卡伍尔氏链霉菌Y274及其应用

卡伍尔氏链霉菌y274及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物学、生物技术和生物防治领域，具体地说，涉及一株卡伍尔氏链霉菌y274及其应用。


背景技术：

2.小麦茎基腐病主要由假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum)侵染引起，此外，也可由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、黄色镰刀菌(fusarium culmorum)或其他多种镰孢菌混合侵染引起(scott et al.2010)。黄瓜根腐病主要由尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)侵染引起，病原菌可以侵害植物根系的维管组织造成植物死亡，此病害在植物的整个生育阶段都可发病(aldakil et al.2019)。小麦茎基腐病和黄瓜根腐病作为两种由镰刀菌属(fusarium sp.)引起的严重土传病害，会引起作物萎蔫、腐烂和坏死，极端情况还会导致绝收，对小麦和黄瓜的产量和品质均造成了严重影响(rocha et al.2011)。因此，针对该属的防治研究一直受到人们的关注和重视，相较于农业防治和化学防治，生物防治不仅能减少化学药剂的使用，避免环境和农产品污染，而且对有益微生物无影响等优点，符合现代绿色农业的要求。
3.目前对小麦茎基腐病有防治效果的细菌有假单胞菌(pseudomonas spp)(ullah etal.2020)、真菌有丝核菌(rhizoctonia bnr-8-2)(eken et al.2014)、球毛壳菌(chaetomium spp)(yue et al.2018)和诺卡氏菌(nocardiopsis dassonvillei mb22)(allali et al.2019)。而对黄瓜根腐病有防治效果的生防菌主要有芽孢杆菌(bacillus spp)(kamel et al.2022)、假单胞菌(p.fluorescens)(egamberdieva et al.2011)和木霉(trichoderma spp)(zhang et al.2022)等。有研究表明，放线菌也对小麦茎基腐病和黄瓜根腐病的致病菌镰刀菌有很强的抑菌能力，链霉菌作为最具代表性的放线菌之一，是研究人员长期关注的重要功能类群。
4.研究表明，链霉菌(streptomyces polychromogenes uae1)可以显著抑制了由茄腐镰刀菌引起的病害，使病情指数降低53.0％(alblooshi et al.2021)；链霉菌(streptomyces puniceus l75)发酵液粗提取物存在抗真菌代谢物，可使番茄早疫病害降低98.0％(hao et al.2019)；链霉菌(streptomyces sichuanensis sca4-4)显著抑制香蕉幼苗根和鳞茎中尖孢镰刀菌的侵染，使病情指数降低51.0％(qi et al.2022)；链霉菌(streptomyces vinaceusdrappus s5mw2)使由立枯丝核菌引起的番茄根腐病减少71.0％(yandigeri et al.2015)，这些研究表明链霉菌是极具开发价值的类群。尚未见卡伍尔氏链霉菌防治镰刀菌引起的小麦茎基腐病和黄瓜根腐病的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株具有广谱抗菌活性的卡伍尔氏链霉菌y274及其应用，特别涉及该菌在小麦茎基腐病和黄瓜根腐病等植物病害生物防治方面的应用。
6.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株具有生防作用的卡伍尔氏链霉
菌streptomyces cavourensis y274，该菌株于2021年从新疆维吾尔自治区阿克苏地区分离，现已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，地址：中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.27487，保藏日期2023年5月30日。
7.第二方面，本发明提供含有卡伍尔氏链霉菌y274的菌剂。
8.第三方面，本发明提供由卡伍尔氏链霉菌y274或其菌剂制备的生物农药或生物肥料。
9.第四方面，本发明提供由卡伍尔氏链霉菌y274制备的生防药剂或抗菌剂。
10.第五方面，本发明提供卡伍尔氏链霉菌y274或其菌剂的以下任一应用：
11.1)用于拮抗植物病原真菌；
12.2)用于拮抗植物病原细菌；
13.3)用于防治小麦茎基腐病；
14.4)用于防治黄瓜根腐病；
15.5)用于制备生物农药。
16.本发明所述植物包括但不限于小麦、黄瓜。
17.本发明所述植物病原真菌包括但不限于假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、串珠镰刀菌(fusariummoniliforme)、灰霉病菌(botrytis cinerea)、小麦纹枯病菌(rhizoctonia cerealis)、小长喙霉病菌(ceratocystis fimbriata)、水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)，番茄早疫病菌(alternaria solani)、百合根腐病菌(fusarium oxysporum f.sp.lilii)、西瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum f.sp.niveum)、棉花枯萎病菌(verticillium dahliae kleb)、拟轮枝样镰刀菌(fusarium rotundiformis)、芹菜斑枯病菌(septoria apiicola speg)、炭疽病菌(colletotrichum destructivum)。
18.本发明所述植物病原细菌包括但不限于柑橘溃疡病菌(xanthomonas citri)。
19.第六方面，本发明提供卡伍尔氏链霉菌y274和/或其产生的抑菌活性物质的以下任一应用：
20.a)用于抗病原菌以及由病原菌所导致的相关疾病或植物病害；
21.b)用于诱导植物增强对病原菌导致的相关疾病或植物病害的抗性；
22.c)用于制备生防药剂、抗菌剂或植物免疫诱抗剂。
23.进一步地，所述病原菌包括植物病原真菌、植物病原细菌。
24.进一步地，所述植物病害包括但不限于小麦茎基腐病、黄瓜根腐病。
25.本发明的卡伍尔氏链霉菌y274对14种病原真菌和1种病原细菌都有较强的抑制作用，具有很广的抑菌谱，不仅可以在植物生长过程中起到生防作用，还可以显著降低由假禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病和尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌引起的黄瓜根腐病的发病率和病情指数。菌株y274在植物病害的生物防治等方面具有很好的应用价值。
26.菌株y274对假禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌的抑制率分别为43.5％、42.4％和61.8％；对灰霉病菌、番茄早疫病菌、小长喙霉病菌、百合根腐病菌、小麦纹枯病菌、水稻纹枯病菌、棉花黄萎病菌、芹菜斑枯病菌、西瓜枯萎病菌、拟轮枝样镰刀菌和炭疽病菌十一种病原菌的抑菌率达40.4％-82.1％，对柑橘溃疡病菌有明显抑制效果，抑菌圈直径
cerealis)，水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)，番茄早疫病菌(alternaria solani)，百合根腐病菌(fusarium oxysporum f.sp.lilii)，西瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum f.sp.niveum)，棉花枯萎病菌(verticillium dahliae kleb)，拟轮枝样镰刀菌(fusarium rotundiformis)，芹菜斑枯病菌(septoria apiicola speg)，炭疽病菌(colletotrichum destructivum)。
46.植物病原细菌：发根土壤杆菌(agrobacterium rhizogenes)、葡萄土壤杆菌(agrobacterium vitis)，根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)，黄瓜角斑病菌(pseudomonas syringae pv.lachrymans)，柑橘溃疡病菌(xanthomonas citri)，大白菜黑腐病菌(xanthomonas campestris pv.campestris)，辣椒疮痂病菌(xanthomonas campestris pv.vesicatoria)，胡萝卜软腐病果胶杆菌(pectobacterium carotovorum)，茄子青枯病菌(ralstonia solanacearum)。
47.实施例1菌株y274的分离筛选及鉴定
48.1、菌株y274的分离筛选
49.2021年从新疆维吾尔自治区阿克苏地区采集土壤，取10g土样加入内装100ml无菌生理盐水的三角瓶中，静置20min后，28℃，200rpm摇床震荡30min，取1ml加入9ml无菌生理盐水中，再依次稀释101，102，103，104倍，分别取以上土壤悬浮液100μl在含有0.01％的重铬酸钾的高氏一号培养基(可溶性淀粉20g，kno
3 1g，k2hpo
4 0.5g，nacl 0.5g、mgso4·
7h2o 0.5g、feso4·
7h2o 0.01g、蒸馏水1000ml，ph7.2～7.4)，28℃培养箱内培养5天，用无菌牙签挑取形态不一的细菌单菌落划线纯化后，保存备用。分离出共计13株放线菌。
50.采用对峙法检测放线菌的生防效果，首先将分离出的13株菌在pda平板上活化，挑取单菌落分别接种至两侧距平板中央2.5cm处，28℃培养5天后，将假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)和串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)用5mm打孔器制作病原菌菌饼，接种于pda平皿中央，22℃培养4-7天，分别测量对照直径和抑制直径，按照公式i)计算抑制率：
[0051][0052]
在13个菌株中初筛选出分别5株对假禾谷镰刀菌、6株对尖孢镰刀菌和5株对串珠镰刀菌抑菌活性较强的放线菌进行复筛，将其单菌落分别接种至一侧距平板中央2.5cm处，28℃培养5天后，在平板中央接种一个直径5mm的假禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌菌饼，22℃培养4-7天，测量病原真菌形成的扇形角度，检测放线菌的抗菌物质在平板上的扩展能力。
[0053]
经过复筛，最终选出抑菌率高(》40.0％)和抑菌物质扩散性强的菌株y274进行后续试验，菌株对假禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌的平板抑制效果如图1a～图1c和表1-1、表1-2、表1-3所示，抗菌物质的扩展能力如图2a～图2c和表2-1、表2-2、表2-3所示。
[0054]
表1-1 13株放线菌对假禾谷镰刀菌的生长抑制率
[0055][0056]
表1-2 13株放线菌对尖孢镰刀菌的生长抑制率
[0057][0058]
表1-3 13株放线菌对串珠镰刀菌的生长抑制率
[0059][0060]
表2-1 5株高抗假禾谷镰刀菌抗菌物质的扩展能力
[0061][0062]
表2-2 6株高抗尖孢镰刀菌抗菌物质的扩展能力
[0063][0064]
表2-3 5株高抗串珠镰刀菌抗菌物质的扩展能力
[0065][0066]
2、菌株鉴定
[0067]
综合菌株y274的生理生化特性、分子生物学检测和看家基因串联构建系统发育树等结果，将其鉴定为卡伍尔氏链霉菌(streptomyces cavourensis)。具体如下：
[0068]
(1)菌落及菌体细胞形态特征
[0069]
菌株y274在isp 1、isp 2、isp 3、isp 4、isp 5、isp 6、isp 7、na、pda和察氏固体培养基上28℃培养10天后，在大多数培养基上菌落呈灰白色，基质菌丝体呈黄棕色或黄色(图3)。将无菌盖玻片斜插入平板内，接种少量y274的孢子至盖玻片一侧的基部，将插片平板倒置于28℃培养5天后取出，擦净盖玻片背面的培养基和生长较差的菌丝，放于载玻片上，显微镜下观察菌丝形态。菌丝体有分枝状的菌丝体且呈波浪形，菌丝的不同位点会产生小的近球形的分生孢子(图4)。
[0070]
(2)生理生化特性鉴定
[0071]
通过nacl、温度和ph耐受范围实验，牛奶凝固与胨化实验，bcl生化鉴定卡对碳源利用实验以及酶类活性生化实验对y274的生理生化特性进行了测定，结果如图5和表3所示，将其鉴定结果为链霉菌属(streptomyces)。菌株y274牛奶凝固与胨化、淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化、氧化酶、脲酶、脂酶tween 20、脂酶tween 40、脂酶tween 80、七叶灵水解测定结果呈阳性，酪蛋白水解、木聚糖水解、果胶水解、纤维素水解、过氧化氢酶、h2s产生测定结果呈阴性，可以利用鼠李糖、核糖、木糖、葡萄糖、麦芽糖、甘油、甘露醇，不能利用阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、果糖、柠檬酸、肌醇、核糖醇、赤藓糖醇、山梨糖醇。在28-37℃、ph值在6-11范围内、nacl含量在3.0～5.0％条件下可以生长。
[0072]
菌株y274的生长温度、ph条件、耐盐性、淀粉水解、明胶液化特征，以及甘露醇、核糖醇、赤藓糖醇等碳源利用特征与标准菌株streptomyces cavourensis一致，且菌落颜色与标准菌株相似，但酪蛋白水解、木聚糖水解、果胶水解等测定特征与标准菌株存在差异。
[0073]
表3菌株y274的生理生化检测结果
[0074][0075][0076]
注：“ ”阳性，
“–”
阴性，“nd”表示无数据。
[0077]
(3)y274多基因序列分析
[0078]
采用细菌基因组快速提取试剂盒提取放线菌的基因组dna，用琼脂糖胶电泳检测条带后，pcr扩增16s rrna、atpd、gyrb、reca、rpob和trpb基因序列(seq id no:1-6)。序列测序完成后用dnaman软件拼接，使用ncbi(national center for biotechnology information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库的在线blast程序进行比对分析。将5个看家基因的序列从头到尾按顺序为atpd-gyrb-reca-rpob-trpb进行串联，用mega-x软件采用neighbor-joining法构建y274菌株的多基因序列系统发育树。
[0079]
结果如图6-图7所示，菌株y274的16s rrna基因序列streptomyces cavourensis isp-5300归为统一簇群，同源性99.9％；且看家基因atpd、gyrb、reca、rpob、trpb与其标准菌株的相似性达到100％。看家基因的pcr引物见表4。
[0080]
表4看家基因的pcr引物
[0081][0082][0083]
实施例2菌株y274对植物病原真菌的抑制效果
[0084]
采用对峙培养法检测y274对11种常见植物病原真菌的抑菌谱，分别测定其对灰霉病菌(botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(alternaria solani)、小长喙霉病菌(ceratocystis fimbriata)、百合根腐病菌(fusarium oxysporum f.sp.lili)、西瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum f.sp.niveum)、小麦纹枯病菌(rhizoctonia cerealis)、水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)、棉花黄萎病菌(verticillium dahliae kleb)、芹菜斑枯病菌(septoria apiicola speg)、拟轮枝样镰刀菌(fusarium rotundiformis)、炭疽病菌(colletotrichum destructivum)的抑制效果。首先将y274在pda平板上活化，挑取单菌落分别接种至两侧距平板中央2.5cm处，28℃培养5天后，将11种植物病原真菌的菌饼接种于pda平皿中央，22℃培养4-7天，分别测量对照直径和抑制直径，按照公式i)计算抑制率。
[0085]
结果表明，菌株y274具有很广的抑菌谱，对很多病原真菌都具有抑制效果，表明y274在真菌性病害的防治中具有很大的应用潜力。菌株y274对11种植物病原真菌均有良好的抑菌效果，其对小麦纹枯病病菌、炭疽病菌、水稻纹枯病菌、拟轮枝样镰孢菌、小长喙霉病菌、灰霉病菌、番茄早疫病菌、棉花黄萎病菌、芹菜斑枯病菌、百合根腐病菌和西瓜枯萎病菌共11种病原真菌表现高抑菌率(》40.0％)，抑菌率分别为82.1％、72.2％、67.9％、64.7％、61.9％、59.9％、59.3％、57.8％、57.2％、46.5％和40.4％(表5和图8)。
[0086]
表5菌株y274对植物病原真菌生长抑制
[0087][0088][0089]
实施例3菌株y274对植物病原细菌的抑制效果
[0090]
挑取活化好的y274单菌落接种至pda平板中央，28℃培养5天后，取3ml氯仿至玻璃培养皿盖上，倒置熏蒸10-12h，以其蒸汽杀死放菌株y274。选取9种常见植物病原细菌：发根土壤杆菌(agrobacterium rhizogenes k27)、葡萄土壤杆菌(agrobacterium vitis k308)，根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens c58)，黄瓜角斑病菌(pseudomonas syringae pv.lachrymans)，柑橘溃疡病菌(xanthomonas citri)，大白菜黑腐病菌(xanthomonas campestris pv.campestris)，辣椒疮痂病菌(xanthomonas campestris pv.vesicatoria)，胡萝卜软腐病果胶杆菌(pectobacterium carotovorum)，茄子青枯病菌(ralstonia solanacearum)，将植物病原细菌单菌落接种于lb液体培养基中，28℃、150rpm培养8h，用无菌生理盐水调节菌液od
600
＝0.8，取100μl菌悬液加入到5ml冷却至50℃左右的水琼脂培养基中，混匀后，立即将悬浮液倒在氯仿蒸汽灭活的放线菌pda平板上，铺成均匀的薄层，在28℃继续培养2天，测量抑菌圈直径。
[0091]
结果表明，菌株y274对柑橘溃疡病菌有明显抑制效果，抑菌圈直径为22.56mm，对其他8种植物病原细菌没有抑制作用(表6和图9)。
[0092]
表6菌株y274对植物病原细菌生长抑制
[0093][0094]
实施例4菌株y274对小麦茎基腐病温室防效
[0095]
将假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum，简写fp)菌液接入玉米面培养基中，置于28℃培养箱培养待菌丝长满(10天左右)后取出，将长满病菌的玉米面培养基与栽
培基质(营养土：蛭石＝1：1，体积比)按照1：30的质量比混合均匀，制成菌土；将y274菌株接种到pda液体培养基中，28℃、150rpm摇培5天制备y274菌液；期间，将小麦种子用纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿，置于28℃培养箱中催芽，隔天用清水浸湿一次，培养48h左右待种子露白；挑选大小均匀且饱满露白一致的种子，将y274发酵液原液浸泡小麦种子3h后播种于装菌土的花盆中，以无菌生理盐水浸泡种子接种菌土作阴性对照，以50％多菌灵可湿性粉剂稀释500倍浸泡种子接种菌土作阳性对照，每盆播种10颗种子，每个处理6个重复，出苗后21天调查发病情况，调查病情指数和发病率并计算防治效果。
[0096]
小麦茎基腐病病情分级标准按照下面进行统计：
[0097]
0级：植株未发病；
[0098]
1级：地中茎变褐或小麦第一叶鞘表现轻微症状；
[0099]
3级：第一叶鞘变褐，但第一叶鞘未变黑；
[0100]
5级：第一叶鞘变黑或第二叶鞘变褐；
[0101]
7级：第三叶鞘变褐或小麦因发病而生长缓慢或接近死亡；
[0102]
9级：小麦植株因病死亡。
[0103][0104][0105]
小麦幼苗感染假禾谷镰刀菌(fp)出现了明显的茎基腐病发病症状，植株茎基部变褐，根部明显变短，发病率达到了100％，病情指数达到25.93。结果如图10所示，y274表现出良好的防治效果，与对照相比，y274处理组的小麦幼苗发病率显著降低了43.3％，病情指数下降为11.5，同时y274对小麦茎基腐病的防效达到了55.7％。
[0106]
实施例5菌株y274黄瓜根腐病的温室防效
[0107]
将尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum，简写fo)和串珠镰刀菌(fusariummoniliforme，简写fm)菌液接入玉米面培养基中，置于28℃培养箱培养待菌丝长满(10天左右)后取出，将长满病菌的玉米面培养基与栽培基质(营养土：蛭石＝1：1体积比)按照1：30的质量比混合均匀，制成菌土；将y274菌株接种到pda液体培养基中，28℃、150rpm摇培5天制备y274菌液；期间，将小麦种子用纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿，置于28℃培养箱中催芽，隔天用清水浸湿一次，48h左右待种子露白，挑选大小均匀且饱满露白一致的种子，将y274发酵液原液浸泡小麦种子30min后播种于装菌土的花盆中，以无菌生理盐水浸泡种子接种菌土作阴性对照，以50％多菌灵可湿性粉剂稀释500倍浸泡种子接种菌土作阳性对照，每盆播种10颗种子，每个处理6个重复，出苗后21天调查发病情况，调查病情指数和发病率并计算防治效果。
[0108]
黄瓜根腐病病情分级标准按照下面进行统计：
[0109]
0级：无症状；
[0110]
1级：主根轻微变褐色，有侧根或茎基部或有黄色病斑，植株长势正常；
[0111]
3级：主根出现腐烂，很少侧根或茎基部有病班，植株轻微矮化，不萎蔫；
[0112]
5级：主根腐烂，无侧根或茎基部出现腐烂；植株萎蔫长势弱，植株明显矮化；
[0113]
7级：根系、茎基部完全腐烂，植株死亡。
[0114][0115][0116]
黄瓜幼苗感染尖孢镰刀菌出现了明显的根腐病发病症状，根部腐烂，植株明显矮化，发病率达到100.0％，病情指数达到72.4。结果如图11显示，菌株274表现出良好的防治效果，与对照相比，菌株y274处理组黄瓜幼苗的病情指数下降为38.6，温室防效达到46.8％，与多菌灵处理组无显著差异。同时，感染串珠镰刀菌的黄瓜幼苗也出现了明显的根腐病发病症状，植株明显矮化且萎蔫，发病率达到100.0％，病情指数达到69.5。如图12所示，y274表现出良好的防治效果，与对照相比，菌株y274处理组黄瓜幼苗的病情指数下降为52.9，温室防效达到了24.0％，与多菌灵处理组无显著差异。
[0117]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。