一种高通量超灵敏离心数字蛋白检测方法

1.本发明涉及液滴数字免疫分析技术领域，具体涉及一种高通量超灵敏离心数字蛋白检测方法。


背景技术：

2.通过抗原抗体结合和信号放大的免疫分析方法，能够有效地检测蛋白浓度，在疾病识别、药物检测以及医学诊断领域显示出广阔的应用前景。
3.免疫分析最常用的方法是酶联免疫吸附测定(elisa)，它依靠与表面结合的捕获抗体来检测目标抗原。然而，elisa蛋白检测方法灵敏度不够高，检测极限通常在pm级别，因此其不适用于检测许多临床相关分析物，特别是人全血/血浆中极低丰度的蛋白疾病标志物。
4.近年来，数字免疫分析技术的发展解决了蛋白检测灵敏度的限制，其方法是将稀释的靶抗原分散到单独的区隔中，然后进行独立的单分子反应和数字信号读取，其蛋白检测灵敏度可以比elisa高1000倍。目前主要有两种分配目标抗原的策略来进行数字免疫分析，分别为微孔和液滴。在微孔方法中，免疫复合物被分配到数万个单独的腔室，然后通过荧光信号放大和数字检测“阳性”微孔比例以计算样本中目标抗原的浓度。然而，微孔方法的实施需要复杂的操作步骤，涉及到多步清洗步骤，样本处理通量低等劣势，阻碍了其资源有限的生物实验室或即时检测领域中的扩展应用。基于液滴的数字免疫分析提供了另一种方法，但是该方法不适合洗涤的步骤，且微流控芯片的制备和操作难度都比较大，样本处理通量较低。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的不足，本发明的发明目的在于提供一种具有超灵敏、高通量、免洗等优点的离心数字蛋白检测方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供一种高通量超灵敏离心数字蛋白检测方法，包括以下步骤：
7.(1)将稀释后的靶抗原样本与一对特异性抗体-dna缀合物在室温下进行孵育，得到免疫复合物；
8.(2)向得到的免疫复合物中加入含有dna连接酶、聚合酶、引物和taqman探针的预混缓冲液得到反应溶液，将反应溶液转移到离心液滴生成装置进行离心处理得到均匀液滴乳液，每个液滴中包含一个或零个抗原分子；
9.(3)将得到的液滴转移到pcr仪中进行dna连接和扩增处理，在连接的过程中，与抗原分子结合的一对抗体-dna缀合物产生邻近效应，经过dna连接酶连接后生成完整的代理dna序列，pcr仪对该代理dna序列进行扩增处理，得到包含抗原分子的阳性液滴以及不包含抗原分子的阴性液滴，对阳性以及阴性液滴分别进行计数；
10.(4)根据阳性以及阴性液滴的数量，结合泊松分布方程计算出代理dna序列的浓
度，得到dna拷贝数与输入的抗原浓度的标准曲线。
11.其中，在步骤(1)中，孵育的时间为20～40min。
12.其中，在步骤(2)中，先将所述反应溶液装载到与96孔板的尺寸相匹配的离心微通道液滴生成装置上，再将所述液滴生成装置转移到离心机中进行离心处理。
13.其中，所述离心微通道液滴生成装置包括样本容器、微通道阵列芯片和液滴收集器，所述样本容器内装有所述反应溶液，所述样本容器插入到所述微通道阵列芯片上，所述样本容器和所述微通道阵列芯片固定在所述液滴收集器内，且所述微通道阵列芯片浸没在油相中。
14.其中，所述微通道阵列芯片的制备方法，包括以下步骤：
15.(2.1)以正方形的硅片为基底，在基底的中心和四个边处分别进行刻蚀得到液体的主流道和四个深井；
16.(2.2)环绕着所述主流道的一周刻蚀得到支流道，在所述支流道与每个所述深井之间刻蚀得到多个液滴生成喷嘴及台阶，每个所述深井对应的多个所述液体生成喷嘴及台阶之间相互平行；
17.(2.3)将尺寸相匹配的玻璃密封固定到该硅基芯片上，所述玻璃的中心处开设有与所述主流道相对应的圆柱状深通孔，得到所述微通道阵列芯片，所述样本容器可插入到所述深通孔内并与所述主通道相连通。
18.其中，所述主流道和深井的深度为100～200μm。
19.其中，所述液滴生成通道上靠近所述深井的一端，刻蚀有向外侧开口的喷嘴结构，所述喷嘴结构的宽度为50～90μm，深度为10～20μm，台阶宽度为50～90μm。通过该喷嘴结构，可以使得在外力的作用下，在台阶的边缘处，离心力把液滴切断，根据阶梯乳化法的原理，产生连续均匀的液滴。
20.在本发明中，通过结合离心生成液滴和数字免疫pcr技术，使得蛋白检测具备高通量、超灵敏、免洗、快速且操作简单等特点，通过设计与96孔板的尺寸相匹配的液滴生成装置，能够实现数百个样本同时进行快速离心生成均匀液滴，液滴生成过程不超过三分钟，且样本死体积几乎为零，液滴生成后无需转移步骤即可在pcr仪上进行dna连接与扩增，整个蛋白检测流程具备免洗优点。
附图说明
21.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一同用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
22.图1为本发明实施例中传统流聚焦方法与离心微通道阵列用于液滴生成的速度比较示意图；
23.图2为本发明实施例中微通道芯片的制备过程结构变化流程图；
24.图3为本发明实施例中8英寸硅片的结构示意图；
25.图4为本发明实施例中微通道芯片的制备过程文字示意流程图；
26.图5为本发明实施例中单个微通道芯片的结构以及局部结构示意图；
27.图6为本发明实施例中离心数字蛋白检测方法的步骤流程图；
28.图7为本发明实施例中将蛋白检测转换成dna拷贝数量检测的原理示意图；
29.图8为本发明实施例中离心微通道液滴生成装置的示意图；
30.图9为本发明实施例中离心后液滴乳液的沉积样式示意图；
31.图10为本发明实施例中安装在pcr仪上的液滴收集器的结构示意图；
32.图11为本发明实施例中离心微通道液滴生成装置放置于离心机中的示意图；
33.图12为本发明实施例中pcr循环后单分散液滴显微图；
34.图13为本发明实施例中pcr循环后的液滴直径分布示意图；
35.图14为本发明实施例中不同抗原浓度的阳性液滴荧光显微图；
36.图15为本发明实施例中局部阳性液滴的荧光强度示意图；
37.图16为本发明实施例中抗原浓度与计算的dna拷贝数之间的相关曲线图；
38.图17为本发明实施例中检测人血浆中il-6方法对比示意图；
39.图18为本发明实施例中检测标准抗原样品和临床血浆样品的检测结果曲线；
40.图19为本发明实施例中两种方法的比较结果对比图；
41.图中：1-硅片、2-阵列区域、3-主流道、4-深井、5-支流道、6-液滴生成喷嘴、7-玻璃、8-深通孔、51-液滴收集器、52-样本容器。
具体实施方式
42.以下结合附图对本发明的优选实例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
43.本发明所述的高通量超灵敏离心数字蛋白检测方法，是一种具有超灵敏、高通量、免洗等优点、基于免疫pcr的数字液滴免疫分析技术的检测方法。该检测方法结合数字液滴免疫分析与小型化离心微通道液滴生成装置，能够实现最小0.5μl血浆/血液中的fm检测极限和蛋白定量。
44.dna邻近连接需要一对特异性抗体-dna缀合物与目标抗原结合时产生邻近效应，因此，只有当液滴内存在抗体-抗原结合事件，dna的邻近连接反应才会发生，并将特定的蛋白质检测“转化”为核酸拷贝数检测。抗体抗原孵育、dna连接和扩增反应可以在一锅溶液中进行，这样就不需要对液滴产生前后进行清洗，从而大大降低了用户的操作复杂度。
45.本方案制备了一种离心微通道阵列芯片，可使用实验室现有的离心机以高度并行的方式高效生成乳化液滴。在液滴中进行dna连接与扩增，将单分子蛋白检测“转化”为核酸拷贝数检测，实现微量生物样本中蛋白标志物的超灵敏度高通量检测，以检测血浆中白细胞介素-6(il-6)浓度为例，本方案的检测灵敏度比传统的elisa方法至少高两个数量级，且具有较高的准确性。
46.具体的，离心微通道阵列芯片的设计基于阶梯乳化原理，其是在几何诱导的拉普拉斯压差作用下自发分散流体的一种低剪切力生成液滴方法。与传统的流体聚焦方法不同的是，阶梯乳化产生的液滴的尺寸及单分散性在很大的流速范围内是不变的，这允许使用廉价的泵、甚至粗糙的外力，如离心力。此外，可以将多个液滴生成通道并行到单个芯片上，如图1所示，极大地提高液滴生成的速率。这些特性使得基于阶梯乳化法设计的芯片可以稳健地、低成本集成到小型化的微流控芯片中，并实现大规模生产。
47.具体的，该微通道芯片的制备过程如图2和3所示，图2为结构变化示意图，图3为文字流程示意图，为了增加液滴产生的速率，在一个芯片上集成了16个相同的液滴生成通道。
图4为本实施例中8英寸硅片的结构示意图。选择在一个8英寸的硅片1上构建多个离心微通道阵列，通过连续光刻、干法蚀刻和键合等步骤，同时制备了1000多个芯片，然后用激光切割成单个的离心微通道阵列芯片。在区域2的中心和四个边处分别进行刻蚀，形成位于中心的主流道3和位于四个边处的深度为100～200μm的深井4。然后环绕着主流道3的一周刻蚀得到支流道5，在支流道5与每个深井4之间刻蚀得到共16个、每边四个液滴生成通道6，每条边处的四个液滴生成通道6相互保持平行。随后用尺寸相匹配的玻璃7将阵列区域2的通道进行密封，玻璃7上开设有与主流道3相对应的圆柱状深通孔8。
48.用显微镜对离心微通道阵列的结构进行表征，如图5所示，每个液滴生成通道6都形成有槽型的喷嘴。具体的，在液滴生成通道6上靠近深井4的一端，刻蚀有向外侧开口的喷嘴结构，该喷嘴结构的宽度为50～90μm，深度为10～20μm，台阶宽度为50～90μm。通过该喷嘴结构，可以使得在外力作用时，在台阶的边缘处，离心力把液滴切断，并根据阶梯乳化法的原理，连续产生均匀的液滴。原则上，可以通过调整液滴生成通道6的尺寸来改变液滴的大小，在本实施例中，喷嘴的宽度为70μm、深度为18μm、阶梯长度为85μm。
49.如图6所示，基于上述的离心微通道阵列芯片，本发明所述的高通量超灵敏离心数字蛋白检测方法，包括以下步骤：
50.(1)将稀释后的靶抗原样本与一对特异性抗体-dna缀合物在室温下进行孵育20～40min，得到免疫复合物；
51.(2)向步骤(1)中得到的免疫复合物中加入含有dna连接酶、聚合酶、引物和taqman探针的预混缓冲液得到反应溶液，将反应溶液转移到离心液滴生成装置进行离心处理得到均匀液滴乳液，每个液滴中包含一个或零个抗原分子；
52.(3)将步骤(2)中得到的液滴转移到pcr仪中进行dna连接和扩增处理，在连接的过程中，与抗原分子结合的一对抗体-dna缀合物产生邻近效应，经过dna连接酶连接后生成完整的代理dna序列，随后pcr仪对该dna序列进行扩增处理，得到包含抗原分子的阳性液滴以及不包含抗原分子的阴性液滴，对阳性以及阴性液滴分别进行计数；
53.(4)根据步骤(3)中阳性以及阴性液滴的数量，结合泊松分布方程计算出代理dna序列的浓度，得到dna拷贝数与输入的抗原浓度的标准曲线。
54.在上述技术方案中，如图7所示，图7为实施例中将蛋白检测转换成dna拷贝数量检测的原理示意图，该过程结合了邻近dna连接化学和液滴内核酸扩增的数字pcr技术，通过设计一对具有高亲和力和特异性的抗体-dna缀合物来捕获目标抗原，在抗体-抗原结合发生时，两条dna链靠近，并在dna连接酶的作用下发生连接反应，由此产生一个完整的dna序列，作为目标抗原的代理，该代理dna序列可以进行pcr扩增，由此可以得到的效果是，将单分子蛋白检测“转换”成dna拷贝数的测量，且无需在液滴生成前后进行清洗步骤，所有的反应都可以在一锅溶液中进行。
55.此外，在步骤(2)中，先将反应溶液装载到与96孔板的尺寸相匹配的离心微通道液滴生成装置中，再将其转移到离心机中进行离心处理，由此可实现数百个样本同时进行离心生成均匀液滴，使得本方案具备了很高的样本处理通量以及可扩展性，可实现大规模蛋白检测应用。
56.该离心微通道液滴生产装置包括样本容器52、离心微通道阵列芯片以及液滴收集器51，液滴收集器51内预置有含2wt％表面活性剂的轻质矿物油，其作为连续相预先加入到
液滴收集器51中，然后再将装配好样本容器51的微通道阵列芯片浸入到油相中，并通过移液器加入反应溶液。在离心后，反应溶液能够完全转化为液滴，死体积几乎为零，具有高通量性，且多个样品的液滴生成过程不超过三分钟，在液滴生成后，无需多余的液滴转移步骤，可以直接在传统的pcr仪上使用液滴收集器进行pcr扩增，具备免洗优点。
57.在本实施例中，如图8所示，液滴收集器51的尺寸与96孔板一致，上述的所有组件包括离心微通道芯片、样本容器52以及液滴收集器51都可以通过传统的微加工技术或注射成型大规模制造。本方案所述的离心微通道芯片生产成本低、质量稳定可靠，并且能够实现可行的大规模生产。如图9所示，为本实施例中离心后液滴乳液的沉积样式示意图，图10为本实施例中安装在pcr仪上的样本容器的结构示意图。
58.基于本方案所述的离心微通道芯片，如图11所示，在离心机中使用两个96孔板可以同时乳化多达192个样品。液滴在整个pcr热循环中保持稳定，不发生破碎或融合。图12为pcr后的单分散液滴显微镜图像。图13为pcr循环后的液滴直径分布示意图，如图13所示，当离心力为150g时，液滴的平均直径为68.7μm，变异系数较低(cv＜3％)。
59.在本实施例所述的离心数字蛋白检测方法的步骤(3)中，可以采用荧光显微镜来观测“阳性”以及“阴性”的液滴，分别表明存在抗原分子和不存在抗原分子的事件。如图14所示，阳性液滴的荧光强度是阴性液滴的四倍以上。如图15所示，随着靶抗原浓度的逐渐增加，阳性液滴的比例也在不断增加，此时结合泊松分布方程可以计算出dna序列拷贝数，如图16所示，从而得到dna拷贝数与输入的抗原浓度的标准曲线。从曲线中可以看出，本方案相较于传统的本elisa方法，检测灵敏度至少高两个数量级，蛋白检测极限值为0.064pg/ml。
60.以il-6作为靶抗原对临床上人血浆的检测性能进行了表征，并将结果与医院实验室使用的流式elisa方法进行了比较，如图17所示。随机选取7份新鲜人体血浆样本，其靶标il-6的准确浓度未知，根据检测结果分别绘制标准样品(黑色方块)和稀释血浆样品(红色圆圈)中dna拷贝数与il-6浓度之间的曲线图，结果如图18所示，可以看出，两条曲线能够很好地重合，并表现出相似的趋势，即dna拷贝数随着il-6浓度的增加而增加。如图19所示，结果表明，本方案所述的对临床血浆中il-6检测结果具有良好的准确性和较高的灵敏度。
61.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。