一种抗雌三醇的单克隆抗体、检测试剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及快速生物检测技术领域，具体涉及一种抗雌三醇的单克隆抗体、检测试剂及其应用。


背景技术：

2.雌三醇（estriol，e3）是雌二醇和雌酮的代谢产物，非妊娠期其值很低，主要由肝脏合成；妊娠期主要由胎儿胎盘合成，合成后通过母体血循环，在肝脏代谢，和硫酸或葡萄糖醛酸结合形成结合型e3，从尿排出。环境中主要通过生物富集作用进入食物链，进而造成食品的污染，而后通过食物链间接进入人体，干扰机体内分泌功能，引起内分泌失调，对生态环境以及人类健康安全的潜在危害性不可忽视。
3.目前，测定雌三醇残留的方法主要包括气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，gc-ms）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，hplc）、酶联免疫吸附试验（elisa）、胶体金免疫层析试纸法等。其中gc-ms和hplc灵敏度高、选择性好等优点，但所需仪器设备昂贵，检测活动受到一定限制。elisa是测定雌三醇较常用的方法之一，特异性强、灵敏度高、分析速度快，可以一次测定多个样品，在实际的检测活动中使用较为普遍。胶体金和荧光免疫免疫层析法除特异性强以外，灵敏度较高，还具有成本低、操作简便、检测场景宽泛等特点，也是实际应用较多的检测方法。但由于同类分子的相似性，雌三醇的elisa和胶体金免疫检测方法容易对结构相似的化学物质产生一定的交叉反应，影响实验的准确度。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供一种抗雌三醇的单克隆抗体、检测试剂及其应用，具体包括如下技术方案：第一方面，本发明提供一种抗雌三醇的单克隆抗体，所述单克隆抗体含有名称为vh的重链可变区和名称为v
l
的轻链可变区，所述vh和v
l
均由互补决定区和框架区组成；所述互补决定区由cdr1、cdr2和cdr3组成；所述单克隆抗体的vh的cdr1的氨基酸序列如seq id no. 1中第85-89位所示；所述单克隆抗体的vh的cdr2的氨基酸序列如seq id no. 1中第104-120位所示；所述单克隆抗体的vh的cdr3的氨基酸序列如seq id no. 1中第153-164位所示；所述单克隆抗体的v
l
的cdr1的氨基酸序列如seq id no. 2中第30-42位所示；所述单克隆抗体的v
l
的cdr2的氨基酸序列如seq id no. 2中第58-64位所示；所述单克隆抗体的v
l
的cdr3的氨基酸序列如seq id no. 2中第99-107位所示。
5.第二方面，所述单克隆抗体的vh的氨基酸序列如序列表中seq id no. 1所示；所述单克隆抗体的v
l
的氨基酸序列如序列表中seq id no. 2所示。
6.第三方面，编码所述单克隆抗体的vh的核苷酸序列如序列表中seq id no. 3所示；
编码所述单克隆抗体的v
l
的核苷酸序列如序列表中seq id no. 4所示。
7.第四方面，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链为igg1型，轻链为λ型。
8.第五方面，本发明提供一种抗雌三醇的单克隆抗体在制备检测雌三醇的试纸条或试剂盒中的应用。
9.优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条；优选地，所述试剂盒为间接竞争elisa检测试剂盒。
10.本发明实施例具有如下优点：试验证明，本发明提供的单克隆抗体在制备用于检测雌三醇的试剂盒中，对雌三醇激素其他结构类似物均无明显交叉反应，具有良好的特异性和更高的灵敏度。
附图说明
11.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
12.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
13.图1为本发明实施例提供的采用间接竞争elisa方法检测抗雌三醇单克隆抗体灵敏度的rida soft四参数法ic
50
曲线图；图2为本发明实施例提供的抗雌三醇的单克隆抗体重链可变区核苷酸序列同源性分析图；图3为本发明实施例提供的抗雌三醇的单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列同源性分析图；图4为本发明实施例提供的抗雌三醇的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列同源性分析图；图5为本发明实施例提供的抗雌三醇的单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列同源性分析图；图6为本发明实施例提供的检测雌三醇试纸条的结构示意图；图7为图6所示结构的俯视图；图8为本发明实施例提供的微孔试剂的结构示意图。
14.图中：1-吸水纸；2-硝酸纤维素膜；3-样品垫；4-质控线；5-检测线；6-底板；7-试纸条；8-雌三醇单克隆抗体-胶体金标记物；9-微孔塞；10-微孔试剂。
具体实施方式
15.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明
书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、雌三醇人工抗原的合成
16.本实施例提供一种雌三醇人工抗原的合成路线，具体步骤为：取4.8 mmol/l（1.4 g）雌三醇于100 ml圆底烧瓶中，加入20 ml无水二甲基亚砜（dmso），室温条件下搅拌，使得原料溶解，再加入12.5 mmol/l（0.7 g）的koh。取9.6 mmol/l（1.3 g）溴乙酸，室温条件下反应2 h。加入50 ml冰水，用乙酸乙酯萃取回收没有反应的雌三醇（重复三次）。水相用2 mol/l的hcl调节ph至3.0左右，出现大量白色沉淀。点薄层层析硅胶板监控反应（展开剂甲醇∶氯仿=1∶5，雌三醇rf=0.7，产物rf=0.1）。将水相抽滤，后用酸性冰水洗涤滤渣3次，得到白色固体粉末。点板发现仍有少量原料存在，200~300目硅胶过柱，展开剂甲醇∶氯仿=1∶10，蒸干溶剂后得到产物的质量为0.4 g，产率22%。
17.称取半抗原0.1 mmol溶于0.5 ml dmf中，搅拌加入0.0512 g（0.2 mmol）dcc和0.023 g（0.2 mmol）nhs，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为a液。称取0.02 g bsa溶于2 ml浓度为0.1 mol/l的pbs（ph值8.0）中，搅拌溶解制备b液。磁力搅拌下，a液逐渐滴入b液中，4℃下反应12 h。离心后，取上清夜，4℃下用pbs透析3天，每天更换4次透析液。得到的人工抗原以1 mg/ml的浓度分装于1 ml离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用。
实施例2、抗雌三醇的单克隆抗体制备
18.本实施例提供抗雌三醇的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1、分泌抗雌三醇的单克隆抗体杂交瘤细胞制备初次免疫：将实施例1中的雌三醇人工抗原与弗氏完全佐剂乳化（1∶1），皮下注射6-8周龄的balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只。从首次免疫时间计算，间隔14-21天进行加强免疫，共加强免疫2次，用弗氏不完全佐剂。每次免疫7-10天后，可眼底静脉采血采用间接elisa方法检测效价，验证免疫效果，结果见表1。第三次免疫后，有抑制且效价达到1∶10000以上时，可进行1次冲击免疫，即腹腔直接注射，用无菌1
×
pbs稀释免疫原，200 μl体系，注射量一般为免疫量或2倍量。三天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌雌三醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
19.表1
20.2、抗雌三醇的单克隆抗体的制备及纯化细胞复苏：取出抗雌三醇单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴锅中速融，提前用15 ml离心管加入10 ml dmem，将融后的细胞放入dmem中，1000 rpm离心5 min，弃去上清，将细胞移入培养瓶内培养。
21.制备腹水：采用小鼠体内诱生法，取健康的balb/c小鼠，注入无菌液体石蜡0.2ml/只，一周左右使用。将扩大培养的阳性单克隆杂交瘤细胞用无菌1
×
pbs制备成细胞悬液，细胞计数后，细胞总量为2
×
106个，注射小鼠腹腔，0.5 ml/只。7-10天后收集腹水，一只小鼠可获得2-5 ml腹水。10000 rpm离心7 min，收取澄清液体后放入-20℃以下冻存，准备纯化。
22.抗体纯化：取腹水（ml）记录腹水名称，离心，记体积。加3 ml ph值4.0 0.06m乙酸乙酸钠缓冲液，混匀5 min，加入10 μl辛酸，4℃搅拌15 min。用注射器通过脱脂棉过滤一次。12000 rpm、15 min 4℃离心，取上清，加入等上清液体积的饱和硫酸铵至终浓度为50 %，边加边搅拌，4℃静置3 h。12000 rpm、15 min 4℃离心，弃上清，向离心管中加入1.8 ml 0.01m pbs（ph值7.2）至沉淀完全溶解。用枪确定总体积，加1/2体积的饱和硫酸铵至浓度为33%，边加边搅拌，4℃过夜。12000 rpm、15 min 4℃离心，弃上清，加0.45 ml 0.01m pbs溶解沉淀。处理透析袋（煮沸5 min，用纯水洗净捡漏）。将溶解后溶液加入透析袋置于0.01m pbs过夜透析。换透析液，一般换2-3次后，收集抗体，再使用protein g预装柱对粗纯化的单抗进行二次纯化，保存于-80℃冰箱。
实施例3、抗雌三醇的单克隆抗体的特性鉴定
23.本实施例提供抗雌三醇的单克隆抗体的特性鉴定，包括灵敏度、特异性、亚类鉴定：1、抗雌三醇的单克隆抗体灵敏度鉴定采用间接竞争elisa方法检测抗雌三醇的单克隆抗体灵敏度。间接竞争elisa步骤为：雌三醇人工抗原按照100 μl/孔进行包被，4℃过夜；加入封闭液200 μl/孔，37℃封闭2h，拍干；每孔加入50 μl梯度稀释的雌三醇人工抗原充分混合均匀；每孔加入50 μl抗雌三醇单克隆抗体，充分混合均匀，37℃孵育1h；弃去酶标板中液体，拍干，300 μl/孔洗涤液洗板，重复4-5次，最后一次洗板后将液体彻底拍干；每孔加入100 μl酶标抗体，充分混合均匀，37℃孵育1h；弃去酶标板中液体，拍干，300 μl/孔洗涤液洗板，重复4-5次，最后一次洗板后将液体彻底拍干；每孔加入100 μl底物溶液，室温避光孵育10min；每孔加入50 μl终止
液终止反应；酶标仪读取450nm波长的od值。计算半数抑制浓度（ic
50
），ic
50
=0.198ppb，结果如表2和图1所示。
24.表2
25.2、抗雌三醇的单克隆抗体特异性鉴定选取雌三醇及其结构类似物进行交叉反应，评价雌三醇单克隆抗体的特异性，在雌三醇人工抗原包被下，对其他结构类似物均无明显交叉反应，特异性良好，结果如表3所示。
26.表3
27.3、抗雌三醇的单克隆抗体亚类鉴定使用鼠源单抗igg类/亚类鉴定用的elisa试剂盒，检测抗雌三醇的单克隆抗体的亚类，结果显示抗雌三醇的单克隆抗体重链为igg1型，轻链为lambda型。
实施例4、抗雌三醇的单克隆抗体可变区基因pcr扩增与序列鉴定
28.本实施例提供抗雌三醇的单克隆抗体可变区基因pcr扩增与序列鉴定，具体步骤如下：1、用rpmi 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳条件下培养分泌雌三醇单克隆抗体的杂交瘤细胞，使细胞数量达到1
×
107时用总rna提取试剂盒（购自天根）提取细胞中的总rna。
29.2、使用反转录试剂盒（购自takara），以步骤1中提取到的总rna为扩增模板合成
cdna第一链。
30.3、设计lambda链，kappa链，heavy链的下游引物及上游通用引物。
31.引物：f:aagcagtggtatcaacgcaga
ꢀꢀꢀꢀꢀ
rκ:aacattgatgtctttggggtagaa
ꢀꢀꢀꢀꢀ
rλ:aatcgtacacaccagtgtgtggg
ꢀꢀꢀꢀꢀ
rh:agggatccagagttccaggt以cdna第一链为模板进行pcr扩增，反应体系为50 μl。模板3 μl，上游引物（10μm）2.5 μl，下游引物（10μm）2.5 μl，2
×
taq酶25 μl，无菌水17 μl。
32.降落pcr反应条件为：98℃ 30s；98℃ 15s，64℃-58℃ 30s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30s；98℃ 15s，56℃ 30s，72℃30s，循环15次；72℃ 7min结束程序。
33.4、pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用pcr产物回收试剂盒（购自天根）回收kappa链，lambda链和heavy链扩增片段，用plb零背景快速克隆试剂盒（购自天根）将回收纯化的目的片段插入plb载体中，转化至dh5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆并进行测序。
34.pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示kappa链未见条带。
35.5、本实施例的抗雌三醇的单克隆抗体可变区基因序列和氨基酸序列如下：（1）抗雌三醇的单克隆抗体重链可变区核苷酸序列（seq id no. 3）：gcagttgggttcaacgcagagtacatggggtctgacagaggagccaagccctggattcccaggtcctcacattcagtgatcagcactgaacacagaccactcaccatggactccaggctcaatttagttttccttgtccttattttaaaaggtgtccagtgtgatgtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtcccggaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagctttggaattcactgggttcgtcaggctccagaaaaggggctggagtggatcgcttacattagtgatgacagtagtaccatctactattcagacacagtgaggggccgattcaccatttccagagacaatcccaagaacaccctgttcctgcaaatgaccagtctaaggtctgaggacacggccatgtattactgtacaagaagatcatgggccccccattactttgctatggactcctggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctgtcaagggctatgcctgcacgt；如图2所示为本发明实施例提供的抗雌三醇的单克隆抗体重链可变区核苷酸序列同源性分析图。
36.（2）抗雌三醇的单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列（seq id no. 4）：aatttgactgttttcaacatgacatcgactctattattccttgctgttcttcatcacttaacaggaagcacagtcaaactgtcttgcaagcgcagcactggtaacattggaagcagctatgtgtactggtaccagcagcatgagggaagatctcccaccactatgatttatgatgatgataagagaccagatggagttcctgataggttctctggctccattgacagctcttccaactcagccttcctgacaatcaataatgtgcagattgaagatgaagctatctacttctgtcagtcttacagtagtggtattaatgttttcggtggtggaaccaagctcactgtcctaggtcagcccaagtccactcccacactcacagtatttccaccttcaactgaggagctccagggaaacaaagccacactggtgtgtctgatttctgatttctacccgagtgatgtggaagtggcctggaaggcaaat；如图3所示，为本发明实施例提供的抗雌三醇的单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列同源性分析图。
37.（3）抗雌三醇的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列（seq id no. 1）：avgfnaeymgsdrgakpwiprsshsvistehrpltmdsrlnlvflvlilkgvqcdvqlvesggglvqpggsrklscaasgftfssfgihwvrqapekglewiayisddsstiyysdtvrgrftisrdnpkntlflqmtslrsed
tamyyctrrswaphyfamdswgqgtsvtvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclsrampar；如图4所示，为本发明实施例提供的抗雌三醇的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列同源性分析图。
38.本发明实施例的抗雌三醇的单克隆抗体vh和v
l
均由互补决定区和框架区组成；互补决定区由cdr1、cdr2和cdr3组成。如表4所示，为抗雌三醇的单克隆抗体的vh的互补决定区氨基酸序列。
39.表4
40.（4）抗雌三醇的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列（seq id no. 2）：nltvfnmtstllflavlhhltgstvklsckrstgnigssyvywyqqhegrspttmiydddkrpdgvpdrfsgsidsssnsafltinnvqiedeaiyfcqsyssginvfgggtkltvlgqpkstptltvfppsteelqgnkatlvclisdfypsdvevawkan；如图5所示，为本发明实施例提供的抗雌三醇的单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列同源性分析图。如表5所示，为抗雌三醇的单克隆抗体的v
l
的互补决定区氨基酸序列。
41.表5
实施例5、雌三醇胶体金检测试纸条的制备
42.如图6-7所示，该试纸条7由吸水纸1、硝酸纤维素膜（nc膜）2、样品垫3、底板6组成；硝酸纤维素膜（nc膜）2上用划膜仪划两条平行带，条带间隔6.5mm，条带宽都约为1mm。其中第一条为质控线4，接近吸水纸1端，第二条为检测线5，接近样品垫3端。质控线4上喷涂羊抗鼠（igg）和万分之一蓝色色素，浓度为1~1.5mg/ml；检测线5上喷涂浓度为0.1~0.5mg/ml的实施例1中合成的雌三醇人工抗原。
43.其制备方法包括：将具有质控线4和检测线5的层析膜，40℃干燥16h后密封，常温下保存。将吸水纸1、nc膜2和样品垫3依次按顺序黏贴在底板6上，样品垫3的始端与nc膜2末端相连，nc膜2的始端与吸水垫1相连，样品垫3的末端与底板6的末端对齐，吸水垫1的始端与底板6的始端对齐。用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4.5mm宽的试纸条7。
44.如图8所示，微孔试剂10具有微孔塞9，微孔试剂10中冻干有单克隆抗体-胶体金标
记物8。
45.取8条裁切好的试纸条7与1条微孔试剂10放入试剂桶中密封，2-8℃保存。
实施例6、检测奶粉中雌三醇的含量
46.称取1g（精确到0.01g）奶粉，倒入离心管中加入8ml纯净水混匀后，配制待测样本1（雌三醇1ppb），待测样本2（雌三醇0.5ppb），待测样本3（雌三醇0ppb），备用。待测样本必须为均匀液体，不能有结块、发酵变质的沉淀块，否则会影响检测结果。
47.用微量移液器吸取200 μl待测样本溶液于微孔试剂中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀，并开始计时。40℃孵育3min后，将实施例5中制备好的试纸条插入微孔中，使之充分浸入溶液中，并开始计时。再次40℃孵育5min后，取出试纸条并根据示意图判定结果，其他时间判定无效。
48.结果判定阴性(－)：c线和t线均显色，t线显色远比c线强，表示样本中不含雌三醇或远低于检出限。
49.阳性(＋)：c线显色；t线显色与c线相同、t线显色比c线弱或者t线不显色，均表示样本雌三醇浓度等于或高于检出限。
50.无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸卡已变质失效。
51.结果显示：待测样本1（雌三醇1ppb）为阳性，待测样本2（雌三醇0.5ppb）为阴性，待测样本3（雌三醇0ppb）为阴性。此结果表明试纸条检测限为1ppb。
52.因此，本发明采用上述一种抗雌三醇的单克隆抗体制备的胶体金检测试纸条，可以提高雌三醇的检测灵敏度。
53.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。