一种用于3D生物打印的仿生生物墨水及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料与组织工程，具体涉及一种用于3d生物打印的、能够实现时空编程化梯度分化的仿生生物墨水及其制备方法与应用。

背景技术：

1、组织工程旨在修复、再生受损的组织与器官，其中，构建具有复杂结构和功能的组织，尤其是包含多种细胞类型并呈梯度分布的复合组织，是当前面临的重大挑战。传统的生物墨水通常功能单一，难以在打印后精确调控不同区域细胞的命运，导致再生组织与原生组织的结构与功能不匹配。

2、现有的梯度分化策略多依赖于多材料交替打印以及后期灌注生长因子，存在界面结合弱、信号释放不可控、时空精度差等问题。因此，开发一种能够将多种分化信号预先封装、并能通过外部刺激进行精准时空编程释放的智能生物墨水，对于推动复杂组织工程的发展具有至关重要的意义。

技术实现思路

1、发明目的

2、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于3d生物打印的仿生生物墨水，其能够通过构建可响应多种外部刺激的信号释放库，实现生物活性物质的时空编程化精准释放，从而有效构建具有仿生梯度的复杂组织。

3、本发明的另一目的在于提供上述仿生生物墨水的制备方法，该方法以目标组织的仿生分化梯度图谱为设计依据，通过精准控制功能材料的封装、分散与多通道封装工艺，在温和条件下实现墨水体系的高稳定性、高均一性及良好的生物相容性，工艺稳定且重现性好。

4、技术方案

5、第一方面，本发明提供一种用于3d生物打印的仿生生物墨水。

6、所述仿生生物墨水为一种复合生物墨水体系，由至少两种功能各异的子墨水组成。每一种所述子墨水均包含：

7、a) 一种生物相容性水凝胶基质；

8、b) 一种刺激响应性功能材料。

9、其中，所述刺激响应性功能材料封装有至少一种生物活性物质，且其壳层材料被设计为能够在接收预设的外部非侵入性物理刺激后发生结构变化，从而释放所封装的生物活性物质。

10、关键在于，所述至少两种子墨水中所包含的刺激响应性功能材料，其壳层材料分别具有不同的物理和化学结构，以分别对应于不同类型的外部非侵入性物理刺激而发生结构变化。

11、优选地，所述仿生生物墨水还包括独立配置的细胞负载组分。所述细胞负载组分为包含种子细胞的细胞悬液；所述种子细胞优选为纯度不低于90%的骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞。在使用时，所述种子细胞与所述子墨水通过多通道生物打印机实现同步挤出与区域共分布，其在最终支架内的密度优选为1×105 cells/ml 至 1×107 cells/ml。

12、为实现对生物活性物质的精准、特异性释放，各类功能材料的壳层材料需针对性设计：

13、对于响应光刺激的刺激响应性功能材料，其壳层材料为接枝有光裂解化学键的生物相容性共聚物，例如聚乙二醇甲基丙烯酸酯-聚己内酯共聚物。所述光裂解化学键选自邻硝基苄酯基。该光裂解化学键的接枝率优选为10%-30%。

14、对于响应超声波刺激的刺激响应性功能材料，其壳层材料为经超声响应型交联剂交联的生物相容性聚电解质。所述超声响应型交联剂选自二硫代双丙烯酰胺、胱胺二丙烯酸酯中的至少一种。所述聚电解质选自壳聚糖和海藻酸钠中的至少一种。所述交联剂的质量占比优选为2%-8%。

15、对于响应温度变化的刺激响应性功能材料，其壳层材料为具有确定低临界溶解温度的温敏性共聚物，例如聚(n-异丙基丙烯酰胺)-聚乙二醇共聚物，其低临界溶解温度优选为32℃-37℃。

16、对于响应磁场刺激的刺激响应性功能材料，其壳层材料为具有确定高临界溶解温度的温敏性共聚物，且分散有超顺磁性fe3o4纳米颗粒。所述共聚物为聚（丙烯酰胺-co-丙烯酸钠）。所述纳米颗粒的平均粒径优选为10-50nm，质量占比为5%-20%，且所述壳层材料的高临界溶解温度优选为40℃-45℃。

17、所述生物活性物质可选自血管内皮生长因子vegf、神经生长因子ngf、转化生长因子tgf-β1和tgf-β3、生长分化因子gdf-5中的至少一种。

18、在墨水性能控制上，每一种子墨水中，所述刺激响应性功能材料的质量浓度优选为0.5 mg/ml 至 20 mg/ml；且不同子墨水中功能材料的质量浓度比基于目标组织的仿生分化梯度图谱设定，比例范围优选为1:10至10:1。所述功能材料的平均粒径优选为0.2 μm至 20 μm，在对应子墨水中的分散变异系数不大于15%。

19、为进一步保障应用过程中的打印精度与过程监控，至少一种子墨水中可添加荧光标记微球。所述荧光标记微球的平均粒径优选为0.1-1μm，质量浓度为0.01-0.1 mg/ml，由二氧化硅制成。

20、第二方面，本发明还提供一种制备上述仿生生物墨水的方法。

21、所述方法以目标组织的仿生分化梯度图谱为设计依据，包括以下步骤：

22、s1. 根据所述仿生分化梯度图谱，确定所需子墨水的种类、各子墨水中功能材料应负载的生物活性物质种类、目标质量浓度及子墨水的组合比例。

23、s2. 针对每一种子墨水，依据其目标响应类型和所负载生物活性物质的特性，选择适配的封装工艺，分别制备负载有相应生物活性物质的刺激响应性功能材料。

24、s3. 配制水凝胶基质前驱体溶液：将通过市购获得的生物相容性水凝胶材料溶解于ph值为7.0-7.4的缓冲溶液中，调节其质量浓度为5%-10%，得到相应的水凝胶基质前驱体溶液。

25、s4. 将每一种制备好的刺激响应性功能材料，按s1确定的目标质量浓度，分别加入至s3配制的相应水凝胶基质前驱体溶液中，在功率为50-100w条件下超声分散5-10分钟，得到至少两种分散均匀的子墨水。

26、s5. 将所述至少两种子墨水按s1确定的组合比例，分别灌装并密封于多通道复合容器的独立通道中，于2℃-8℃、避光条件下保存，形成所述仿生生物墨水。

27、其中，步骤s2所述的封装工艺可根据需要具体优化：

28、制备光响应性材料时，可通过自由基共聚合接枝光裂解基团，光响应单体与基础聚合物单体的摩尔比优选为1:5至1:20，引发剂用量为单体总质量的0.5%-2%。

29、制备超声响应性材料时，将交联剂加入浓度为0.5%-2%（w/v）的聚电解质溶液中进行交联，完成后经洗涤和冷冻干燥。

30、制备温度变化响应性材料时，将温敏性共聚物溶解形成1%-5%的溶液，加入生物活性物质后，通过乳化-溶剂蒸发法和微流控聚焦法中的一种形成微球，控制亲水与疏水链段质量比为1:9至3:7。

31、制备磁场响应性材料时，需将fe3o4纳米颗粒在100w-300w功率下超声分散10-30分钟，均匀分散于壳层聚合物溶液中。

32、本发明的有益效果之一通过构建包含至少两种响应不同刺激的功能性子墨水的复合体系，保障了分化信号的可编程性与释放特异性，解决了传统单一材料墨水无法实现复杂时空信号编码的难题。

33、本发明的有益效果之二通过对光、超声、温度、磁场等不同响应单元壳层材料与关键组分的精确设计与参数限定，改善了各单元刺激响应行为的可靠性、特异性及生物相容性，表现出高度的技术可控性。

34、本发明的有益效果之三通过规定制备工艺中单体比例、引发剂用量、分散参数及储存条件，提升了功能单元及最终墨水产品批次间的均一性与稳定性，形成了可重复、标准化的制备流程。

35、本发明的有益效果之四通过在应用方法中量化区域排布精度和时空程序参数，实现了对组织构建过程从宏观结构到微观信号释放的精准数字化控制。

36、本发明的有益效果之五通过集成独立细胞负载组分及高稳定性荧光标记微球等辅助单元，保护了细胞活性，提高了打印过程的在线校准精度与整体方案的成功率。

37、最终，本发明将材料化学、3d打印与外部物理场调控技术深度融合，实现了从仿生设计图到功能化组织的一站式构建，为再生医学领域复杂组织缺损的修复提供了全新的解决方案。