液；

62、步骤2.2：扩大培养与诱导

63、种子液接种扩大培养基，培养至od600＝0.6–0.8，加入iptg至终浓度0.5mm，25℃诱导12h；离心收集菌体，pbs洗涤2次，-20℃保存；

64、步骤3：蛋白样品处理、纯化与注射液制备

65、步骤3.1：菌体破碎

66、菌体加入裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心，分别收集上清与沉淀；

67、步骤3.2：sds-page与western-blot鉴定

68、上清、沉淀样品进行sds-page电泳，考马斯亮蓝染色；western-blot采用对应细胞因子特异性一抗检测，验证目的蛋白正确表达；灰度分析计算表达量与可溶性占比；

69、步骤3.3：western blot蛋白纯化

70、用anti-his抗体或目的蛋白特异性抗体进行western blot确认表达，上清经ni亲和层析纯化，超滤浓缩，过滤，得到单一重组细胞因子。

71、采用上述更进一步的有益效果是：采用上述方法，可以制备得到本发明所需的单一重组细胞因子。

72、更进一步，步骤1.1中，所述pcr扩增的体系为10×pcr buffer 5μl；2.5mmol/l的dntp mix，4μl；10μmol/l上游引物，1μl；10μmol/l下游引物，1μl；模板dna 1μl；taq dna聚合酶0.5μl；ddh2o 37.5μl，总体系50μl；pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃-60℃退火30s，72℃延伸，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

73、采用上述更进一步的有益效果是：利用在线密码子优化工具expoptimizer（https://www.novopro.cn/tools/codon-optimization.html），进行基因序列反向设计，核心针对宿主大肠杆菌的表达特性，筛选并选用大肠杆菌表达所需的优选密码子，确保密码子使用频率与大肠杆菌密码子偏好性高度匹配，为基因高效翻译奠定基础。设计过程中精准识别并去除序列中含有的ncoi和xhoi酶切位点，有效避免后期基因克隆、载体构建等操作中出现酶切位点干扰，保障后续基因操作顺利开展。

74、与原始基因序列相比，gc含量由86.11%下降至64.43%，有效降低基因序列二级结构复杂度，更契合大肠杆菌的转录和翻译机制，显著提升该细胞因子在大肠杆菌中的表达效果，合理下调的gc含量改善了基因序列的亲水性，提升转录效率，进而提高该细胞因子在大肠杆菌中的表达量及蛋白活性更符合大肠杆菌的基因表达偏好，有效提高该细胞因子在大肠杆菌中的高效表达水平及蛋白可溶性。

75、采用上述扩增体系和程序，可确保pcr反应高效进行，特异性扩增出目的基因片段，减少非特异性条带的产生，得到浓度、纯度均符合要求的产物，为后续酶切、连接步骤提供优质原料。

76、更进一步，步骤1.2中，所述双酶切体系的组成为：目的基因或载体片段，20μl；ncoi酶，1μl；xho i酶，1μl；10×cutsmart buffer，5μl；ddh2o 23μl，总体系50μl；所述酶切的温度为37℃，时间为4h。

77、采用上述更进一步的有益效果是：该双酶切体系组分比例合理，可保证nco i和xho i两种限制酶同时发挥作用，酶切效率高、特异性强，能精准切割目的基因和载体，产生互补的粘性末端，为后续载体与目的基因的连接奠定基础，同时减少非特异性酶切带来的干扰。

78、更进一步，步骤1.3中，所述线性化载体和目的片段的摩尔比为1:5；所述连接过夜的温度为16℃；所述转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞是指42℃热激90s，再冰浴2min，加入soc培养基或lb培养基，37℃复苏1h；所述培养的温度为37℃，倒置培养过夜。

79、采用上述更进一步的有益效果是：载体与插入片段的摩尔比为1:5，可提高连接效率，减少载体自连现象。16℃低温连接过夜能保证连接反应充分进行，提升连接产物的纯度。42℃热激结合冰浴的转化方法可高效将连接产物导入dh5α感受态细胞。37℃复苏和培养能促进感受态细胞恢复活性并增殖，倒置培养可避免菌落蔓延，便于后续阳性克隆的筛选和挑取。

80、更进一步，步骤1.4中，所述双向测序采用t7启动子和t7终止子。

81、采用上述更进一步的有益效果是：双酶切验证，电泳结果显示出现两条条带，大片段约5300bp为pet-28a(+)载体，小片段为对应细胞因子目的片段。t7启动子和t7终止子是常用的测序引物结合位点，特异性强、结合效率高，采用双向测序可从目的基因的两端同时进行测序，确保测序结果的准确性和完整性，有效验证目的基因序列是否正确插入载体，避免序列突变、缺失等问题。将酶切正确质粒进行双向测序，测序结果与优化后序列100%比对一致，无突变、无移码，即为阳性重组质粒。

82、更进一步，步骤1.5中，所述转化至宿主大肠杆菌bl21 de3感受态细胞是指42℃热激法90s，再冰浴2min，加入soc培养基或lb培养基，37℃复苏1h。

83、采用上述更进一步的有益效果是：bl21 de3感受态细胞是常用的蛋白表达宿主菌，该转化方法可高效将重组载体导入宿主菌，37℃复苏和培养能促进宿主菌恢复并增殖，为后续目的蛋白的诱导表达提供充足的阳性菌株，确保蛋白表达实验顺利开展。

84、更进一步，步骤1.6中，所述lb-kan液体培养基的体积为3ml-5ml；所述振荡的温度为37℃，转速为220rpm；所述菌种保存具体是指：将37℃摇床过夜后的菌液和质量浓度为50g/l的无菌甘油按体积比为3:1混匀，分装入无菌冻存管，标记，-80℃长期保存。

85、采用上述更进一步的有益效果是：3ml-5ml的lb-kan液体培养基体积适中，既能为阳性菌株提供充足的营养和生长空间，保证菌株快速增殖，获得足够的菌体量用于后续菌种保藏；又能避免培养基浪费，降低实验成本，同时便于后续摇床培养操作，提升实验效率。

86、标记包括但不限于菌株名称、编号、构建日期、构建人、抗性、测序批号。通过上述操作，可以建立原始菌种→主细胞库mcb→工作细胞库wcb的全流程管理。

87、更进一步，步骤2.1中，所述培养的温度为37℃，转速为220rpm。

88、采用上述更进一步的有益效果是：缩短培养周期；220rpm的摇床转速能保证菌液充分溶氧，同时使菌液与培养基充分接触，避免局部营养不均或缺氧导致的菌株生长差异确保培养出的菌液浓度均一、活性稳定，为后续实验步骤（如菌液扩增、目的产物提取等）提供高质量的菌源基。

89、更进一步，步骤2.2中，所述接种是指将种子液按1%-2%的接种量，接种至50ml-200ml的lb-kan液体培养基中；所述培养的温度为37℃，转速为220rpm；所述诱导的温度为16℃-25℃，时间为16h-20h；或者温度为37℃，时间为3h-4h；所述离心的温度为4℃，转速为8000rpm，时间为10min。

90、采用上述更进一步的有益效果是：采用上述接种量，可以实现扩大培养。采用上述培养参数，可以缩短培养周期；220rpm的摇床转速能保证菌液充分溶氧，同时使菌液与培养基充分接触，避免局部营养不均或缺氧导致的菌株生长差异确保培养出的菌液浓度均一、活性稳定，为后续实验步骤（如菌液扩增、目的产物提取等）提供高质量的菌源基。既可以选择16℃-25℃，时间为16h-20h的低温诱导，也可以选择温度为37℃，时间为3h–4h的高温诱导。高温诱导多用于包涵体。采用上述离心参数，可以实现诱导培养物的离心分离。

91、更进一步，步骤3.1中，所述超声破碎的功率为300w–400w，超声3s，停5s，总时间20min；所述离心的温度为4℃，功率为12000rpm，时间为20min。

92、采用上述更进一步的有益效果是：超声破碎全程冰浴，防止蛋白变性。经过离心分离，可以得到上清、沉淀。其中上清为可溶性蛋白；沉淀为包涵体。

93、sds-page，英文名sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。

94、更进一步，步骤3.2中，所述分离胶的质量浓度为12%-15%。

95、采用上述更进一步的有益效果是：上述分离胶是指sds-page分离胶，适用于分子量10kd-60kd的蛋白质分离。

96、更进一步，步骤3.3中，所述过滤的滤膜孔径为0.22μm。

97、采用上述更进一步的有益效果是：0.22μm孔径的滤膜可有效截留蛋白溶液中的不溶性颗粒、菌体碎片及大分子蛋白聚集体，在不损失目标蛋白的前提下，显著提升蛋白溶液的澄清度与纯度，为后续的蛋白层析纯化步骤提供合格的上样原料，同时避免大颗粒杂质堵塞层析柱筛板，延长层析耗材的使用寿命，降低实验成本。

98、进一步，所述ph值为7.2-7.4，所述渗透压为280mosm/l-320mosm/l。

99、采用上述更进一步的有益效果是：该ph值范围与人体生理ph值高度匹配，可最大程度维持目标蛋白的空间构象、生物活性与结构稳定性，避免蛋白因ph偏离适宜范围发生变性、聚集与活性丧失；该等渗范围的渗透压与人体体液渗透压一致，可保证蛋白制剂的生物相容性，同时避免因渗透压差异导致蛋白结构破坏，为后续的蛋白活性检测、功能学实验、动物实验或临床前研究提供稳定、合格的蛋白样品。

100、进一步，所述无菌过滤的滤膜孔径为0.22μm。

101、采用上述更进一步的有益效果是：0.22μm为各国药典统一规定的除菌级滤膜标准孔径，可高效截留并去除蛋白溶液中的细菌、真菌等各类活微生物，实现样品的终端无菌化处理。该常温过滤除菌方式，可完全避免高温高压灭菌对蛋白活性的不可逆破坏，在保证目标蛋白活性与回收率的同时，满足生物制品的无菌质控要求，避免微生物污染导致样品失效，充分保障后续实验或应用的安全性、合规性与样品稳定性。