用于治疗癌症的二聚体免疫偶联物及其使用方法与流程

本公开总体上涉及用于治疗癌症的二聚体免疫偶联物，并且具体涉及结合人精子蛋白17（sp17）的二聚体免疫偶联物。

背景技术：

1、治疗性抗体极大改善了癌症治疗结局，并且为至少一部分患者治愈癌症提供了新的机会。首个抗体类癌症免疫治疗药物rituxan®于1997年在美国获批用于治疗b细胞非霍奇金淋巴瘤，其生命周期销售额已超过1000亿美元。尽管竞争广泛存在，rituxan®目前年销售额仍超过10亿美元。例如，竞争性抗体zevalin®于2002年在美国获批。rituxan®和zevalin®均靶向b细胞抗原cd20，并且两种免疫治疗药物均通过耗竭b细胞发挥作用。当rituxan®结合cd20时，其触发抗体依赖性细胞毒作用和白细胞介导的细胞死亡；而zevalin®经过化学修饰以螯合一种放射性同位素，从而能够额外实现辐射诱导的细胞死亡。治疗性抗体还可与细胞毒性药物偶联，例如通过可裂解连接子构建抗体-药物偶联物，使其在结合抗原后释放其细胞毒性载荷。还存在许多其他基于抗体的癌症治疗策略。

2、尽管治疗性抗体彻底改变了肿瘤学领域，但相关进展仍然只是渐进性的。癌症尚未被治愈。因此，仍然期望获得能够改善现有抗体技术的创新策略。

技术实现思路

1、本公开的多个方面涉及如下发现：二聚体免疫偶联物相对于常规单体免疫偶联物和裸露免疫治疗剂具有改善疗效的优势。本公开的二聚体免疫偶联物有利地在其两个组成单体上分别携带不同载荷，使得用二聚体免疫偶联物靶向单个癌细胞能够向该癌细胞同时递送两种不同载荷，从而产生协同抗肿瘤活性。二聚体免疫偶联物通常还包含两个fc片段，由此可使白细胞例如自然杀伤细胞靶向癌细胞，因此能够同时提供第三种独立的癌细胞中和机制。二聚体免疫偶联物还可更有效地介导靶细胞的补体介导裂解。

2、包含两种不同载荷的二聚体免疫偶联物可例如通过将包含第一载荷的第一免疫偶联物与包含第二载荷的第二免疫偶联物交联来制备。

3、二聚体免疫偶联物表现出不同于其组成单体的药代动力学、药效学和亲合力。这些因素共同以此前未被认识到的不可预见方式，有利地改变了二聚体免疫偶联物的给药方式和疗效。发明人意外地发现，虽然同时施用两种不同的单体免疫偶联物可表现出协同作用，但将两种不同的单体免疫偶联物交联以产生二聚体免疫偶联物则表现出增强的协同作用。例如，两种不同的单体免疫偶联物可能具有不同的药效学和/或药代动力学，使得同时施用并不对应于同时结合至同一癌细胞；并且抗原结合事件和/或内吞作用中的随机变化意味着，即使药效学和药代动力学相似，两种不同的单体免疫偶联物也可能无法同时将其载荷递送至同一癌细胞。本公开的二聚体免疫偶联物至少由于几乎总是同时递送两种载荷而改善了上述两个问题。此外，某些癌症相关抗原表现出低细胞表面表达、对抗体的低可及性或其他干扰性特征，所述特征降低了多个免疫治疗剂结合至同一癌细胞的概率。本公开的二聚体免疫偶联物对于靶向此类抗原尤其有效，因为：(1)二聚体免疫偶联物通常携带的载荷约为单体免疫偶联物的两倍，因此单次结合事件递送两倍载荷；以及(2)仅需一次结合事件即可递送不同载荷的协同组合。

4、在不限制本公开或基于本公开内容形成的任何专利权利要求的前提下，发明人发现，结合癌症抗原的二聚体免疫偶联物比常规免疫偶联物更有利，因为二聚体免疫偶联物能够交联癌细胞，从而抑制使癌症扩散至身体其他部位的转移，并且还可抑制癌症逃逸局部干预或免疫应答。

5、常规裸露的治疗性抗体通常诱导fc受体介导的细胞死亡，而常规免疫偶联物则能够同时实现fc受体介导的细胞死亡，以及基于其载荷的抗肿瘤活性。然而，所述载荷存在遮蔽抗体fc部分的风险，从而存在限制fc受体介导的活性的风险。二聚体免疫治疗剂通常进一步遮蔽抗体的fc部分，并进一步限制基于fc受体的抗肿瘤活性。被削弱的fc受体介导的细胞毒性原本可能预期会降低二聚体免疫偶联物的疗效，但发明人发现了相反结果。相对于单体免疫偶联物，二聚体免疫偶联物表现出改善的疗效，这是出乎意料的，例如，鉴于二聚体免疫偶联物的fc受体介导细胞毒作用受到削弱。

6、在不限制本公开或基于本公开内容形成的任何专利权利要求的前提下，发明人发现，限制基于fc受体的抗肿瘤活性可被利用以降低非特异性fc结合，并相对于常规免疫治疗剂提高安全性。此类优势在网状内皮系统中尤其可能有用，包括通过降低抗体-药物偶联物的非特异性副作用而有利于肝脏。因此，消除免疫偶联物对辅助性fc受体途径的依赖，使得能够开发具有更高药物-抗体比的免疫偶联物，并且还使得能够在使非特异性fc相关毒性所带来的风险最小化的同时，施用更高剂量的二聚体免疫偶联物。

7、在不限制本公开或基于本公开内容形成的任何专利权利要求的前提下，发明人发现，结合癌症抗原的二聚体免疫偶联物比常规免疫偶联物更有利，例如，因为额外的结合位点有利于细胞表面抗原聚集并由此发生内吞作用，所述内吞作用将免疫偶联物滞留在癌细胞内部，从而有利于抗肿瘤疗效。将包含放射性同位素的免疫偶联物滞留于癌细胞内部，既可加速细胞死亡，又可保护其他细胞免受辐射。许多包含药物剂的免疫偶联物包含可裂解连接子，所述可裂解连接子经工程化设计以在内吞后释放药物剂，例如响应内吞囊泡的ph或响应囊泡中的水解酶或其他酶而释放所述药物剂。二聚体免疫偶联物通过促进导致内吞作用的聚集，加速在内吞作用后变得可裂解的药物剂释放。

8、二聚体免疫偶联物的另一项意外优势在于，其疗效、药代动力学和药效学中的一项、两项或全部的改善，使得与单体免疫偶联物相比能够缩短输注时间。用作癌症免疫治疗剂的治疗性抗体通常通过静脉输注给药，输注持续一段时间，例如数小时。随着治疗性抗体及其他输注型治疗干预措施的开发日益增多，输注中心的接诊能力已成为限制因素。因此，相对于可比干预措施而言，能够在较短时间内施用的药理学干预措施，可减轻输注中心负担、降低成本并改善患者体验，且这些益处独立于本文所述的临床结局改善。

9、在不限制本公开或基于本公开内容形成的任何专利权利要求的前提下，二聚体免疫偶联物还可通过增加结合癌细胞的免疫偶联物数量而提高癌细胞的细胞毒性，因为在结合抗原时，构成二聚体免疫偶联物的免疫偶联物的结合结构域可能并非全部被占用。这可通过增加二聚体免疫偶联物中靠近癌细胞和/或与癌细胞接合的构成该二聚体免疫偶联物的免疫偶联物单元的数量，克服靶向癌细胞上呈拷贝数的抗原时所遇到的一些障碍。因此，二聚体免疫偶联物可能是靶向显示细胞表面抗原低表达密度的癌症的理想选择。二聚体免疫偶联物的尺寸也约为单体免疫偶联物的两倍，因此可携带约为单体免疫偶联物两倍的载荷以提高效力。因此，相较于单体免疫偶联物，二聚体免疫偶联物的单次抗原结合事件可将两倍量的载荷定位于靶细胞邻近处。

10、以下公开内容广泛描述了二聚体免疫偶联物用于肿瘤学用途的其他各种新颖方面。本 技术实现要素： 部分、前述背景技术和技术领域部分，或者以下附图简要说明、具体实施方式和实施例部分中的任何内容，均不应限制基于本公开内容形成的任何专利权利要求；任何此类专利权利要求均应根据权利要求文字本身并结合其权利要求从属关系进行解释。

11、附图简要说明

12、图1是加载有分子量标准物（m泳道）和在还原条件下（泳道1）和非还原条件下（泳道2）的2微克重组sp17蛋白的sds-page凝胶图像。

13、图2由两个分图组成。左侧分图是考马斯亮蓝染色的sds-page凝胶，加载有分子量标准物（m泳道）、在还原条件下的抗sp17抗体chab2（泳道1）和在非还原条件下的抗sp17抗体chab2（泳道2）。右侧分图是加载有分子量标准物（m泳道）和在还原条件下的抗sp17抗体chab2（e泳道）的sds-page凝胶的蛋白质印迹，其中使用抗小鼠二抗通过增强化学发光（ecl）检测chab2。

14、图3是加载有分子量标准物（m泳道）和sp17蛋白（泳道1、2和3）的sds-page凝胶的蛋白质印迹，其中使用抗sp17抗体chab2检测sp17蛋白。

15、图4由三个分图组成。左侧分图显示id8细胞与抗小鼠异硫氰酸荧光素（fitc）抗体孵育但不含一抗条件下的的流式细胞术结果图。中间分图是用抗sp17抗体chab2和抗小鼠fitc抗体标记的id8细胞的流式细胞术结果图。右侧分图是直方图，显示与左侧分图中仅与抗小鼠fitc抗体孵育的id8细胞相比，中间分图中用chab2和抗小鼠fitc抗体标记的id8细胞的平均荧光强度增加。

16、图5是高效液相色谱（hplc）色谱图，表明抗sp17抗体chab2制剂可以以93%的纯度制造。

17、图6是抗sp17抗体chab2结合重组6his-sp17蛋白的表面等离子体共振数据图。从最高到最低的线对应于300纳摩尔、100纳摩尔、50纳摩尔、25纳摩尔、12.5纳摩尔和6.25纳摩尔浓度的6his-sp17的拟合循环。该数据用于计算chab2与sp17的结合速率常数（ka）为62,600每摩尔每秒，解离速率常数（kd）为0.0001298每秒，解离常数（kd）为2.073纳摩尔。

18、图7是加载有分子量标准物（m泳道）和在还原条件下（泳道1）和非还原条件下（泳道2）的抗sp17抗体sp17-ab2的sds-page凝胶图像。

19、图8是加载有分子量标准物（m泳道）、sp17蛋白（泳道1）和肿瘤细胞裂解物（泳道2）的sds-page凝胶的蛋白质印迹，其中使用抗sp17抗体sp17-ab2检测sp17蛋白。

20、图9a、9b和9c是展示免疫治疗浓度（x轴，纳摩尔）与针对sk-ov-3细胞的细胞毒性（y轴，细胞毒性百分比）的图，免疫治疗剂选自单体抗体sp17-ab2（圆圈，●）、单体免疫偶联物sp17-ab2-dxd（方块，■）、对照人igg4抗体（正三角，▲）和德鲁替康（deruxtecan）（倒三角，▼）。

21、图10是展示免疫治疗药物浓度（x轴，纳摩尔）与其对id8细胞的细胞毒性（y轴，细胞毒性百分比）之间关系的曲线图。图中比较的免疫治疗药物包括：单体抗体sp17-ab2（圆点，●）、免疫偶联物sp17-ab2-dxd（方块，■）、higg4（正三角，▲）以及德曲妥珠单抗素/deruxtecan（倒三角，▼）。