一种调控胆管癌免疫微环境的外泌体水凝胶及其制备方法

本技术涉及生物医药，更具体地说，它涉及一种调控胆管癌免疫微环境的外泌体水凝胶及其制备方法。

背景技术：

1、胆管癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，具有早期隐匿性强、恶性程度高的特点，多数患者确诊时已失去手术根治机会，传统放化疗等治疗手段的临床获益较为有限。免疫微环境失调是胆管癌发生发展的重要机制，通过调控肿瘤相关巨噬细胞极化状态、重塑免疫抑制微环境，可有效增强抗肿瘤免疫应答，为胆管癌的干预治疗提供了可行路径。外泌体及小分子免疫调节剂是常用的免疫调控活性物质，但常规全身给药方式存在肿瘤部位富集效率低、全身暴露风险高的局限。

2、目前可用于局部递送免疫调控活性物质的水凝胶制剂，多采用单一活性组分设计，难以实现多通路协同的免疫调控效果，且常规凝胶体系的释放行为缺乏微环境响应性，局部滞留时间与控释精度不足，无法在提升肿瘤区域活性成分浓度的同时有效控制全身暴露量，难以满足胆管癌免疫微环境调控的实际应用需求。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中免疫调控水凝胶活性组分单一、局部控释递送效果有限，难以兼顾肿瘤区域作用浓度与全身暴露安全性的问题，本技术提供一种调控胆管癌免疫微环境的外泌体水凝胶及其制备方法。

2、第一方面，本技术提供一种调控胆管癌免疫微环境的外泌体水凝胶，采用如下的技术方案：

3、一种调控胆管癌免疫微环境的外泌体水凝胶，由a液和b液按体积比0.9:1至1.1:1混合后原位交联形成；

4、所述a液按质量份数计包含：巯基化壳聚糖1.5至2.5份、timp2富集外泌体0.05至0.5份、海藻糖2至5份、甘露醇1至3份、甘氨酸0.1至0.5份、甘露聚糖0.1至0.5份、活性氧敏感交联调节剂0.05至0.2份；

5、所述b液按质量份数计包含：高碘酸钠醛基化改性氧化透明质酸1.0至2.0份、褐藻多糖硫酸酯0.1至0.5份、csf-1r小分子抑制剂0.08至0.1份。

6、通过采用上述技术方案，将作用于不同层面的免疫调控活性物质共同负载于双组分原位水凝胶体系中，timp2富集外泌体可通过调控肿瘤基质重塑改善免疫细胞浸润条件，褐藻多糖硫酸酯可直接干扰巨噬细胞极化信号通路，csf-1r小分子抑制剂可抑制肿瘤相关巨噬细胞的存活与募集，三类活性成分通过不同靶点协同作用，多通路干预胆管癌免疫抑制微环境；同时水凝胶可在给药部位原位形成半固态凝胶实体，延长活性物质在肿瘤区域的滞留时间，减少全身循环分布，有助于提升局部作用浓度并降低全身暴露的潜在风险。

7、优选的，所述timp2富集外泌体的粒径为80nm至150nm，外泌体内timp2蛋白表达量为普通骨髓间充质干细胞外泌体的2倍至3倍。

8、通过采用上述技术方案，将外泌体粒径控制在适宜区间，既保证其能够顺利穿透组织间隙到达肿瘤微环境，又可避免粒径过小被快速清除或粒径过大引发网状内皮系统截留；富集的timp2蛋白可通过调控基质金属蛋白酶活性，改善肿瘤基质的致密纤维化状态，为效应免疫细胞的浸润提供有利的微环境基础。

9、优选的，所述巯基化壳聚糖的巯基取代度为5%至15%，分子量为100kda至150kda；所述高碘酸钠醛基化改性氧化透明质酸的氧化度为10%至30%，分子量为80kda至120kda。

10、通过采用上述技术方案，两种天然多糖基质均具备良好的生物相容性与可降解性，巯基与醛基可在温和的生理条件下发生共价交联，无需额外引发剂，适配生物活性物质的包载要求；通过调控多糖的取代度与分子量，可灵活调节凝胶的交联密度、机械强度与体内降解速率，匹配不同给药场景的留存时间需求。

11、优选的，所述褐藻多糖硫酸酯的分子量为5kda至50kda，硫酸根取代度为10%至30%；所述活性氧敏感交联调节剂为3,3'-二硫代双丙酰肼；所述csf-1r小分子抑制剂为blz945。

12、通过采用上述技术方案，硫酸化修饰的岩藻聚糖可通过作用于巨噬细胞表面模式识别受体，下调促极化相关信号通路的活化水平，发挥免疫调控作用；3,3'-二硫代双丙酰肼分子两端的酰肼基团可与醛基发生共价结合，中间的二硫键结构可响应肿瘤微环境的高活性氧发生断裂，是构建响应型交联网络的功能单元；blz945可特异性作用于csf-1受体酪氨酸激酶，阻断下游存活信号传导，减少肿瘤组织中促炎型巨噬细胞的数量与功能活性。

13、第二方面，本技术提供了一种调控胆管癌免疫微环境的外泌体水凝胶的制备方法，采用如下的技术方案：

14、一种调控胆管癌免疫微环境的外泌体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

15、s1、外泌体制备：对骨髓间充质干细胞进行诱导处理以富集外泌体中的timp2蛋白，收集诱导后的无血清条件培养基，依次经差速离心去除细胞与细胞碎片，取上清液经超速离心分离得到外泌体沉淀，将外泌体沉淀重悬于缓冲液中，得到骨髓间充质干细胞来源的timp2富集外泌体悬液；

16、s2、保护液配制：向步骤s1所得的timp2富集外泌体悬液中加入海藻糖、甘露醇与甘氨酸，搅拌至完全溶解，得到外泌体保护液；

17、s3、a液制备：在低温条件下，将巯基化壳聚糖加入外泌体保护液中，搅拌至完全溶解，再依次加入甘露聚糖与活性氧敏感交联调节剂，继续搅拌至分散均匀，调节ph值后除菌过滤，得到a液；

18、s4、b液制备：将氧化透明质酸与硫酸化岩藻聚糖溶解于磷酸盐缓冲液中，搅拌至完全溶解，得到多糖混合溶液；将csf-1r小分子抑制剂用微量二甲亚砜预先溶解后，滴加至所得多糖混合溶液中，搅拌混合均匀，调节ph值后除菌过滤，得到b液；

19、s5、原位成胶：将a液与b液分别盛装于独立容器中，同步输出混合，两液接触后形成动态共价交联网络，在生理温度条件下完成成胶。

20、通过采用上述技术方案，采用双组分独立制备、使用时混合交联的工艺路线，将外泌体与巯基基质组分储存于a液，醛基基质与小分子抑制剂储存于b液。分开状态下各组分所处环境稳定，既不会提前发生交联反应，也避免不同活性物质间的相互干扰，有效延长制剂储存有效期；使用时仅需将双液同步输出即可快速原位成胶，适配临床局部给药的操作需求，提升给药操作便捷性与成胶均匀性，可充分满足多种临床治疗场景的实际使用需求，保障临床实际应用效果。

21、优选的，步骤s1中，所述骨髓间充质干细胞培养至融合度70%至80%时，更换为含4.5μmol/l至5.5μmol/ltgf-β受体抑制剂的无血清培养基，继续培养46h至50h后再收集条件培养基；差速离心参数依次为300×g离心9min至11min、2000×g离心9min至11min、10000×g离心28min至32min，超速离心参数为9800×g至10200×g离心68min至72min。

22、通过采用上述技术方案，利用tgf-β受体抑制剂阻断干细胞内的相关信号通路，上调timp2基因的转录与蛋白表达水平，使细胞分泌的外泌体在形成过程中自然富集目标蛋白，无需基因编辑或病毒转染操作，制备过程简单且生物安全性更高；采用多级差速离心逐步去除细胞碎片、大囊泡与蛋白聚集体，再通过超速离心富集外泌体颗粒，可保证产物的纯度与均一性，维持外泌体膜结构与内容物的活性稳定。

23、优选的，步骤s3中，所述低温条件为3℃至5℃，搅拌速率为50rpm至80rpm，ph值调节至6.0至6.5；外泌体预先分散于保护体系中，再与巯基化壳聚糖混合。

24、通过采用上述技术方案，由海藻糖、甘露醇与甘氨酸组成的三元保护体系，可通过羟基氢键作用替换外泌体膜表面的结合水，在膜表面形成稳定的保护层，同时稳定膜蛋白的空间构象，避免蛋白变性失活；配合低温低速搅拌的制备条件，降低分子热运动与剪切力对外泌体结构的破坏；采用先保护后混合的工艺顺序，可避免外泌体直接接触高反应性的醛基类物质，防止膜蛋白被共价修饰而丧失生物活性。

25、优选的，步骤s4中，所述csf-1r小分子抑制剂的滴加速率为0.5ml/min至1ml/min，滴加过程中搅拌速率为30rpm至50rpm，滴加结束后继续搅拌10min至15min，ph值调节至7.2至7.4。

26、通过采用上述技术方案，缓慢滴加配合低速搅拌的方式，可使疏水性小分子抑制剂均匀分散于水相多糖体系中，避免局部浓度过高引发团聚或沉淀，维持体系的均一性与储存稳定性。

27、优选的，步骤s5中，两液接触后，巯基与醛基发生席夫碱反应，巯基之间氧化形成二硫键，活性氧敏感交联调节剂参与醛基交联反应，共同形成含席夫碱键和二硫键的动态共价交联网络，成胶时间为60s至120s，成胶温度为36℃至38℃。

28、通过采用上述技术方案，席夫碱键与二硫键共同构成凝胶的动态共价交联网络，其中席夫碱键具备ph响应特性，在肿瘤微环境的弱酸性条件下可发生可逆解离，二硫键可被肿瘤区域高浓度的活性氧还原断裂，活性氧敏感交联剂的引入进一步增加了网络中二硫键的数量，提升凝胶对微环境的响应灵敏度；凝胶随交联键逐步断裂发生降解，同步释放包载的各类活性成分，实现与肿瘤微环境特征匹配的序贯释放行为。

29、优选的，还包括冻干制剂步骤，将a液与b液分别进行冷冻干燥，得到冻干粉制剂，使用前分别用注射用水复溶至原体积，再按体积比0.9:1至1.1:1混合成胶。

30、通过采用上述技术方案，冷冻干燥可去除体系中的游离水分，降低分子扩散速率，抑制活性物质的化学降解与微生物增殖，显著提升制剂的储存稳定性，延长有效期，同时便于常温储存与长距离运输；临床使用时以注射用水复溶即可恢复原有溶液状态，按比例混合后原位成胶，操作灵活简便，适配不同的临床应用场景。

31、综上所述，本技术具有以下有益效果：

32、1、由于本技术采用timp2富集外泌体与csf-1r小分子抑制剂共递送的原位水凝胶体系，搭配褐藻多糖硫酸酯的免疫调控作用，通过多靶点协同作用调控巨噬细胞极化、干预胆管癌免疫微环境，由于水凝胶的局部滞留与缓释特性，获得了提升肿瘤区域活性成分浓度、降低全身暴露潜在风险的效果。

33、2、本技术中优选采用3,3'-二硫代双丙酰肼作为活性氧敏感交联调节剂，结合巯基化壳聚糖与氧化透明质酸形成的含席夫碱键和二硫键的双交联网络，由于交联键对肿瘤微环境活性氧的响应性，获得了活性成分序贯释放、提升递送精准性的效果。

34、3、本技术的方法，通过预先制备外泌体保护液的工艺步骤，采用海藻糖、甘露醇与甘氨酸组成的三元保护体系稳定外泌体磷脂膜结构，再分步独立制备a液与b液，因此获得了减少制备过程中外泌体活性损失、保留其生物功能的效果。

35、4、本技术的方法，通过采用tgf-β受体抑制剂诱导骨髓间充质干细胞的方式富集外泌体中的timp2蛋白，配合多级差速离心结合超速离心的分离纯化工艺，因此获得了无需基因编辑即可制备高丰度目标蛋白外泌体的效果。

36、5、本技术中优选采用双组分分别冷冻干燥的制剂形式，将a液与b液独立制备为冻干粉剂，使用前以注射用水复溶即可混合成胶，由于冻干制剂的稳定性优势，获得了延长储存周期、适配多种临床使用场景的效果。