一种花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物及应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物及应用。

背景技术：

1、花叶海棠（malus transitoria(batalin) c.k.schneid.），属于被子植物门双子叶植物纲蔷薇科苹果属植物，目前主要分布于我国的四川西部藏区、西藏东南部和青海东部的北山林区、玛珂河林区，是我国横断山脉地区特有种，是极其珍贵的植物种质资源。根据《中国植物志》记载花叶海棠为灌木至小乔木，高可达8米，枝叶呈细长圆柱形，花期5月，果期9月，花序近伞形，具花3-6朵。果实成熟后，呈现为小球状。

2、花叶海棠具有较高的经济价值和药用价值，在青海藏族聚集的地区花叶海棠的叶片常被制为藏茶饮用；花叶海棠的果实常被用来作为保健型饮料、果酱、罐头和制药的优质原料。化学成分研究发现花叶海棠果实和叶片都具有多种活性物质，包括多酚、类黄酮、氨基酸、维生素等营养成分，这些生物活性成分赋予了花叶海棠抗氧化、抗炎、降血压等功效。

3、目前针对花叶海棠活性物的开发多聚焦于传统植物活性成分提取技术，如发明专利cn102701938a提供了一种在变叶海棠和花叶海棠中提取纯化根皮素的方法，通过水-乙酸乙酯系统萃取和硅胶柱洗脱技术，分离得到根皮素；

4、发明专利cn117959223a公开了一种含有俄色果提取物的护肤品及其制备方法，利用的俄色果提取物由是处理过的俄色果果肉、四氧化三铁、浸提液（水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的至少一种）混合后，在超声下提取后除去杂质，收集得到；

5、发明专利cn108850331a一种花叶海棠茶膏及其制备工艺，涉及花叶海棠叶的深加工，采用水提法和醇提法相结合的方式，将花叶海棠叶中溶解性大的有效成分溶出；

6、发明专利cn119081987a一种苹果纳米囊泡及其制备方法和应用，采集开花后14～60d的苹果幼果为原料，采取直接离心法或蔗糖密度梯度离心法，提取获得纳米囊泡。

7、这些方法虽然可以获取花叶海棠中的天然活性成分，但其弊端也日益凸显，如来源强依赖于植物生长，提取物易存在重金属、农药残留，提取溶剂会对环境造成污染等问题。

8、因此，开发一种不依赖天然植株、不受生长周期限制、能高效获得花叶海棠活性成分的技术，对于保护植物种质资源、拓展高端护肤原料具有重要意义。

9、植物细胞工程是以植物细胞全能性为基础，通过组织培养、遗传改造等技术手段，在细胞层面进行繁殖与品种改良的生物工程技术，分为上游工程（细胞培养、遗传操作、保藏）与下游工程（规模化生产）两大阶段。

10、目前还没有针对花叶海棠植物细胞工程的技术报道，以及花叶海棠植物细胞工程产物在化妆品中应用的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物及应用。本发明通过组织培养技术，将花叶海棠的外植体脱分化为愈伤组织，再利用植物细胞培养工程大量繁殖植物细胞，在培养过程中，植物细胞通过自身代谢将培养基中的基础营养物质转换为生物活性物质如类黄酮、多酚类物质；该技术可以不受花叶海棠的生长限制，在生产过程中不会存在重金属、农药残留的风险。

2、本发明的技术方案：

3、一种花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物，制备方法步骤如下：

4、s1、花叶海棠愈伤组织诱导和培养：

5、将花叶海棠外植体进行表面消毒后，接种于诱导固体培养基上进行暗培养，诱导出愈伤组织；再将诱导出的愈伤组织转接至增殖固体培养基上进行继代增殖培养；

6、所述诱导固体培养基包括b5基础培养基，30 g/l蔗糖、0.01～0.05 mg/l 6-ba和1.0～2.0 mg/l 2,4-d；

7、所述增殖固体培养基包括b5基础培养基，30 g/l蔗糖、0.01～0.1 mg/l 6-ba、0.5～2.0 mg/l 2,4-d；

8、s2、花叶海棠悬浮细胞培养：

9、将步骤s1增殖培养继代1～3次得到的愈伤组织切割成小块，按3～10% (w/v)接种量接种于液体培养基中进行振荡培养，获得花叶海棠愈伤组织细胞培养物；

10、所述液体培养基包括b5基础培养基， 30 g/l蔗糖、0～2.0 mg/l 6-ba、0～2.0mg/l 2,4-d。

11、s3、提取物制备：

12、将步骤s2得到的花叶海棠愈伤组织细胞培养物进行高压均质破碎、离心、过滤处理，或不高压均质直接离心过滤处理，得到花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物。

13、前述的花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物中，步骤s1所述的表面消毒，具体内容如下：花叶海棠外植体经流水冲洗后，依次用75%乙醇消毒30 s、混合处理剂处理8min，最后用无菌水冲洗干净；所述混合处理剂为11%的次氯酸钠水溶液和1%的吐温20。

14、前述的花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物中，步骤s2中，所述愈伤组织切割成2-5 mm3的小块；所述振荡培养条件为温度25℃，摇床转速110 rpm，培养7～15天。

15、前述的花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物中，步骤s1中，诱导固体培养基暗培养时间为21 d；增殖固体培养基继代增殖培养时间为21 d。

16、前述的花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物中，步骤s2中，振荡培养时间为7～15 d。

17、前述的花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物中，步骤s3中，高压均质的压力为1000 bar，均质时间为2 min，均质循环次数为5次；离心条件为10000 rpm离心15 min；过滤采用0.22 μm滤膜。

18、一种花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物在制备具有抗氧化作用化妆品中的应用。

19、一种花叶海棠愈伤组织细胞培养物的提取物在制备具有抗炎舒缓功效化妆品中的应用。

20、与现有技术相比，本技术的有益效果为：

21、1、本发明首次成功建立了花叶海棠愈伤组织的诱导、增殖和悬浮细胞培养体系，填补了该领域的技术空白；

22、2、本发明不依赖于天然花叶海棠植株的生长，不受季节、气候、地域限制，可全年、全天候进行工业化生产，有效保护了珍稀植物种质资源，避免了农药污染和重金属超标问题，实现了绿色、可持续的生产方式；

23、3、本发明方法生产周期短（7-15天即可收获一批），通过优化培养基中的激素配比（如6-ba和2,4-d）及培养条件，可显著提高细胞生物量（细胞鲜重）和目标活性产物（总黄酮、总多酚）的积累；

24、实施例数据显示，在最优条件下（实施例1），细胞鲜重可达3.72 g/ml，总黄酮和总多酚含量分别高达47.86 μg/ml和49.38 μg/ml，远高于对比例；

25、4、本发明制备的花叶海棠愈伤组织细胞培养物具有优异的生物活性；实验证明，实施例1对 dpph自由基清除能力的ic50值为50.31 mg/ml，表明具有良好的抗氧化能力；

26、实施例1对vegf/vegfr2和tnf-α/tnfr1结合的抑制率分别达到54.76%和61.35%，表明其能够有效阻断炎症信号通路，具有显著的抗炎舒缓功效。