一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立的制作方法

本发明涉及生物医药，更具体而言，涉及一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立。

背景技术：

1、猪传染性胸膜肺炎（porcine pleuropneumonia, pcp）是由胸膜肺炎放线杆菌（actinobacillus pleuropneumoniae, app）引起的一种重要猪呼吸道细菌性疾病。该病的典型病理特征在急性期为出血性纤维素性肺炎，病猪常表现出口鼻流血甚至突发死亡；慢性期则表现为纤维素性坏死性胸膜肺炎，患病猪成为隐性传染源，易继发其他病原感染，导致猪群长期亚健康，给养猪业造成严重经济损失。疫苗接种是防控该病的关键手段，目前国内常用疫苗主要为灭活疫苗和亚单位疫苗，同时弱毒疫苗、口服疫苗、菌影疫苗、dna疫苗及纳米疫苗等新型疫苗也在积极研发中。

2、疫苗生产必须满足安全性与有效性的基本要求，因此安全检验与效力检验尤为重要。在效力评估中，动物实验仍具有不可替代的作用。通过比较小鼠、豚鼠等非宿主动物与宿主动物（猪）在疫苗接种后的抗体水平及攻毒保护效果，建立两者的相关性，可望用非宿主动物替代宿主动物进行效力检验，以简化操作、降低成本与人力。目前，针对多种动物疫病已开展了基于动物替代方法的研究，如口蹄疫灭活疫苗的balb/c小鼠替代牛进行效力评价等。然而，针对猪传染性胸膜肺炎疫苗，目前尚缺乏可靠的非宿主动物效力替代检验方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个方面的目的在于，提供一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，所述建立具体步骤如下：

2、s1：确定猪传染性胸膜肺炎细菌对宿主动物猪的毒力：将猪传染性胸膜肺炎细菌菌种繁殖培养、稀释后气管注射猪只，记录其死亡时间并进行解剖，并于7日后解剖所有未死亡猪只；

3、s2：筛选替代动物及攻毒方式：将猪传染性胸膜肺炎细菌菌种繁殖培养、稀释后分别腹腔和滴鼻注射小鼠和豚鼠，记录其死亡时间并进行解剖，并于7日后解剖所有未死亡动物；

4、s3：配制疫苗ⅰ，宿主动物猪颈部肌注免疫，2.0ml/只，一免21d后进行二免，二免14d后攻毒，观察免疫保护效果及病理变化；

5、s4：用疫苗ⅰ免疫替代动物，与宿主动物猪同样的免疫时间及攻毒时间，观察免疫保护效果及病理变化；

6、s5：用疫苗ⅰ不同免疫剂量免疫筛选好的替代动物，观察免疫保护效果；

7、s6：用疫苗ⅱ同时免疫宿主动物猪及免疫筛选好的替代动物，观察免疫保护效果及病理变化。

8、优选的，所述猪传染性胸膜肺炎细菌为app1型。

9、优选的，所述app1型是从某猪场发病猪肺组织分离、纯化、鉴定得到，并由本公司进行冻干保存，保藏编号为cgmcc no.47172。

10、优选的，所述替代动物选择小鼠和豚鼠。

11、优选的，所述疫苗ⅰ为app亚单位疫苗。

12、优选的，所述app亚单位疫苗为jy20250711，app亚单位疫苗由apxⅰ、apxⅱ、apxⅲ及ompa蛋白与铝胶配制成疫苗。

13、优选的，所述apxⅰ、apxⅱ、apxⅲ及ompa蛋白蛋白比例为1：1：1：1；所述抗原与铝胶比例为4：1；所述apxⅰ抗原浓度为500μg/ml、apxⅱ抗原浓度为1288μg/ml、apxⅲ抗原浓度为2925μg/ml、ompa抗原浓度为860μg/ml。

14、优选的，所述疫苗ⅱ为jy20240927，疫苗ⅱ由apxⅰ、apxⅱ、ompa及ompd蛋白与铝胶配制成，所述apxⅰ、apxⅱ、ompa及ompd蛋白比例为1：1：1：1；所述抗原与铝胶比例为4：1；所述apxⅰ抗原浓度为1055μg/ml、apxⅱ抗原浓度为1860μg/ml、ompa抗原浓度为1250μg/ml、ompd抗原浓度为680μg/ml。

15、本发明所具有的有益效果如下：

16、本发明通过系统比较替代动物及攻毒方式的感染效果，首次发现豚鼠滴鼻攻毒能够在豚鼠肺部诱导出最显著的实变病变，且该病变与宿主动物猪的病变基本一致，本方法操作简便、重复性好，能够有效避免因机械操作或非特异性感染所致的豚鼠损伤，成功建立了稳定可靠的感染动物模型，不仅解决了该疾病研究领域中替代动物模型构建的技术难题，同时符合实验动物福利伦理要求。

17、本发明有效克服了app病原生物学特性研究及疫苗研发中长期存在的实验用猪稀缺、本动物饲养成本高昂以及试验条件严苛等关键技术瓶颈。所构建的豚鼠模型显著降低了试验操作难度，节约了人力、财力与时间成本，并严格遵循了实验动物福利中的“减少、替代和优化”原则，本方法为深入探究app的病原特性、加速疫苗研发提供了稳定、可靠且经济的实验平台，具有重要的科研价值与实际应用效益。

18、本发明建立了一种高效、低成本的猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型方法，能够有效替代本动物猪进行疫苗效力评估，在保证检验可靠性的前提下大幅节约资源，适合在疫苗研发及质量检验中推广应用。

19、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

20、保藏信息：分类命名胸膜肺炎放线杆菌actinobacillus pleuropneumoniae，保藏机构，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2026年7月2日，保藏编号cgmcc no. 47172。

1.一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，其特征在于：所述建立具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，其特征在于：所述猪传染性胸膜肺炎细菌为app1型。

3.根据权利要求2所述的一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，其特征在于：所述app1型是从某猪场发病猪肺组织分离、纯化、鉴定得到，并由本公司进行冻干保存，保藏编号为cgmcc no.4717。

4.根据权利要求1所述的一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，其特征在于：所述替代动物选择小鼠和豚鼠。

5.根据权利要求1所述的一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，其特征在于：所述疫苗ⅰ为app亚单位疫苗。

6.根据权利要求5所述的一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，其特征在于：所述app亚单位疫苗为jy20250711，app亚单位疫苗由apxⅰ、apxⅱ、apxⅲ及ompa蛋白与铝胶配制成。

7.根据权利要求6所述的一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，其特征在于：所述apxⅰ、apxⅱ、apxⅲ及ompa蛋白比例为1：1：1：1；所述抗原与铝胶比例为4：1；所述apxⅰ抗原浓度为500μg/ml、apxⅱ抗原浓度为1288μg/ml、apxⅲ抗原浓度为2925μg/ml、ompa抗原浓度为860μg/ml。

8.根据权利要求1所述的一种猪传染性胸膜肺炎疫苗豚鼠替代效力检验模型的建立，其特征在于：所述疫苗ⅱ为jy20240927，疫苗ⅱ由apxⅰ、apxⅱ、ompa及ompd蛋白与铝胶配制成，所述apxⅰ、apxⅱ、ompa及ompd蛋白比例为1：1：1：1；所述抗原与铝胶比例为4：1；所述apxⅰ抗原浓度为1055μg/ml、apxⅱ抗原浓度为1860μg/ml、ompa抗原浓度为1250μg/ml、ompd抗原浓度为680μg/ml。