一种PEDF-7mer多肽水凝胶及其制备方法和应用

本发明涉及眼用水凝胶，尤其涉及一种pedf-7mer多肽水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、角膜新生血管（corneal neovascularization，cnv）是临床高发致盲性眼表病变，多由角膜酸碱烧伤、机械外伤、病原微生物感染、自身免疫性炎症等诱因引发。正常健康角膜呈透明无血管结构，依靠泪液与房水供给营养以维持透光功能；当角膜上皮屏障受损后，体内促血管生成因子大量异常表达，新生血管侵入角膜基质层，会持续诱发角膜水肿、炎症细胞浸润、纤维瘢痕增生，造成角膜永久性混浊，严重损伤患者视功能，病情进展至晚期可直接导致失明，是眼科亟待解决的临床难题。

2、目前临床针对cnv的干预手段主要分为手术治疗与局部滴眼药物治疗两类。激光光凝、角膜移植等手术方案创伤大、术后复发风险高，仅适用于重度晚期患者，适用人群范围狭窄；轻中度cnv患者临床首选局部滴眼给药模式，但现有给药体系存在难以根除的技术缺陷。色素上皮衍生因子（pedf）兼具强效抗新生血管、抗氧化、抗炎、促角膜上皮修复多重生物活性，是理想的cnv靶向治疗活性分子，但全长pedf蛋白分子量巨大，难以穿透致密的角膜上皮屏障，且眼表环境富含各类蛋白酶，游离全长pedf极易被水解降解、快速失活，角膜局部药物生物利用度极低，无法直接开发常规滴眼制剂。

3、现有研究证实，pedf来源7肽短肽（pedf-7mer）保留了pedf的核心药理活性，同时分子量更小，角膜组织穿透能力显著优于全长pedf蛋白，具备开发眼用制剂的巨大潜力。但将pedf-7mer多肽溶于缓冲液制备普通滴眼液存在明显短板：多肽游离于眼表，受泪液快速冲刷流失，角膜有效作用时间极短；眼表蛋白酶可直接接触裸露多肽，造成药物快速降解，药效大幅衰减。

4、为延长多肽滞留时间、提升药物稳定性，现有技术多采用泊洛沙姆、透明质酸钠、海藻酸盐等基质构建物理型眼用水凝胶，通过物理包裹方式负载多肽药物，该类凝胶仅依靠分子间弱相互作用实现药物包载，未实现药物与载体的共价结合，存在两大核心缺陷：一是药物突释现象严重，短时间内大量多肽快速释放、快速耗竭，无法实现平稳长效的可控缓释；二是多肽仅物理嵌于凝胶网络中，结合力微弱，轻微泪液冲刷即可发生药物脱落，难以长期维持角膜局部有效药物浓度，且多肽暴露于凝胶孔隙外侧，仍易被蛋白酶降解失活。

5、现有商用眼用凝胶基质多采用未改性泊洛沙姆f127，依靠温度诱导疏水聚集实现物理凝胶化，体系内部仅存在动态物理交联，无稳定、定向的共价键网络，凝胶力学性能、黏附性能较差；部分复合凝胶简单共混透明质酸与泊洛沙姆，两组分间无化学交联，凝胶整体结构松散、降解速度不可控，难以匹配眼部长效给药需求。同时，普通透明质酸基质仅依靠分子间氢键实现眼表黏附，湿态黏附力弱，眨眼、泪液流动时极易从角膜表面脱落；单纯温敏泊洛沙姆凝胶缺乏黏附性能，无法实现长时间眼表停留。

6、综上，现有物理共混型眼用水凝胶无法同时解决pedf-7mer多肽易流失、易降解、释放不可控、眼表滞留时间短等多重问题，临床亟须一种可实现适配pedf-7mer的分子结构与眼部局部给药需求，为角膜新生血管、角膜上皮炎症提供长效、高效、低给药频次的新型眼用制剂。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种pedf-7mer多肽水凝胶及其制备方法和应用，以解决上述问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种pedf-7mer多肽水凝胶，原料包括马来酰亚胺修饰泊洛沙姆f127、巯基化透明质酸、巯基修pedf-7mer多肽；所述水凝胶通过巯基-马来酰亚胺点击化学反应形成双共价交联体系：马来酰亚胺修饰泊洛沙姆f127分别与巯基化透明质酸、巯基修饰pedf-7mer多肽发生硫醚键共价偶联。

4、本发明还提供了所述pedf-7mer多肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

5、（1）将巯基化透明质酸溶于pbs缓冲液中，搅拌10~15min后，获得巯基化透明质酸溶液，加入巯基修饰pedf-7mer多肽，获得巯基化透明质酸多肽溶液；

6、（2）将马来酰亚胺化普朗尼克f127溶于pbs缓冲液中，将马来酰亚胺化普朗尼克f127溶液与步骤（1）制得的巯基化透明质酸多肽溶液于36~38℃分别静置13~17min，然后将两种溶液混合，于36~38℃反应45~55s，即得pedf-7mer多肽水凝胶；

7、步骤（2）中混合体系中凝胶前驱体质量分数为10~20wt%。

8、优选的，所述巯基化透明质酸多肽溶液的浓度为28~32wt%，马来酰亚胺化普朗尼克f127溶液的浓度为28~32wt%。

9、优选的，巯基化透明质酸、马来酰亚胺化普朗尼克f127和巯基修饰pedf-7mer多肽的质量比为0.8~1.2:1.8~2.2:0.1。

10、优选的，所述巯基化透明质酸的制备方法包括以下步骤：

11、（1）将透明质酸溶于超纯水，调节ph 5.0~5.5，edc/nhs活化羧基；

12、（2）加入胱胺二盐酸盐进行酰胺偶联，接枝含二硫键侧链；

13、（3）在步骤（2）的反应体系中加入过量的二硫苏糖醇还原断裂二硫键，释放游离巯基；

14、（4）纯化、冷冻干燥得到巯基化透明质酸粉末。

15、优选的，所述马来酰亚胺修饰泊洛沙姆f127的制备方法包括以下步骤：

16、（1）6-马来酰亚胺己酸经氯化亚砜酰氯化，得到6-马来酰亚胺己酰氯；

17、（2）将干燥后的马来酰亚胺修饰泊洛沙姆f127溶于无水二氯甲烷，在三乙胺催化下与6-马来酰亚胺己酰氯发生酯化反应；

18、（3）将步骤（2）的反应体系浓缩，逐滴加入预冷正己烷中，收集沉淀，除杂后即得。

19、优选的，所述巯基修饰pedf-7mer多肽采用fmoc固相多肽合成法制备，于多肽c端引入半胱氨酸残基携带游离巯基获得。

20、本发明还提供了所述的pedf-7mer多肽水凝胶在以下至少一项中的应用：

21、（1）在制备抑制角膜新生血管形成的眼用药物中的应用；

22、（2）在制备抑制角膜上皮细胞炎症的眼用药物中的应用。

23、通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

24、本发明选用马来酰亚胺修饰泊洛沙姆（pf127-mal）、巯基化透明质酸（ha-sh）及巯基修饰pedf-7mer多肽为原料，依托巯基-马来酰亚胺点击化学反应，实现了两个关键的“专属结合”：

25、1.药物与载体共价偶联：pedf-7mer多肽末端巯基可与马来酰亚胺化普朗尼克f127（pf127-mal）的马来酰亚胺基团发生点击反应，生成稳定硫醚键，使多肽药物定点接枝于凝胶骨架，区别于传统物理包埋的载药方式；

26、2.凝胶骨架共价交联：pf127-mal与ha-sh同样通过巯基-马来酰亚胺点击反应相互键合，构筑结构稳定的三维交联网络，实现凝胶降解速率与药物释放行为的精准调控。

27、3.本发明同时引入pf127-mal温敏载药模块与巯基化透明质酸（ha-sh）黏附模块，ha-sh可与角膜表面蛋白形成共价结合，大幅提升湿态黏附力，延长制剂眼表滞留时间；同时体系透明性高，不遮挡患者视线，提升临床使用舒适度。

28、4.本发明将共价载药单元与湿态黏附基质整合为单一原位温敏滴眼液，低温液态便于滴眼，体温下快速形成透明三维凝胶，一次给药即可长时间维持角膜有效药物浓度，减少给药频次、提升患者依从性，提供安全高效、可临床转化的角膜新生血管局部治疗新制剂。