sgRNA切割效率预测及sgRNA设计方法

本发明涉及基因编辑，尤其涉及一种sgrna（single guide rna，单链引导rna）切割效率预测及sgrna设计方法。

背景技术：

1、crispr-cas9基因编辑技术因其高效、便捷和低成本的特点，在生物医学研究、基因治疗和合成生物学等领域广泛应用。该技术的核心是利用sgrna将cas9蛋白引导至基因组的特定位置进行dna切割。cas9是一种rna引导的dna内切酶，在sgrna的引导下对targetdna进行定点切割。然而，sgrna的切割效率存在巨大差异，设计一个高效的sgrna是成功进行基因编辑的关键前提。

2、目前，sgrna的设计主要依赖于经验规则或已有的计算预测工具。这些工具大多是基于在哺乳动物细胞中产生的大规模筛选数据训练而成。然而，这些现有工具存在明显缺陷：

3、预测精度有限：现有工具的预测准确性、精度和召回率等指标仍有较大提升空间，无法完全满足高精度基因编辑的需求。

4、跨物种适用性差：由于训练数据主要来源于哺乳动物，这些工具在应用于基因组结构和亚细胞环境与哺乳动物存在显著差异的微生物（如大肠杆菌、酵母等）时，预测效果急剧下降，导致在微生物基因编辑和合成生物学研究中难以有效指导sgrna设计。

5、设计门槛高：科研人员需要具备一定的生物信息学知识才能有效使用这些工具，且难以实现对特定基因序列进行自动化、高通量的sgrna筛选和优化。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供一种sgrna切割效率预测及sgrna设计方法。

2、本发明提供一种sgrna切割效率预测方法，包括：

3、将待预测sgrna与待预测sgrna的targetdna进行配对对齐，形成配对序列；

4、根据所述配对序列的每个位置处sgrna的碱基与targetdna的碱基的配对组合进行独热编码，得到二维矩阵；

5、将所述二维矩阵输入深度卷积神经网络，得到所述深度卷积神经网络输出的所述待预测sgrna的切割效率分值；

6、其中，所述深度卷积神经网络通过训练集进行训练得到，所述训练集包括sgrna样本与所述sgrna样本的targetdna的配对序列，以及标记是否切割的标签。

7、根据本发明提供的一种sgrna切割效率预测方法，sgrna样本与所述sgrna样本的targetdna的配对序列包括从开源文献中收集的配对序列，以及从微生物中测定的配对序列。

8、根据本发明提供的一种sgrna切割效率预测方法，所述微生物包括大肠杆菌和解脂酵母。

9、根据本发明提供的一种sgrna切割效率预测方法，所述标签的获取步骤包括：

10、对所述sgrna样本与所述sgrna样本的targetdna的配对序列进行高通量测序检测，得到切割计数；

11、在所述切割计数大于或等于预设阈值的情况下，将所述配对序列标记为切割标签，作为正样本；

12、在所述切割计数小于所述预设阈值的情况下，将所述配对序列标记为非切割标签，作为负样本。

13、根据本发明提供的一种sgrna切割效率预测方法，所述标签的获取还步骤包括：

14、遍历所述sgrna样本的targetdna所在的基因序列，将长度为预设长度且未标记为切割标签的序列片段与所述sgrna样本配对对齐，形成配对序列，标记为非切割标签，作为负样本。

15、根据本发明提供的一种sgrna切割效率预测方法，根据所述配对序列的每个位置处sgrna的碱基与targetdna的碱基的配对组合进行独热编码，得到二维矩阵，包括：

16、确定所述sgrna中的碱基与所述targetdna中的碱基之间的所有配对组合；

17、根据所述编码长度为所述配对序列的每个位置构建编码向量，所述编码向量中每个位置处的配对组合对应的元素为1，其他元素为0，所述编码向量中的元素与所有配对组合一一对应；

18、根据所述配对序列中所有位置的编码向量，构建二维矩阵。

19、根据本发明提供的一种sgrna切割效率预测方法，所述深度卷积神经网络采用resnet50架构。

20、根据本发明提供的一种sgrna切割效率预测方法，所述深度卷积神经网络的训练步骤包括：

21、将所述sgrna样本的切割效率分值与对应的标签输入损失函数中，计算损失；

22、根据所述损失通过反向传播算法和优化器更新所述深度卷积神经网络的权重参数。

23、根据本发明提供的一种sgrna切割效率预测方法，在所述深度卷积神经网络训练之后，还包括：

24、使用独立的测试集评估所述深度卷积神经网络的性能。

25、本发明还提供一种sgrna设计方法，包括：

26、通过序列比对算法检索出待编辑基因序列上的靶点；

27、为各靶点生成多个sgrna，将各sgrna与所述靶点上的targetdna进行配对对齐，形成配对序列；

28、基于上述任一所述的sgrna切割效率预测方法，根据各sgrna对应的配对序列，得到各sgrna的切割效率分值；

29、根据各sgrna的切割效率分值对所述sgrna进行排序，根据排序结果选择最优sgrna。

30、本发明提供的sgrna切割效率预测及sgrna设计方法，具有如下有益效果：

31、预测性能卓越：本发明采用基于resnet50的深度神经网络架构，能够从sgrna与targetdna的配对序列中自动学习复杂的序列特征和相互作用模式。与现有工具相比，本方法在准确率(accuracy)、精度(precision)、召回率(recall)、auroc和auprc等多个关键评估指标上均实现了全面领先，各项指标逼近理论极限值1，显著提升了预测的可靠性。

32、微生物适配性：本发明首次引入了在微生物（大肠杆菌和解脂酵母）中通过实验测定并测序获得的sgrna切割数据集进行模型训练和优化。这一创新性地解决了现有工具在微生物领域“水土不服”的问题，使其在微生物基因编辑中同样具备优秀可靠的预测能力，填补了该领域的技术空白。

33、实现自动化智能设计：本发明可集成于自动化流程中，能够对目标基因序列进行全序列扫描，自动检索所有潜在靶点并迭代评估所有可能的sgrna设计。这实现了对科研人员的“零理论门槛”要求，极大地提高了sgrna设计的效率和全面性，加速了科研与产业进程。

34、应用前景广阔：本方法不仅适用于基础研究，更能为crispr药物开发、基因编辑疗法和工业微生物改造等产业方向提供强有力的核心工具，具有极高的科研与商业价值。

1.一种sgrna切割效率预测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的sgrna切割效率预测方法，其特征在于，sgrna样本与所述sgrna样本的targetdna的配对序列包括从开源文献中收集的配对序列，以及从微生物中测定的配对序列。

3.根据权利要求2所述的sgrna切割效率预测方法，其特征在于，所述微生物包括大肠杆菌和解脂酵母。

4.根据权利要求1所述的sgrna切割效率预测方法，其特征在于，所述标签的获取步骤包括：

5.根据权利要求4所述的sgrna切割效率预测方法，其特征在于，所述标签的获取还步骤包括：

6.根据权利要求1所述的sgrna切割效率预测方法，其特征在于，根据所述配对序列的每个位置处sgrna的碱基与targetdna的碱基的配对组合进行独热编码，得到二维矩阵，包括：

7.根据权利要求1所述的sgrna切割效率预测方法，其特征在于，所述深度卷积神经网络采用resnet50架构。

8.根据权利要求1所述的sgrna切割效率预测方法，其特征在于，所述深度卷积神经网络的训练步骤包括：

9.根据权利要求1所述的sgrna切割效率预测方法，其特征在于，在所述深度卷积神经网络训练之后，还包括：

10.一种sgrna设计方法，其特征在于，包括：