一种金雀花碱衍生物用于抑制沙门氏菌的新用途

本发明涉及制药领域，尤其涉及一种金雀花碱衍生物用于抑制沙门氏菌的新用途。

背景技术：

1、沙门氏菌（salmonella spp.）是重要的食源性致病菌，导致全球每年数亿人感染及数十万人死亡。抗生素是主要治疗手段，但其广泛使用、误用及环境残留导致耐药性问题日益严峻。当前分离的沙门氏菌普遍呈现多重耐药性，甚至对被视为“最后防线”的黏菌素（polymyxin e）也产生耐药，严重威胁公共卫生安全，亟需开发新型防控策略。

2、沙门氏菌耐药性由耐药基因及其调控因子共同决定。双组份系统（tcs）在此过程中扮演关键角色。典型的tcs由膜上组氨酸激酶（hk）和胞质响应调节蛋白（rr）组成。环境压力下，激活的hk自磷酸化并传递信号至rr，磷酸化的rr通过结合dna调控基因表达以适应胁迫。因此，靶向抑制tcs信号通路是克服耐药性的潜在途径。

3、研究表明，phopq双组份系统中的响应调节蛋白phop是调控沙门氏菌黏菌素耐药的核心因子。其编码基因缺失可使沙门氏菌对黏菌素的最小抑菌浓度（mic）显著下降16倍，凸显phop作为关键药物靶标的潜力。以phop为靶点筛选具有协同抗菌活性的天然小分子抑制剂具有重要应用前景。

4、计算机辅助药物设计（cadd），尤其是基于结构的虚拟筛选，已成为高效发现靶向抗菌化合物的有力工具。通过高通量分子对接预测靶点（如phop）与化合物库的结合亲和力，可快速锁定先导分子。尽管沙门氏菌phoq的完整结构尚未解析，但其同源蛋白phop的晶体结构已在相关菌种（如大肠杆菌）中报道。phop以二聚体形式存在，其n端受体结构域包含保守的α4-β4-α5基序，形成疏水/带电残基界面，介导二聚化及信号传递所需的范德华力和盐桥反应。该界面的高度保守性允许以大肠杆菌phop结构为模板，对沙门氏菌phop进行可靠的同源建模。因此，靶向phop的α4-β4-α5二聚化界面进行虚拟筛选，有望获得高特异性天然抑制剂。

5、金雀花碱（cytisine）是一种天然喹诺里西啶类生物碱，分离自多种豆科植物。金雀花碱及其衍生物具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫、降血糖、神经保护等。

6、本领域的技术人员致力于开发一种抑制沙门氏菌的药物的计算机辅助药物筛选方法，并筛选出一种天然化合物抑制沙门氏菌。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何开发一种抑制沙门氏菌的药物的计算机辅助药物筛选方法，并筛选出一种天然化合物抑制沙门氏菌。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种抑制沙门氏菌的药物的筛选方法，包括以下步骤：

3、步骤1、通过同源建模获得沙门氏菌phop蛋白三维结构；

4、步骤2、构建天然小分子化合物数据库；

5、步骤3、 将步骤1得到的沙门氏菌phop蛋白三维结构作为受体靶标蛋白，使用  步骤2得到的天然小分子化合物数据库作为配体库，使用虚拟筛选软件进行批量分子对接，根据结合能阈值，经过第一次筛选到第一天然小分子化合物；对第一天然小分子化合物进行药物动力学（absorption，distribution，metabolism，excretion and toxicity，admet）性质描述，并制定筛选方向，进行第二次筛选，根据设定的筛选条件，得到第二天然小分子化合物；筛选方向为：选择溶解度、血脑屏障通透性、肝毒性、细胞色素 p450 2d6 酶抑制能力、人类肠道吸收性、血红蛋白结合能力；对通过分子动力学模拟软件对phop蛋白和第二天然小分子化合物的结合稳定性进行评价，经过第三次筛选，得到第三天然化合物；对第三天然化合物靶向结合phop蛋白模式进行评价，经过第四次筛选，得到金雀花碱衍生物zinc02139758；

6、步骤4、分析步骤3得到的金雀花碱衍生物zinc02139758靶向抑制phop蛋白活性及抑菌能力。

7、进一步地，步骤1还包括：使用肺炎克雷伯菌pmra蛋白与dna结合复合物的晶体结构作为模板，利用modeller完成了phop激活态受体结构的同源构建，而phop抑制态受体结构则由alphafold 2完成构建。

8、进一步地，步骤2还包括：通过获取zinc natural products、tcmsp、analyticondiscovery natural derivatives天然产物数据库中的天然小分子化合物信息，对化合物进行结构标准化处理，包括构象异构体、立体异构体等，并统一编号，并计算一系列化合物性质和结构的描述信息，化合物性质和结构的描述信息为分子量、脂水分配系数、极性表面积。

9、进一步地，步骤3中结合能阈值为-8.0kcal/mol。从能量评分到特异性识别在分子对接预筛阶段，-8.0 kcal/mol是公认的分子对接筛选“经验阈值”。该阈值不仅预示着配体与受体间具备优异的空间几何互补性，还通常意味着复合物内部形成了至少两个以上的强氢键或关键的π-π堆积作用。

10、进一步地，步骤3中第二次筛选条件为阿门斯致畸性，根据lipinski五原则，即分子量不超过500 da；候选化合物的油/水分配系数（logp）小于5；候选化合物的氢键受体不超过5个；氢键供体数不超过5个，候选化合物的氢键供体和受体的总数不超过10个；候选化合物的可旋转键数不超过10个。

11、进一步地，步骤4还包括：应用微量热泳动确定金雀花碱衍生物zinc02139758与phop蛋白的结合亲和力；应用rt-qpcr分析金雀花碱衍生物zinc02139758对phop活性的靶向抑制。

12、进一步地，步骤4中分析抑菌能力还包括：沙门氏菌存活率测定；金雀花碱衍生物zinc02139758对沙门氏菌的抑菌作用分析；金雀花碱衍生物zinc02139758与黏菌素联合处理对沙门氏菌抗菌能力分析。

13、本发明还提供了一种金雀花碱衍生物zinc02139758在抑制沙门氏菌的应用。

14、进一步地，还包括金雀花碱衍生物zinc02139758与黏菌素联合抑制沙门氏菌。

15、进一步地，沙门氏菌为肠炎沙门氏菌，门斯特沙门氏菌，肯塔基沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌和汤普逊沙门氏菌。

16、在本发明的较佳实施方式1中，详细说明了沙门氏菌phop蛋白三维结构及天然小分子化合物数据库构建过程；

17、在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明了靶向沙门氏菌phop蛋白zinc02139758的筛选及结合能力评价过程；

18、在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明了zinc02139758靶向抑制phop蛋白活性及抑菌能力分析过程；

19、在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明了zinc02139758与黏菌素联合处理对沙门氏菌抗菌能力分析过程。

20、本发明有益的技术效果如下：

21、本发明靶点选择精准且关键（phop）、先导化合物（zinc02139758）兼具天然低毒潜力与“老药新用”开发优势、研发策略（cadd）高效低风险、核心性能指标（显著降低黏菌素mic）直击临床痛点且已获实验验证。 生产路径清晰，原料和工艺基础可行，应用场景（人用/兽用治疗、源头防控）广泛。该发明技术成熟度较高（完成靶点验证、先导化合物发现及体外机制研究），产业化路径明确，风险相对可控，具有极高的转化潜力和市场前景。首次明确提出并验证了沙门氏菌phopq双组份系统中的响应调控蛋白phop（特别是其保守的α4-β4-α5结构区域）作为筛选抑制剂的关键药物靶标，用于克服沙门氏菌（尤其是黏菌素耐药株）的耐药性问题。基于结构的虚拟筛选与动力学模拟相结合。所发掘的化合物zinc02139758来源于天然产物衍生物，具有潜在低毒性、高特异性的优势，为开发防控多重耐药（特别是黏菌素耐药）肠炎沙门氏菌及其他相关血清型感染提供了全新的思路和候选物质。具体为：

22、1、靶点创新性与精准性：

23、首创性锁定沙门氏菌耐药核心调控因子——phop蛋白（尤其其保守二聚界面α4-β4-α5）为靶点。该靶点在黏菌素耐药中起决定性作用（基因缺失使mic下降16倍），干预此靶点可直击耐药性根源。

24、优势体现： 相较于传统广谱抑菌剂，靶向phop具有高特异性，降低对宿主或共生菌群影响，减少耐药性发展风险，符合精准医疗趋势。

25、先导化合物优势突出：

26、天然来源，安全性潜力高： zinc02139758为金雀花碱（已知药用天然产物）衍生物，相较于全新合成化合物，其母核结构已知，潜在毒副作用风险更低，后续毒理研究及注册申报可能更具优势。

27、该化合物非全新分子实体，其基础理化性质、部分代谢数据（基于母核）可能已有参考，大幅缩短临床前研究周期，降低研发失败风险与成本。

28、实验证实其不仅直接抑制phop靶点，同时破坏细菌细胞壁/膜结构、扰乱氧化还原稳态，多途径协同增效，不易产生单靶点耐药。

29、先进的cadd技术应用： 基于同源建模、高通量虚拟筛选、分子动力学模拟的计算机辅助药物设计（cadd） 成功发掘先导化合物。该方法显著缩短传统“试错式”筛选周期（从数年缩短至数月），降低筛选成本（节省大量化合物采购与表型测试费用），提高研发效率与成功率。

30、体外验证体系成熟： mic测定、靶点作用验证（如分子互作、报告基因等）、细胞结构/功能检测等体外实验体系完善、成本可控，结果可靠，为后续开发提供坚实数据支撑。

31、2.核心抑菌性能：

32、显著降低黏菌素mic值： 在多个沙门氏菌血清型中，zinc02139758能显著降低黏菌素的最小抑菌浓度（mic）。具体下降幅度是衡量其增敏效果的关键量化指标，本发明降低了4-16倍。有效逆转或克服沙门氏菌对“最后防线”抗生素黏菌素的耐药性，使失效/低效抗生素重新发挥作用。

33、3.化合物来源与合成基础：

34、zinc02139758是已知衍生物，其化学结构明确，合成路径可参考金雀花碱及其类似物的成熟方法。

35、原料（金雀花碱）来源相对稳定： 金雀花碱可从豆科植物中提取，或通过化学合成获得，原料供应有保障。

36、工艺开发风险可控： 合成与纯化工艺可借鉴成熟经验，放大生产可行性高，成本可控。

37、多元化、高需求应用场景：

38、人用医药： 开发为注射用或口服的黏菌素增敏剂（复方制剂），用于治疗多重耐药（mdr）沙门氏菌引起的严重感染（如败血症）。市场迫切需求明确。

39、兽用领域： 开发为兽用治疗药物或饲料添加剂，用于预防和治疗畜禽沙门氏菌病，从源头减少耐药菌传播，保障食品安全。兽药审批路径通常较人用药短。

40、消毒/防腐产品： 开发用于食品加工环境或医疗器械的消毒剂/防腐剂成分，控制环境中耐药沙门氏菌污染。

41、平台技术可扩展性：

42、本方案建立的“靶向phop虚拟筛选与验证”平台，可快速应用于其他病原菌（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）phop同源靶点的抑制剂开发，扩展应用范围，提升技术价值。

43、cadd技术流程可复制用于针对其他细菌关键耐药靶点（如其他双组分系统、外排泵等）的抑制剂筛选。

44、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。