一种外泌体-线粒体偶联递送系统及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种外泌体-线粒体偶联递送系统及其制备方法和应用。

背景技术：

1、机体衰老是一个伴随组织功能整体减退的复杂过程，其核心特征之一是慢炎性衰老（inflammaging）与免疫衰老的结合。在衰老微环境中，衰老细胞会持续释放促炎因子，驱动巨噬细胞等免疫细胞出现代谢耗竭与促炎表型；受损的免疫系统无法有效清除炎症碎片，进一步加剧实质器官的退行性病变。打破这种衰老-炎症的恶性循环，是抗衰老研究的关键挑战。

2、细胞衰老是指以细胞周期停滞和衰老相关分泌表型（sasp）为主要特征的状态，衰老还伴随着线粒体功能障碍等细胞器功能紊乱。线粒体作为细胞的能量枢纽，决定着细胞的代谢命运。衰老免疫细胞往往伴随严重的线粒体功能障碍，通过外源性线粒体转移补充健康的线粒体，能直接修复靶细胞的氧化磷酸化（oxphos）水平，为免疫细胞的代谢重编程提供底层的能量底座。

3、外泌体（exosomes）是一种纳米级内源性细胞外囊泡，具有优异的生物相容性与跨天然屏障的能力，是介导细胞间通讯的理想靶向递送载体，能够高效转运特定的核酸以调控靶细胞基因表达。然而，目前尚未见将外泌体介导的基因递送与干细胞线粒体转移相结合，通过协同作用实现抗衰老治疗的相关报道。

4、白细胞介素-4（il-4）是一种具有维持组织稳态、免疫耐受和调节局部微环境作用的多效性细胞因子。il-4能够驱动巨噬细胞从促炎状态向抗炎修复型m2型转变，有效抑制tnf-α、il-1β等经典促炎基因的表达。然而，直接游离注射重组il-4蛋白或il-4 mrna，其在血液中的半衰期很短，极易被降解，且大剂量全身给药会引发严重的脱靶效应和系统性过敏反应。因此，亟需开发一种能够实现il-4 mrna和功能性线粒体协同靶向递送的新型纳米平台。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种外泌体-线粒体偶联递送系统。

2、本发明还要解决的技术问题是提供一种外泌体-线粒体偶联递送系统的制备方法。

3、本发明最后要解决的技术问题是提供一种外泌体-线粒体偶联递送系统在制备抑制免疫衰老的产品中的应用。

4、为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

5、本发明第一方面提供了一种外泌体-线粒体偶联递送系统（il4-evs@mito），其包括线粒体（free-mito）和偶联于所述线粒体表面的装载il4 mrna的外泌体（il4-evs）。

6、其中，所述装载il4 mrna的外泌体来源于过表达il4 mrna的供体细胞；和/或，所述线粒体来源于脂肪间充质干细胞；

7、优选地，所述供体细胞为小鼠肺泡巨噬细胞mh-s。

8、其中，在所述外泌体-线粒体偶联递送系统中，所述线粒体的总蛋白质质量与所述装载il4 mrna的外泌体的总蛋白质质量之比为1 : (1 ~ 4)。

9、在一些实施例中，在所述外泌体-线粒体偶联递送系统中，所述线粒体的总蛋白质质量与所述装载il4 mrna的外泌体的总蛋白质质量之比为1:1。

10、其中，所述线粒体和所述装载il4 mrna的外泌体之间通过点击化学方式进行偶联。

11、其中，所述装载il4 mrna的外泌体表面修饰有四嗪基团；所述线粒体表面修饰有反式环辛烯基团（tco）；通过所述四嗪基团和所述反式环辛烯基团之间的点击化学反应，实现所述装载il4 mrna的外泌体和所述线粒体的偶联。

12、其中，表面修饰有四嗪基团的装载il4 mrna的外泌体的制备方法包括如下步骤：

13、步骤1，构建过表达il4 mrna的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s；

14、步骤2，将步骤1构建的过表达il4 mrna的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s依次与ac4mannaz（n-叠氮乙酰基甘露糖胺-四酰基化，一种含叠氮基的代谢糖蛋白标记试剂）、tz-dbco（四嗪-二苯并环辛炔，一种结合了二苯并环辛炔（dbco）与四嗪（tz）基团的生物正交反应试剂）在培养基中共培养，收集细胞培养上清液，差速离心，即得；

15、优选地，步骤1中，所述的过表达il4 mrna的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s通过将il4mrna过表达质粒导入小鼠肺泡巨噬细胞mh-s的方式构建；

16、优选地，步骤2中，所述差速离心，其方法包括：将所述细胞培养上清液在0 ~ 4℃下1000 ~ 2500×g离心30 ~ 60 min，收集上清，在0 ~ 4℃下10000 ~ 15000×g离心30 ~60 min，收集上清，在0 ~ 4℃下120000 ~ 180000×g离心1 ~ 2 h，收集沉淀，即得所述的表面修饰有四嗪基团的装载il4 mrna的外泌体；和/或，所述ac4mannaz在所述培养基中的浓度为50 ~ 100 μm，所述tz-dbco在所述培养基中的浓度为50 ~ 100 μm。

17、在一些实施例中，步骤2中，所述差速离心，其方法包括：将所述细胞培养上清液在0 ~ 4℃下1000×g离心30 min，收集上清，在0 ~ 4℃下10000×g离心30 min，收集上清，在0 ~ 4℃下150000×g离心1.5 h，收集沉淀，即得所述的表面修饰有四嗪基团的装载il4mrna的外泌体；和/或，所述ac4mannaz在所述培养基中的浓度为50 μm，所述tz-dbco在所述培养基中的浓度为50 μm。

18、在一些实施例中，步骤2中，所述的将步骤1构建的过表达il4 mrna的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s依次与ac4mannaz、tz-dbco在培养基中共培养，具体方法包括：将所述过表达il4 mrna的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s与ac4mannaz在培养基中共培养2 ~ 4天，得叠氮基修饰的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s，将所述的叠氮基修饰的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s与tz-dbco在培养基中共培养24 ~ 48 h，期间每隔4 ~ 8 h更换一次新鲜的含tz-dbco的培养基。

19、在一些实施例中，步骤2中，所述的将步骤1构建的过表达il4 mrna的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s依次与ac4mannaz、tz-dbco在培养基中共培养，具体方法包括：将所述过表达il4 mrna的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s与ac4mannaz在培养基中共培养3天，得叠氮基修饰的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s，将所述的叠氮基修饰的小鼠肺泡巨噬细胞mh-s与tz-dbco在培养基中共培养24 h，期间每隔6 h更换一次新鲜的含tz-dbco的培养基。

20、在一些实施例中，步骤2中，所述培养基为rpmi-1640完全培养基。

21、在一些实施例中，il4的氨基酸序列如seq id no: 1所示。

22、其中，表面修饰有反式环辛烯基团的线粒体的制备方法包括：

23、从脂肪间充质干细胞中分离获得线粒体，将所述线粒体在tco-nhs（反式环辛烯-琥珀酰亚胺酯）溶液中孵育，即得。

24、优选地，所述孵育，其条件为：温度为0 ~ 4℃，时间为30 ~ 60 min；所述tco-nhs溶液，其浓度为50 ~ 100 μm，溶剂为二甲基亚砜（dmso）。

25、在一些实施例中，所述孵育，其条件为：温度为0 ~ 4℃，时间为30 min；所述tco-nhs溶液的浓度为50 μm。

26、从脂肪间充质干细胞中分离获得线粒体的方法可以按照市面上售卖的线粒体分离试剂盒说明书操作进行。

27、其中，所述外泌体-线粒体偶联递送系统的粒径为100 ~ 150 nm，zeta电位为-20~ -10 mv。

28、本发明第二方面提供了所述的外泌体-线粒体偶联递送系统的制备方法，包括如下方法：

29、将表面修饰有四嗪基团的装载il4 mrna的外泌体和表面修饰有反式环辛烯基团的线粒体加入反应介质中，孵育，即得；

30、优选地，所述孵育，其条件为：温度为0 ~ 4℃，时间为30 ~ 60 min；所述反应介质为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的ph为7.0 ~ 7.6，渗透压为250 ~ 350 mosm/kg。

31、在一些实施例中，所述孵育，其条件为：温度为0 ~ 4℃，时间为30 min；所述反应介质为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7.2 ~ 7.4，渗透压为280 ~ 320 mosm/kg。

32、在一些实施例中，所述反应介质为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7.2~ 7.4，浓度为0.01 m。

33、本发明的il4-evs@mito的制备流程示意图如图1所示。

34、本发明第三方面提供了所述的外泌体-线粒体偶联递送系统在制备抑制免疫衰老的产品中的应用。

35、其中，所述产品为药品；所述的免疫衰老为病毒诱导的免疫衰老；优选地，所述病毒为流感病毒；进一步优选地，所述病毒为甲型流感病毒。

36、本发明提供了一种外泌体-线粒体偶联递送系统，以实现抗炎il4 mrna与功能性线粒体的协同靶向递送，用于抗衰老治疗。制备的il4-evs@mito经细胞内化后，在胞质内启动双重干预机制：外泌体释放的il4 mrna翻译出il4蛋白，激活下游stat6信号通路，抑制促炎基因转录，降低衰老相关分泌表型（sasp）水平；偶联的外源性健康线粒体同步释放并与宿主细胞内残缺的线粒体网络发生物理融合与功能互补，恢复氧化磷酸化水平。

37、外泌体-线粒体偶联递送系统被衰老细胞摄取后，外泌体携带的il4 mrna在受体细胞内翻译表达il4蛋白，发挥抗炎作用；同时偶联的功能性线粒体恢复受体细胞的线粒体功能障碍，实现能量代谢重编程。外泌体-线粒体偶联递送系统能够降低促炎因子tnf-α、il-6的表达，升高抑炎因子il-4、il-10的表达。该递送系统能够恢复线粒体膜电位、提高atp水平、恢复线粒体呼吸复合体（i-v）基因表达及线粒体呼吸功能。

38、有益效果：

39、本发明构建的外泌体-线粒体偶联递送系统无需复杂的人工靶向修饰，凭借外泌体天然的炎症微环境归巢能力，即可实现衰老细胞的高效摄取与溶酶体逃逸，在胞质内启动基因治疗与细胞器治疗的协同级联反应：外泌体释放的il4 mrna翻译产生il4蛋白，激活stat6信号通路抑制促炎基因转录、降低衰老相关分泌表型（sasp）水平；偶联的功能性线粒体同步释放并与宿主受损线粒体网络融合，恢复氧化磷酸化（oxphos）水平、重建细胞能量代谢中枢。本发明可实现高效、靶向地逆转iav诱导的免疫衰老、恢复肺泡巨噬细胞的吞噬清除功能、减轻肺组织炎性损伤及纤维化病理改变，且对正常组织无明显毒副作用，因而具有开发成为抗衰老和防治衰老相关炎症性疾病的药物及技术的潜力。具体表现如下：

40、（1）il4-evs@mito具有稳定的结构和良好的尺寸均一性，粒径约100 ~ 150 nm。

41、（2）il4-evs@mito能够被衰老细胞高效摄取，并实现溶酶体逃逸，将功能性线粒体完整释放至胞质。

42、（3）il4-evs@mito能够降低促炎因子表达、升高抑炎因子表达，抑制iav（甲型流感病毒）诱导的细胞衰老和炎症反应。

43、（4）il4-evs@mito能够恢复线粒体膜电位、atp水平、线粒体呼吸复合体表达及线粒体呼吸功能。

44、（5）il4-evs@mito具有优异的肺部靶向性和滞留能力，能够有效缓解iav感染引起的肺衰老。