一种金属-多酚可注射水凝胶的制备方法及所得产品和应用与流程

本发明涉及一种金属-多酚可注射水凝胶的制备方法及所得产品和应用，具体涉及一种具有光热-免疫联合治疗效果的金属-多酚可注射水凝胶的制备方法及所得产品和应用。

背景技术：

1、肝癌是全球常见的恶性肿瘤，发病率排名第四，死亡率排名第三。此前，肝癌治疗采用综合模型，基于手术治疗，包括射频消融、介入治疗、靶向治疗、化疗和放疗。然而，术后复发率较高，现有治疗方法效果有限。免疫疗法是一种通过刺激免疫功能和增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫来控制和杀死肿瘤细胞的治疗方法;免疫检查点抑制剂（ici）的应用已成为当前研究热点。免疫治疗中严重毒性反应的概率低于传统肝癌治疗，患者对免疫治疗的耐受性也高于传统治疗。近年来，肝癌免疫治疗在临床环境中已显示出积极效果。然而，肝癌的免疫和靶向治疗存在响应率低下、全身不良反应明显等问题，其原因可能与肿瘤微环境的免疫抑制、药物脱靶率高等相关。因此，寻找新的有效治疗手段并阐明其机制，对推动肝癌的临床治疗发展具有重要意义。

2、光热治疗（photothermal therapy，ptt）是将外部光能转化为热量，增加肿瘤区域温度并杀死肿瘤细胞。在肿瘤热消融过程中，肿瘤细胞会发生免疫原性死亡，从而诱导系统性的肿瘤特异性细胞免疫反应，促进肿瘤组织的 t 淋巴细胞浸润，从而有效地抑制肿瘤细胞的局部浸润和远处转移。此外，肿瘤细胞消融产生的抗原，在免疫佐剂的作用下，可充当“原位肿瘤疫苗”，诱发宿主长期、系统的抗肿瘤免疫效应，显著提高对机体内残余肿瘤细胞的杀伤作用。国内外多位学者研究发现，ptt与免疫检查点抑制剂联合使用，可以诱导全身性剧烈免疫响应，明显增强抗肿瘤效应。为了提高其治疗效果，研究者往往倾向于联合治疗，光热/免疫疗法作为近年来快速发展的治疗方法，在肿瘤治疗方面展现出良好的应用前景。

3、在肿瘤治疗中，严重的全身不良反应仍然是抗肿瘤药物使用中无法回避的问题，联合用药往往会诱发更加频繁和强烈的不良反应，甚至是致死性的。手术后局部给药，可以显著增加药物靶向效果，同时大大降低了循环血液中药物浓度，从而降低全身性毒副作用。当前临床上的局部给药方式主要为植入剂式（如氟尿嘧啶植入剂），其被证明可以有效地降低术后肿瘤复发率。但该植入剂的高分子骨架不能被人体降解吸收，从而带来如局部炎症反应、出血、吻合口瘘、肠梗阻等严重术后并发症。

4、近年来，可注射水凝胶被广泛地应用于再生医学、组织工程和癌症的治疗。其主要特点为注射在肿瘤部位后原位即时成胶，可较容易地装载各种药物。术后将载药凝胶注射于手术床，可以依附手术创面形成不同形状和功能的薄膜或涂层，直接与残余肿瘤细胞接触而增强其靶向效果，同时还具备止血、促进伤口愈合等功能。装载光敏剂后联合 ptt 不仅能清除部分术后残留的肿瘤组织，而且可诱导宿主产生强烈的抗肿瘤免疫响应。其缺点是制备工艺复杂，自身缺乏光热响应。因此，研发制备简单且具有光热效应的注射水凝胶是当前的一大挑战，多酚与金属离子螯合制备的金属-多酚网络骨架水凝胶，自身即具有良好的光热效能，且制作简单，是理想的药物递送材料。在具备止血、促进伤口愈合等功能的同时，联合ptt还可以预防手术创面感染。

5、目前，尚未有将金属-多酚可注射水凝胶结合光热治疗实现肝癌术后“局部杀伤-免疫激活”双重协同治疗的报道。

技术实现思路

1、针对肝癌术后治疗的瓶颈，本发明提供了一种金属-多酚可注射水凝胶的制备方法及所得产品，本发明利用多巴胺修饰透明质酸和白皮杉醇中酚羟基与金属离子的络合反应制备金属-多酚网络水凝胶，通过材料自组装且结合光热治疗可以实现肝癌术“局部杀伤-免疫激活”双重协同治疗作用。该水凝胶对肝癌表现出高效的光热-免疫联合治疗效果，且可以术后注射于肿瘤部位后原位即时成胶，降低了全身不良反应，为肝癌术后提供了新型方案。

2、本发明具体技术方案如下：

3、一种金属-多酚可注射水凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：

4、（1）将透明质酸与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和n-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulf-nhs）进行反应，活化透明质酸的羧基，然后加入盐酸多巴胺（da）和有机碱进行反应，得到邻苯二酚封端的透明质酸（ha-da）；

5、（2）将步骤（1）得到的邻苯二酚封端的透明质酸（ha-da）与白皮杉醇（pic）在溶液环境下均匀混合，得到前驱体混合液；

6、（3）将前驱体混合液与金属盐溶液混合，然后加入瓜尔豆胶，反应形成网络结构，得到金属-多酚可注射水凝胶。

7、进一步的，步骤（1）中，透明质酸的重均分子量为40万道尔顿~80万道尔顿，例如40万道尔顿、45万道尔顿、50万道尔顿、55万道尔顿、60万道尔顿、65万道尔顿、70万道尔顿、75万道尔顿、80万道尔顿。

8、进一步的，步骤（1）中，透明质酸（ha）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）、n-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulf-nhs）的质量比为1：2-3：1-1.5。

9、进一步的，步骤（1）中，所述有机碱为三乙胺。透明质酸先和edc、sulf-nhs反应进行活化，然后与盐酸多巴胺、有机碱进行反应，实现 ha 与 da 的共价连接，得到ha-da共轭物。透明质酸与盐酸多巴胺（da）的质量比为1 : 0.5-0.6。透明质酸与有机碱三乙胺的用量关系为：100mg：3-5µl。

10、进一步的，步骤（1）中，向透明质酸溶液中先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液，反应15-30 min，然后再加入n-羟基磺基琥珀酰亚胺溶液，反应1-1.5 h，然后再加入盐酸多巴胺溶液和有机碱，惰性气体保护下反应20-21 h。反应结束后透析、冻干得ha-da粉末。其中，透明质酸溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液、n-羟基磺基琥珀酰亚胺溶液、盐酸多巴胺溶液的溶剂均为ph=5~6的磷酸盐缓冲液。

11、进一步的，步骤（2）中，ha-da与白皮杉醇（pic）的质量比为3-4:1。具体地：将ha-da冻干品用水配制成溶液，将白皮杉醇用水配成溶液，向ha-da溶液中加入白皮杉醇溶液，混合均匀，即得前驱体混合液。ha-da溶液的浓度为20-40mg/ml，白皮杉醇溶液的浓度为40-50mg/ml。

12、进一步的，本发明多酚化合物选择邻苯二酚封端的透明质酸和白皮杉醇（pic）的组合。白皮杉醇（pic）是一种天然多酚类化合物，主要存在于蓝莓、葡萄、坚果（如杏仁）及紫檀属植物中，尤其在蓝莓中含量较高。作为白藜芦醇的甲基化衍生物，白皮杉醇具有更强的生物利用度和稳定性，其生物活性涵盖抗氧化、抗炎、降糖、神经保护及抗肿瘤等多种功能。在其抗肿瘤领域中，白皮杉醇通过多种途径发挥显著作用，本发明首次研究发现白皮杉醇具有抑制免疫抑制因子pge2的作用，这凸显了白皮杉醇作为天然抗癌化合物的潜力。

13、进一步的，步骤（3）中，金属盐为铜盐，金属盐为金属的硫酸盐或氯化盐。

14、进一步的，步骤（3）中，前驱体混合液与金属盐溶液的体积比为10-13:1。

15、进一步的，步骤（3）中，金属离子与白皮杉醇的摩尔比为4-5:1。

16、进一步的，步骤（3）中，前驱体混合液与金属盐溶液混合后，再加入瓜尔豆胶，搅拌至完全溶解，静置约2-3h，利用酚羟基与铜离子的螯合反应形成网络结构，得到最终的水凝胶。ha-da与瓜尔豆胶的质量比为1 : 1-1.5，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5。

17、本发明利用酚羟基与金属离子的络合反应制备金属-多酚网络可注射水凝胶。该可注射水凝胶注射在肿瘤手术后部位内可以原位成胶，局部注射使用，不会存在脱靶问题，不良反应低，其也在本发明保护范围之内。

18、本发明可注射水凝胶联合ptt可以对肝癌表现出高效的光热-免疫联合治疗效果。该可注射水凝胶联合ptt可以实现：1.光热直接杀伤残余肿瘤细胞；2.白皮杉醇抑制pge2的生成，激活抗肿瘤免疫。该水凝胶可以最大程度降低肿瘤复发转移，同时降低全身不良反应，为肝癌术后提供新型方案。该金属-多酚网络可注射水凝胶在制备肝癌术后治疗药物的应用也在本发明保护范围之内。

19、本发明利用酚羟基与金属离子的络合反应制备金属-多酚网络水凝胶，该水凝胶不仅具有良好的生物相容性、原位成胶性及光热响应性，还能通过局部给药降低全身不良反应，在体外和体内实验均显示出优异的肿瘤杀伤、免疫激活及抗复发转移功能，对肝癌表现出高效的光热-免疫联合治疗效果。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、1、制备优势：本发明水凝胶基于酚羟基与金属离子的快速配位反应，无需复杂设备，反应条件温和（室温、水溶液体系），制备工艺简便易行、能源消耗低、所用原料生物相容性好、环境友好，便于规模化生产。

21、2、局部精准给药：本发明水凝胶可注射特性适配手术创面形状，原位成胶后直接与残余肿瘤细胞接触，药物局部浓度高，循环血液中药物浓度低，局部给药显著降低了全身不良反应。

22、3、 双重协同治疗：光热杀伤方面，在808 nm近红外激光（1.5 w/cm²）照射下，金属-多酚网络水凝胶可将光能转化为热能，使肿瘤局部温度升至60-70 ℃，达到光热杀伤作用（thermal ablation），直接杀伤残余肿瘤细胞；免疫激活方面，在肿瘤微环境中，白皮杉醇可以抑制cox-2，进一步抑制pge2，cox-2通过催化花生四烯酸生成前列腺素e2（pge2），后者通过结合ep2/ep4受体抑制细胞毒性t淋巴细胞（ctl）功能，并促进调节性t细胞（treg）和髓源性抑制细胞（mdscs）的扩增，从而抑制抗肿瘤免疫应答，降低免疫负调节作用；同时光热疗法诱导icd，释放肿瘤抗原，icd效应促进树突状细胞成熟，诱导cd4⁺/cd8⁺t细胞浸润，克服肿瘤抑制免疫作用，逆转肿瘤微环境，激活全身抗肿瘤免疫，达到防止肝癌术后肿瘤复发和转移的效果。