3D生物打印的细胞引导水凝胶补片及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学工程与组织工程再生材料，具体涉及一种3d生物打印的细胞引导水凝胶补片及其制备方法和应用。

背景技术：

1、腹壁是一种复杂的多层结构，其力学完整性对维持腹腔脏器的正常生理功能至关重要。常见的腹部外科手术，如腹正中线剖腹术，需切开白线这一重要的承重结缔组织，切口愈合不良可导致切口疝。切口疝是腹部手术后最常见、最严重的并发症之一，据报道其发病率高达30%。切口疝很少自行愈合，通常需要再次手术干预，造成患者显著发病，并给医疗卫生系统带来巨大的经济负担。

2、目前，疝修补的临床金标准依赖植入外科补片，这是一种以反应性方式解决力学缺陷，而不恢复天然组织功能的被动策略。最常见的材料是聚丙烯等合成聚合物网片，虽能提供较强的力学支撑，但作为永久性异物，常导致慢性炎症、异物反应、组织粘连和高感染风险等一系列并发症。为改善生物相容性，临床引入了源自脱细胞动物组织的生物补片，但大规模临床数据表明，这类昂贵的材料并非理想方案，存在降解不一致、免疫反应以及疝复发率高等问题，其复发率甚至可能超过合成网片。针对上述材料失效问题，亟须一类能够超越单纯力学增强或被动替代、主动引导功能性承重组织再生的新型生物材料，以促进术后早期功能修复。

3、水凝胶基生物材料因具有与天然细胞外基质相似的三维网络结构，已成为这一主动再生策略的有前景平台。现有研究主要集中在增强水凝胶自身的材料性能上，发展出兼具优异力学强度和组织黏附性的“坚韧黏合剂”水凝胶以及具有抗菌功能的水凝胶。然而，尽管材料化学取得了显著进步，一个根本性局限仍然存在：这些水凝胶本质上均为各向同性材料，缺乏克服无序瘢痕形成的默认生物学过程所需的导向性结构线索；它们虽能支持愈合，却无法主动引导新生胶原纤维沿特定方向排列，而后者正是再生天然白线高度组织化的承重结构所必需。

4、针对上述各向同性问题，三维（3d）生物打印技术凭借其对空间结构的精确可控能力，为构建具有取向结构的组织工程支架提供了可能。然而，现有基于3d生物打印的水凝胶补片仍存在明显不足：一方面，多数可打印水凝胶依赖紫外光照射或光引发剂引发聚合交联，光引发剂及其自由基副产物具有潜在的细胞毒性，难以实现细胞及生物活性因子的原位负载与存活；另一方面，已有的取向结构支架大多仅停留在构建平行排列的宏观形貌层面，难以实现功能性组织再生。

5、因此，亟需开发一种能够将无序瘢痕重塑为高度组织化承重结构的新型材料，从而主动引导新生胶原纤维沿功能方向定向排列，实现白线组织的功能性再生。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是：提供一种3d生物打印的细胞引导水凝胶补片，利用其各向异性取向结构主动引导细胞外基质重塑，促进新生胶原纤维的各向异性沉积，从而实现对腹部切口的功能性修复并降低切口疝风险。

2、本发明所采用的技术方案是：

3、本发明提供了一种3d生物打印的细胞引导水凝胶补片，所述细胞引导水凝胶补片由明胶与双醛纤维素通过席夫碱反应交联形成水凝胶网络，并在交联过程中原位负载成纤维细胞和tgf-β1，再经3d生物打印工艺赋予其各向异性的微观结构；

4、明胶与双醛纤维素的质量比为(10~30)：1。

5、优选地，明胶与双醛纤维素的质量比为40：3。

6、本发明第二方面提供了一种所述细胞引导水凝胶补片的制备方法，步骤如下：

7、以微晶纤维素为原料，经高碘酸盐选择性氧化制得双醛纤维素；

8、以明胶为基质骨架和氨基供体、双醛纤维素为醛基交联剂，与胚胎成纤维细胞和tgf-β1共混，利用明胶氨基与双醛纤维素醛基之间的席夫碱反应生成动态亚胺键构建交联网络，获得生物墨水；

9、采用3d生物打印将所述生物墨水打印成具有平行排列的各向异性取向通道结构的补片，得到所述细胞引导水凝胶补片。

10、优选地，微晶纤维素与高碘酸盐的质量比为1:(1～2)。

11、优选地，高碘酸盐选择高碘酸钠和高碘酸钾中的任意一种。

12、优选地，所述生物墨水中，成纤维细胞的浓度为1×105个/ml~1×107个/ml；

13、tgf-β1的浓度为1ng/ml~100ng/ml。

14、优选地，3d生物打印时的参数为：

15、打印层高0.2mm，打印速度8mm/s，相邻丝材之间的间距为600μm。

16、优选地，选择性氧化反应需要加入乙二醇终止反应。

17、优选地，选择性氧化在室温避光条件下进行，反应时间为48h~96h。

18、本发明第三方面所述细胞引导水凝胶补片的应用，所述细胞引导水凝胶补片用于制备促进切口修复的医用材料。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

20、本发明提供了一种3d生物打印的细胞引导水凝胶补片，所述细胞引导水凝胶补片由明胶与双醛纤维素通过席夫碱反应交联形成水凝胶网络，并在交联过程中原位负载成纤维细胞和tgf-β1，再经3d生物打印工艺赋予其各向异性的微观结构。本发明采用明胶氨基与双醛纤维素醛基之间的席夫碱反应构建水凝胶网络，该温和的交联条件避免了光引发剂及其自由基副产物的细胞毒性，使得成纤维细胞和tgf-β1能够在交联过程中原位负载并保持高活性，从而从材料化学层面解决了现有可打印水凝胶生物相容性不足的瓶颈，为细胞和生长因子的功能发挥提供了适宜的微环境。其次，本发明借助3d生物打印技术赋予水凝胶平行排列的各向异性微观通道结构。该取向结构能够在体内主动引导宿主成纤维细胞沿特定方向浸润和迁移，并诱导i型胶原沿垂直于切口轴的方向各向异性沉积，将愈合过程中默认的无序瘢痕重塑为高度组织化的承重结构，实现了对功能性承重组织再生的主动引导。

21、此外，本发明通过在水凝胶中原位负载tgf-β1，有效促进了负载及宿主来源的成纤维细胞增殖、迁移和细胞外基质蛋白合成，增强了肌成纤维细胞表型转化和胶原分泌能力，与各向异性结构协同作用，加速了功能性基质的形成。体内大鼠腹壁切口模型证实，垂直取向的补片使修复组织的抗拉强度和爆破压力较未治疗组和各向同性对照组提高两倍以上，且术后第9天的机械强度即已超过未治疗组21天内的最大值，显著加速了机械功能的恢复过程，这表明本发明从结构设计和生物活性因子递送两个层面协同解决了传统补片力学增强不足和愈合缓慢的问题。

22、综上所述，本发明不仅克服了现有合成聚合物网片和生物补片因异物性、降解不一致和免疫反应导致的疝复发率高、并发症多的临床应用困境，更通过各向异性结构引导与tgf-β1生物学调控的有机结合，将腹壁修复从单纯的力学替代转变为功能性组织再生，有效降低了切口疝的发生风险，为功能性腹壁修复提供了安全、高效且具有转化前景的新型再生医学策略。

1.一种3d生物打印的细胞引导水凝胶补片，其特征在于，所述细胞引导水凝胶补片由明胶与双醛纤维素通过席夫碱反应交联形成水凝胶网络，并在交联过程中原位负载成纤维细胞和tgf-β1，再经3d生物打印工艺赋予其各向异性的微观结构；

2.根据权利要求1所述的细胞引导水凝胶补片，其特征在于，明胶与双醛纤维素的质量比为40：3。

3.根据权利要求1所述细胞引导水凝胶补片的制备方法，其特征在于，步骤如下：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，微晶纤维素与高碘酸盐的质量比为1:(1～2)。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，高碘酸盐选择高碘酸钠和高碘酸钾中的任意一种。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述生物墨水中，成纤维细胞的浓度为1×105个/ml~1×107个/ml；

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，3d生物打印时的参数为：

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，选择性氧化反应需要加入乙二醇终止反应。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，选择性氧化在室温避光条件下进行，反应时间为48h~96h。

10.根据权利要求1所述细胞引导水凝胶补片的应用，其特征在于，所述细胞引导水凝胶补片用于制备促进切口修复的医用材料。