mRNA及包含其的新冠病毒mRNA疫苗和制备方法

mrna及包含其的新冠病毒mrna疫苗和制备方法
技术领域
1.本发明涉及核酸疫苗技术领域，尤其是涉及一种mrna及包含其的新冠病毒mrna 疫苗和制备方法。


背景技术：

2.在全球范围内普及安全有效的疫苗是阻击新冠病毒的最强力武器，也是终结新冠病 毒肺炎疫情的关键。虽然大部分国家、地区的人民已经广泛接种了现有上市或获批紧急 使用的新冠病毒疫苗，并且疫苗的接种也在一定程度上建立起短时或局部的群体免疫， 但至今新冠病毒仍未彻底消灭，由新冠病毒持续引发的公共卫生危机也仍未解除。
3.新冠病毒肺炎疫情的频发突袭与新冠病毒自身突变性质密切相关。
4.新冠病毒omicron突变株的刺突蛋白上出现37个突变位点，是目前突变最多的毒 株。受体结合区出现g339d、s371l、s373p、s375f、k417n、n440k、g446s、s477n、 t478k、e484a、q493r、g496s、q498r、n501y、y505h，共15个突变位点。与之前 的全球voc变体相比，omicron共有k417n、t478k、n501y突变，但也存在g339d、 n440k、s447n、q498r等额外的突变。omicron突变株在保留ace2受体结合能力的 同时，增强了对中和抗体的逃逸能力。因此，新冠病毒疫苗需要及时更新，以抵御新冠 病毒omicron突变株病毒。
5.mrna疫苗具有研发周期短、产能增速快等技术优势，更适合新冠病毒及其突变株 病毒的预防性疫苗的应急研制与开发。研发自主可控的可预防新冠病毒omicron突变株 感染的mrna疫苗，不仅对新冠病毒肺炎疫情的防控具有重要意义，还能丰富我国的 疫苗储备。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于丰富现有技术中新冠病毒疫苗的种类，提供一种针对新冠病毒 omicron突变株的mrna疫苗、药物组合物和试剂盒。新冠病毒的mrna疫苗的设计 难度较高，尤其是病毒完整和高效表达的实现会受到多种因素的影响。本发明提供的 mrna在体外细胞中均能够表达抗原蛋白，且免疫小鼠后能够检测到高效价的新冠病毒 omicron突变株假病毒中和抗体，具有良好的免疫原性，对于新型冠状病毒omicron突 变株病毒的预防有重要意义。
8.本发明提供的技术方案如下：
9.在第一方面，本发明提供了一种包含编码新冠病毒omicron突变株的抗原性多肽或 其抗原性片段、变体或衍生物的mrna，所述抗原性多肽或其抗原性片段至少包含新冠 病毒s蛋白的受体结合结构域(receptor binding domain，rbd)片段。
10.在本发明中，新冠病毒与新型冠状病毒同义，是指严重急性呼吸系统综合症冠状病 毒(sars-cov-2)，其中，s蛋白是指表面刺突(s)蛋白，s蛋白质(spike)由于是介导病 毒入侵的主要蛋白质，也是中和抗体的主要靶点。s蛋白包含两个亚基，s1和s2。其 中，s1主要
包含有受体结合区(rbd结构域)，冠状病毒正是通过rbd结构域与细胞表 面受体结合来感染细胞。
11.在一个实施方案中，所述抗原性多肽或其抗原性片段包含s蛋白的信号肽、ntd和 rbd。在本发明中，ntd即n-terminal domain，为新型冠状病毒s蛋白n端的一段序 列，冠状病毒的ntd可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，帮助病毒对宿主细胞的粘附 和入侵，介导病毒入侵宿主细胞，该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。s蛋白 的ntd和rbd在结构上相邻。
12.本发明中，所述mrna至少包含编码新冠病毒的rbd的mrna序列；优选地， 所述mrna包含至少编码新冠病毒的的信号肽、ntd和rbd的mrna序列。
13.在一个实施方案中，所述mrna的核苷酸序列包含如seq id no.1至seq id no. 4所示的序列中的一条或多条，或者与seq id no.1至seq id no.4所示的序列之一具 有90％以上同源性的且功能相同的序列。
14.本发明中，新冠omicron突变株mrna的cds由优化的密码子构成，在细胞水平 可以高效表达蛋白(转染细胞后均表达较高水平的蛋白)，其中，seq id no.4所示的 序列在seq id no.1至seq id no.4所示的序列中蛋白表达的水平最高。将本发明的 mrna制备成疫苗(表达s蛋白rbd区的疫苗)后，经小鼠免疫验证，有效性好，具 有免疫原性。
15.在一个优选的实施方案中，所述mrna的核苷酸序列与seq id no.1至seq idno.4所示的序列之一具有95％以上同源性的且功能相同的序列。
16.在一个更优选的实施方案中，所述mrna的核苷酸序列与seq id no.1至seq idno.4所示的序列之一具有99％以上同源性的且功能相同的序列。
17.本发明所述的“同源性”与“同一性”同义，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列 的方面，使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、 99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的相似度，且依然具有与原氨基酸序列或核甘薯序列相同 的功能。
18.在一个实施方案中，编码新冠病毒的s蛋白中的信号肽、ntd和rbd结构域的 mrna的核苷酸序列如seq id no.1至seq id no.4所示的序列中的任一条所示。
19.在一个实施方案中，所述mrna包含5’帽子结构、5’非编码区、3’非编码区和多聚 腺苷酸尾。所述mrna还包含：5’帽子结构、5’非编码区(5’utr序列)、3’非编码区 (3’utr序列)和多聚腺苷酸尾以及限制性内切酶位点；其中，所述mrna按照5’到 3’方向依次包括如下元件：5’帽子结构，5’utr序列，新冠病毒的抗原性多肽或其抗原 性片段、变体或衍生物，3’utr序列和多聚腺苷酸尾序列。
20.本发明的mrna包括抗原编码区和抗原编码区以外的骨架部分，由1083骨架代码 序列以及不同抗原编码序列构成。本发明中，所述1083骨架代码序列由5
’‑
cap结构、 5
’‑
utr、3
’‑
utr以及poly a所构成。
21.在本发明的序列seq id no.1至seq id no.4中，所述5
’‑
utr的序列为序列表 中序列的第1至46位的序列；所述3
’‑
utr的序列为序列表中序列的第815至940位的 序列；所述poly a的序列为序列表中序列的第941至1060位的序列；所述目的基因的 mrna为序列表中序列的第56至808位的序列。
22.在本发明所提供的序列中，第47-52位以及第809-814位为酶切位点序列，53-55 位为kozak序列。本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同的酶切 位点、kozak序列或将其删除，例如kozak序列可替换为gcc、acc、gccacc或 gccann。因此，本发明的序列涵盖与本发明仅在第47-55位以及第809-814位置序列 不同的其他所有序列。
23.本发明中，mrna-1080a(seq id no.1所示，序列1)，mrna-1080b(seq idno.2所示，序列2)，mrna-1080c(seq id no.3所示，序列3)和mrna-1080d(seqid no.4所示，序列4)作为疫苗的活性成分。
24.在第二方面，本发明提供了前述mrna对应的核酸分子或其所编码的蛋白。所述 基因(即dna分子)的核酸序列包含seq id no.5至seq id no.8所示的序列中的一 条或多条。
25.在第三方面，本发明提供了前述核酸分子或蛋白相关的生物材料，所述生物材料包 括下述b1)至b6)中的任一种：
26.b1)编码所述蛋白的核酸分子，所述核酸分子为编码前述mrna的dna分子；
27.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
28.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体，或含有b2)所述表达盒的重组载体；
29.b4)含有b1)所述核酸分子的重组质粒，或含有b2)所述表达盒的重组质粒；
30.b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物，或含有b2)所述表达盒的重组微生物，或 含有b3)所述重组载体的重组微生物；
31.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因细胞系、 或含有b3)所述重组载体的转基因细胞系。
32.在本发明中，可以将所述蛋白的编码序列通过基因工程技术克隆到质粒中，进行体 外转录，用于mrna合成；优选包括：1)将mrna对应的dna片段克隆至表达质粒 获得重组质粒；2)将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中 提取质粒，并进行pcr扩增获得体外表达mrna的dna模板；3)构建包括所述dna 模板的rna体外合成体系进行mrna的体外合成获得所述活性成分mrna。在本发明 中，所述dna片段的具体序列可根据碱基互补配对原则确定。
33.在一个实施方案中，在体外转录后，需对转录rna产物进行加帽反应，获得的 mrna的5’端连接有帽子(cap-1)结构。
34.在一个实施方案中，所述重组载体为载体pcdna3.1。具体地，mrna疫苗序列的 dna模板构建在载体pcdna3.1( )的多克隆位点区域nhei
‑‑
xhoi位点之间得到重组 质粒，利用载体序列上的t7启动子序列，在t7转录酶作用下启动体外转录。
35.在一个实施方案中，将重组载体转入表达所述病毒蛋白的细胞中进行表达，优选地， 细胞选自hek293t细胞、293ftx细胞、hek293a细胞。
36.在第四方面，本发明还提供了一种mrna-脂质复合物，所述mrna-脂质复合物包 含递送载体以及前述的mrna；
37.优选地，所述递送载体包括可离子化脂质体、阳离子脂质体、可离子化蛋白、阳离 子蛋白、可离子化聚合物、阳离子聚合物、可离子化胶束、阳离子胶束、可离子化脂质 纳米粒、阳离子脂质纳米颗粒中的任一种；
38.更优选地，所述递送载体选自可离子化阳离子脂质体(lpx)或可离子化脂质纳米 粒(lnp)。
39.在一个实施方案中，所述mrna-脂质复合物选自可离子化脂质-mrna复合物、阳 离子脂质-mrna复合物或新型可阳离子化脂质-mrna复合物、可离子化脂质-mrna 脂质纳米粒、阳离子脂质-mrna脂质纳米粒或新型可阳离子化脂质-mrna脂质纳米粒；
40.优选地，所述可离子化脂质-mrna复合物、阳离子脂质-mrna复合物或新型可阳 离子化脂质-mrna复合物还包含鱼精蛋白、peg化脂质、1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷酸乙 醇铵和/或胆固醇。
41.优选地，所述可离子化脂质-mrna复合物纳米粒、阳离子脂质-mrna脂质纳米粒 或新型可阳离子化脂质-mrna脂质纳米粒还包括peg化脂质、1,2-二硬脂酰-sn-甘 油-3-磷酸胆碱和胆固醇。
42.在一个实施方案中，所述mrna-脂质复合物包括由mrna结合鱼精蛋白制备脂质 多聚复合物、由mrna结合可离子化脂质于制备的脂质纳米颗粒lnp-mrna、由mrna 结合可离子化脂质yk009制备的新型可阳离子化脂材-mrna脂质纳米粒。
43.在一个实施方案中，所述mrna-脂质复合物的制备方法包括：将所述的mrna与 可离子化脂材混合后用脂质包装；其中，可离子化脂材可以是mc3、sm102、alc0315、 lipid 5、dotap等；
44.在一个优选的方案中，所述制备方法包括将可离子化脂材与1,2-二硬脂酰-sn-甘 油-3-磷酸胆碱、dmg-peg2000溶解后混合，然后将mrna与所述混合得到的脂材混 合。
45.在一个具体的实施方案中，mrna-脂质复合物的制备方法包括：将鱼精蛋白的醋酸 钠缓冲液溶液与mrna(如seq id no.4所示)的柠檬酸缓冲液溶液混合制备出鱼精 蛋白-mrna复合物；然后将可离子化阳离子脂材(如sm102)、1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷 酸乙醇铵(dope)、dmg-peg2000按质量比混合，与前述鱼精蛋白-mrna复合物再 进行混合。在具体的实施方案中，还包括混合后在缓冲液中稀释以及离心超滤浓缩等步 骤。
46.在第五方面，本发明提供了一种新冠病毒mrna疫苗，其包含前述的mrna、前 述的生物材料或前述的mrna-脂质复合物；
47.优选地，所述mrna疫苗诱导细胞产生病毒样颗粒；和/或，所述mrna疫苗还包 括佐剂。
48.术语“佐剂”指在细胞水平或体液水平增加、刺激、活化、加强或调节针对组合物 的活性成分的免疫应答的试剂。
49.本发明人通过大量实验，最终发现本发明特定的框架序列与编码序列的特定组合能 够使得所制备的疫苗取得较好的免疫原性和稳定性。
50.所述新冠病毒mrna疫苗为针对新冠病毒omicron突变株的疫苗，其施用对象包 括但不限于哺乳动物和人。所述的哺乳动物包括但不限于猴、骆驼、牛、马、山羊、绵 羊、猪、猫、狗、兔、小鼠或大鼠等。优选地，所述疫苗为传染病疫苗，用于预防新冠 病毒omicron的感染。本发明所述的“预防”指在疾病开始发展之前或之后通过施用本 发明所述的产品来避免症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。
51.在第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含前述的mrna、前述的生物材 料或前述的mrna-脂质复合物和/或前述的mrna疫苗，以及任选地药用载体。本发明 提供了包含前述的mrna、前述的生物材料或前述的mrna-脂质复合物和/或前述的 mrna疫苗的产品在制备预防和/或治疗covid-19型冠状病毒感染的药物中的应用。
52.在第七方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含前述的mrna、前述的生物材料或 前述的mrna-脂质复合物、前述的mrna疫苗和/或前述的药物组合物。
53.本发明中，术语“中和抗体”一般是指微生物入侵人体后，会刺激产生很多种抗体， 但只有部分抗体能迅速识别微生物，并在其入侵人体细胞前将其“抓住”，保护人体不 被感染。这个过程就叫中和作用，发挥作用的抗体就是中和抗体。
54.在本发明中，疫苗活性成分mrna-1080d结合鱼精蛋白制备脂质多聚复合物lpx
‑ꢀ
mrna疫苗制剂可实现体外细胞新型冠状病毒omicron突变株病毒刺突蛋白受体结合 域rbd抗原表达；疫苗活性成分mrna-1080d由可离子化脂质制备脂质纳米颗粒lnp
‑ꢀ
mrna疫苗制剂可实现体外细胞新型冠状病毒omicron突变株病毒刺突蛋白受体结合 域rbd抗原蛋白表达；疫苗活性成分mrna-1080d由可阳离子化脂质yk009制备脂 质纳米颗粒lnp-mrna疫苗制剂可实现体外细胞新型冠状病毒omicron突变株病毒刺 突蛋白受体结合域rbd抗原蛋白表达。
55.有益效果：
56.mrna疫苗的成功研制很大程度上取决于mrna自身序列的优化，本发明提供的 作为疫苗活性成分的mrna由1083骨架代码序列以及不同抗原编码序列构成，mrna 序列是经过密码子优化后的mrna，通过转染通过商用转染试剂包载转染hek293t细 胞，发现其各自单独在细胞中都可以大量表达抗原蛋白，即在体外细胞具备很好的抗原 表达效能。其中表达新冠病毒omicron突变病毒刺突蛋白受体结合域(rbd)抗原蛋白效 能最优的疫苗活性成分为mrna-1080d(seq id no.4所示)。
57.本发明所提供的mrna疫苗可在体内实现稳定安全的表达和有效激活免疫反应， 可引起中和抗体应答，在免疫的小鼠血清中可检测到高效价的新型冠状病毒omicron突 变株假病毒中和抗体平均nt
50
分别为～1:1038和～1:1269，说明mrna-1080d具备良好 的免疫原性，可发挥疫苗的作用。
附图说明
58.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实 施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的 前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
59.图1为本发明提供的新冠病毒omicron突变株病毒mrna疫苗活性成分mrna
‑ꢀ
1080a、mrna-1080b、mrna-1080c和mrna-1080d的结构示意图；
60.图2为本发明的实施例1中的质量分析结果图；
61.图3为本发明的实施例1中的细胞转染蛋白表达检测结果图；
62.图4为本发明的实施例1中的疫苗制剂粒径电位表征图；
63.图5为本发明的实施例4中的细胞转染蛋白表达检测结果图；
64.图6为本发明的实施例4中的免疫小鼠血清新冠病毒omicron突变株假病毒中和 抗体nt
50
的检测结果图。
具体实施方式
65.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实 施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护 的范围。
66.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所 描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无 特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结 果取平均值。
67.实施例1、新冠病毒omicron突变株病毒(新冠omicron突变株)mrna疫苗的 序列设计、制备和体外细胞的抗原表达检测
68.一、新冠omicron突变株mrna疫苗的序列设计
69.新冠omicron突变株mrna疫苗的序列设计采用优化的mrna骨架代码序列，加 强mrna的稳定性与蛋白表达效能。新冠omicron突变株mrna的cds由优化的密 码子构成，决定了新冠omicron突变株刺突蛋白(s)受体结合域蛋白(rbd)的氨基 酸序列。
70.为实现mrna的体外转录，将新冠omicron突变株mrna疫苗序列模板构建在载 体pcdna3.1( )的多克隆位点区域nhei
‑‑
xhoi位点之间得到重组质粒，利用载体序列 上的t7启动子序列，在t7转录酶作用下启动体外转录。
71.由此，设计优化得到新冠omicron突变株mrna疫苗活性成分mrna-1080a、 mrna-1080b、mrna-1080c和mrna-1080d。如图1所示：新冠omicron突变株mrna 疫苗mrna-1080a(图1中1所示；序列1)、mrna-1080b(图1中2所示；序列2)、 mrna-1080c(图1中3所示；序列3)、和mrna-1080d(图1中4所示；序列4)的 序列如序列seq id no.1至seq id no.4所示。
72.mrna-1080a序列(seq id no.1)：
73.自5’端第1至46为5
’‑
utr，第56至808为cds-a(编码新冠omicron突变株s 蛋白的信号肽的1-14位氨基酸、ntd的306-318位氨基酸和rbd的319-541位氨基 酸)，第815至940为3
’‑
utr，第941至1060为poly a尾。
74.mrna-1080b序列(seq id no.2)：
75.自5’端第1至46为5
’‑
utr，第56至808为cds-b(编码新冠omicron突变株s 蛋白的信号肽的1-14位氨基酸、ntd的306-318位氨基酸和rbd的319-541位氨基 酸)，第815至940为3
’‑
utr，第941至1060为poly a尾。
76.mrna-1080c序列(seq id no.3)：
77.自5’端第1至46为5
’‑
utr，第56至808为cds-c(编码新冠omicron突变株s 蛋白的信号肽的1-14位氨基酸、ntd的306-318位氨基酸和rbd的319-541位氨基 酸)，第815至940为3
’‑
utr，第941至1060为poly a尾。
78.mrna-1080d序列(seq id no.4)：
79.自5’端第1至46为5
’‑
utr，第56至808为cds-d(编码新冠omicron突变株s 蛋白的信号肽的1-14位氨基酸、ntd的306-318位氨基酸和rbd的319-541位氨基 酸)，第815至940为3
’‑
utr，第941至1060为poly a尾。
80.二、新冠omicron突变株mrna疫苗的体外合成
81.1.将设计的新冠omicron突变株mrna疫苗序列进行dna模板合成，并通过测序验证。
82.2.将步骤1合成的dna模板进行扩增：将dna模板连接到载体pcdna3.1( )的nhei
‑‑
xhoi位点之间，得到重组质粒。将重组质粒转化感受态细胞dh5α，通过对宿主大肠杆菌的培养，得到大量扩增菌体。借助无内毒素质粒大提试剂盒(天根生物科技(北京)有限公司，dp117)提取扩增菌体中扩增的重组质粒。
83.将扩增的重组质粒进行线性化：利用xbai和sapi对提取的重组质粒进行酶切线性化，经纯化得到可用于mrna体外合成的模板，并采用qubit
tm
dsdnabrassaykit(invitrogen，q32850)试剂盒进行定量。
84.3.以步骤2扩增的dna为mrna的体外合成模板，配制表1所示的反应体系，37℃孵育1h进行体外转录，得到大量体外转录rna，并采用qubit
tm
dsdnabrassaykit(invitrogen，q32850)试剂盒进行定量。
85.表1.体外转录反应采用t7-flashscribetmtranscription试剂盒(cellscript，c-asf3507)
[0086][0087][0088]
4、将步骤3体外转录rna产物进行纯化：向转录反应体系中加入1μlrnase-freednasei，37℃孵育15min，以去除体外转录产物体系中的dna模板，得到转录产物。再对得到的转录产物进行纯化，纯化方法如下：
[0089]
(1)向转录产物中加入rnase-freeh2o补足体积200μl；
[0090]
(2)加入200μl混合液a(水饱和酚：氯仿：异戊醇，v:v:v，25:24:1)，涡旋10s，4℃，13800
×
g离心5min，然后将管中上层水相移至新管中；
[0091]
(3)向新管中加入等体积混合液b(氯仿：异戊醇，v:v，24:1)，涡旋10s，4℃，13800
×
g离心5min，然后将管中上层水相移至新管中；
[0092]
(4)向新管中加入等体积5m乙酸铵溶液，涡旋混匀后冰上放置15min后，4℃、13800
×
g离心15min，弃上清；
[0093]
(5)加入70％冰乙醇对rna进行清理后，弃去70％乙醇；加适量rnase-free水(solarbio，r1600)重悬，并采用qubit
tm
rnabrassaykit(invitrogen，q10211)试剂盒进行定量。
[0094]
5.对步骤4得到的rna转录纯化产物进行mrna加帽反应，具体步骤如下：
[0095]
(1)rna变性：取60μg转录纯化产物，65℃孵育15min进行变性处理，然后移 至冰上。
[0096]
(2)mrna加帽反应：加入rna变性产物后，按照表2所示配制反应体系，37℃ 孵育0.5h，得到mrna具有cap 1型结构的加帽产物。
[0097]
表2.mrna的cap 1加帽反应体系配制采用scriptcap
tm
cap 1 capping system 试剂盒(cellscript，c-sccs1710)
[0098][0099][0100]
6.mrna加帽产物纯化：同步骤4。
[0101]
7.mrna的质量分析：
[0102]
采用安捷伦2100生物分析仪和rna nano 6000 assay kit(aglient，5067-1511)对合 成mrna进行质量分析，具体步骤如下：
[0103]
(1)mrna变性：将mrna和mrna ladder，70℃变性2min，然后立即冰浴。
[0104]
(2)准备凝胶：按说明将rna gel matrix加入过滤管中，1500
×
g室温离心10min， 4℃保存备用。
[0105]
(3)准备凝胶-染料混合物：rna染料避光平衡30min，然后涡旋数秒，瞬时离心 后以65:1比例配制凝胶染料混合物，将混合物涡旋混匀，13000
×
g室温离心10min。
[0106]
(4)加载凝胶-染料混合物：使用rna nano芯片之前，调节芯片制备器夹子到最 上方的位置。将rna芯片放入芯片槽，在注明黑色g的孔中加入9μl凝胶-染料混合 物(不要有气泡)；注射器活塞在1ml位置处时关闭注胶器，按压注射器，用夹子固 定30s后再松开，5s后将活塞拉回1ml处的位置；打开注胶器，在其它注明白色g的 孔中加入9μl凝胶-染料混合物。
[0107]
(5)加载marker：在所有样品孔与ladder孔中各加入6μl rna marker。
[0108]
(6)加载ladder与mrna：在标有梯子图样的孔中加入1μl ladder，将mrna加 入到剩余12个孔中(没有用到的孔可用rnase-free water代替)，将芯片放到芯片涡旋 振荡器上，2400r/min振荡1min，然后5min内将芯片放到agilent 2100仪中进行检测。
[0109]
结果如图2至图6所示，结果显示，体外合成的新冠omicron突变株mrna-1080a (图2中1所示)、mrna-1080b(图2中2所示)、mrna-1080c(图2中3所示)和 mrna-1080d(图2中4所示)条带与目标条带一致，浓度分别为2310ng/μl、2180 ng/μl、2280ng/μl和2120ng/μl。
[0110]
三、mrna的细胞转染蛋白表达检测
[0111]
1.接种细胞：将293t细胞(atcc)分别接种于12孔板中，每孔3
×
105个细胞， 37℃，5％co2培养箱中至细胞达到80-90％融合度即可进行转染。
[0112]
2.配制转染复合物：采用transfection kit(mirus，mir 2250)：100 μl opti-mem 1μg mrna 2μl mrna boost reagent 2μl transit-mrna reagent，混匀、 室温静置2-5min形成转染复合物。
[0113]
3.转染细胞：将转染复合物滴加到细胞并上下左右晃动使转染复合物均匀分布， 37℃，5％co2孵育18h后收取细胞，转染前后无需更换细胞培养液。
[0114]
4.提取细胞总蛋白：细胞用pbs清洗两次后，利用细胞裂解液ripa(金普莱， p06m11) 蛋白酶抑制剂100
×
(金普莱，p01c01)，涡旋，以充分裂解细胞。冰浴30 min后，4℃，离心13800
×
g，15min，取上清液。
[0115]
5.细胞总蛋白定量：利用bca蛋白定量试剂盒(金普莱，p06m16)对细胞裂解上 清液中总蛋白进行定量。将细胞裂解上清液与bca工作液混匀，37℃，孵育45min， a562 nm下检测吸光度，并计算细胞总蛋白浓度。
[0116]
6.western blotting(wb)检测目标蛋白表达：利用蛋白电泳预制胶bolt
tm
4to 12％, bis-tris,1.0mm,mini protein gel(invitrogen,nw04120box)电泳(200v，22min)进 行总蛋白(20μg)分离。将凝胶上的分离蛋白在梯度电压(20v，1min；23v，4min； 25v，2min)作用下转移到iblot 2 transfer stacks，pvdf(invitrogen，ib24001)膜上 后，在含5％脱脂奶粉的1
×
tbst中室温摇育，20r/min，封闭1h。
[0117]
新冠omicron突变株刺突蛋白s鼠单抗稀释液(1:2000)，sars-cov-2 spikeantibody，omicron reactive,mouse mab(义翘神州，40592-mm117)，20r/min，室温 摇育2h。用1
×
tbst清洗膜，60r/min，室温摇育10min，并重复3次，以彻底去除一 抗残余。二抗采用辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗鼠igg二抗稀释液(1:10000)， goat anti-mouse igg secondary antibody(hrp)(义翘神州，ssa007)，20r/min，室温 摇育1h。用1
×
tbst清洗膜，60r/min，室温摇育10min，并重复3次，以彻底去除二 抗残余。
[0118]
利用ecl化学发光超敏显色试剂盒(翊圣生物，36208es60)与膜室温避光孵育3 min，在化学发光仪中检测hrp标记的抗体结合抗原。通过曝光显现条带与蛋白marker， pageruler
tm
prestained protein ladder(invitrogen，26617)条带比对，验证目标抗原蛋白 的表达。利用膜再生液(索莱宝，sw3020)去除膜上抗体，再次对膜进行封闭后，孵育 内参抗体，以检测蛋白上样量的一致性。一抗采用β-actin兔单抗稀释液(1:50000)， actb rabbit mab(abclonal,ac038)，二抗采用辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊 抗兔igg二抗稀释液(1:10000)，goat anti-rabbit igg secondary antibody(hrp)(义翘 神州，ssa004)。
[0119]
结果如图3所示，结果显示：体外合成的新冠omicron突变株mrna-1080a、mrna
‑ꢀ
1080b、mrna-1080c和mrna-1080d转染hek293t细胞后，wb均检测到高效表达的 新冠omicron突变株刺突蛋白受体结合域(rbd)蛋白目的抗原。
[0120]
四、新冠omicron突变株mrna疫苗的细胞转染蛋白表达检测
[0121]
1.接种细胞：将293t细胞细胞(atcc)分别接种于12孔板中，每孔3
×
105个细 胞，37℃，5％co2培养箱中至细胞达到80-90％融合度即可进行转染。
[0122]
2.新冠omicron突变株mrna疫苗的制备
[0123]
(1)lpx-mrna-1080d脂质多聚物疫苗制备
[0124]
采用两步法制备lpx-mrna-1080d脂质多聚物疫苗。
[0125]
将鱼精蛋白的25mm醋酸钠缓冲液(ph 5.2)溶液与mrna-1080d的10mm柠檬 酸缓冲液(ph 4.0)溶液按体积比1:5(鱼精蛋白：mrna)以12ml/min的流速在迈安纳 纳米药物制备系统进行混合制备出鱼精蛋白-mrna-1080d复合物。
[0126]
可离子化阳离子脂材(如sm102)、1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷酸乙醇铵(dope)、 dmg-peg2000乙醇中完全溶解，按脂材质量比49:49:2混合，与鱼精蛋白-mrna-1080d 复合物按体积比1:3(脂材：mrna)以12ml/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进 行混合制备。收集到的样液在dpbs缓冲液中10倍体积稀释后通过100kda pes超滤 管，4℃，2000
×
g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22μm滤膜的 疫苗制剂以dpbs缓冲液调整到适用浓度继续实验。
[0127]
(2)lnp-mrna-1080d脂质纳米颗粒疫苗制备
[0128]
可离子化阳离子脂材(如sm102)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、胆 固醇、dmg-peg2000乙醇中完全溶解。脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合，与 mrna-1080d的20mm柠檬酸钠缓冲液(ph 4.0)按体积比1:3(脂材:mrna)以12ml/min 的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在dpbs缓冲液中10 倍体积稀释后通过50kda pes超滤管，4℃，2000
×
g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇 含量。最后将通过0.22μm滤膜的疫苗制剂以dpbs缓冲液调整到适用浓度继续实验。
[0129]
(3)yk009 lnp-mrna-1080d脂质纳米颗粒疫苗制备
[0130]
新型可阳离子化脂材(yk009)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、胆固醇、 dmg-peg2000乙醇中完全溶解。所述新型可离子化阳离子脂材化合物2-辛基癸基6
‑ꢀ
((4-(癸氧基)-4-氧代基丁基)(2-羟基乙基)氨基)己酸酯(yk009)，ch
40h79
no5(结构式 如下(i)所示)，通过将4-((2-羟乙基)氨基)丁酸正癸酯和6-溴代己酸2-辛基癸酯溶于乙 腈，加入碳酸钾和碘化钾加热至70℃搅拌反应20h，冷却至室温后过滤，滤液经真空减 压浓缩除去溶剂，残余物经硅胶色谱法纯化，得所述可离子化阳离子脂材化合物。上述 脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合，与mrna-1080d的20mm柠檬酸钠缓冲液 (ph 4.0)按体积比1:3(脂材:mrna)以12ml/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进 行混合制备。收集到的样液在dpbs缓冲液中10倍体积稀释后通过50kda pes超滤 管，4℃，2000
×
g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22μm滤膜的 疫苗制剂以dpbs缓冲液调整到适用浓度继续实验。
[0131][0132]
3.新冠omicron突变株mrna疫苗制剂的粒径检测
[0133]
新冠omicron突变株mrna疫苗制剂用无rna酶去离子水稀释100倍，取1ml 疫苗稀释液于比色皿在anton paar粒度仪litesizer 500中检测，结果由anton paarkalliope软
件进行分析。
[0134]
结果如图4所示，结果显示：新冠omicron突变株mrna疫苗制剂lpx-mrna
‑ꢀ
1080d的粒径为140.3
±
2.5nm，pdi为14.9
±
2.6(图4中1所示)；lnp-mrna-1080d的 粒径为76.9
±
3.5nm，pdi为9.8
±
1.4(图4中2所示)；yk009 lnp-mrna-1080d的粒 径为89.5
±
1.0nm，pdi为22.2
±
0.8(图4中3所示)。
[0135]
转染细胞：将新冠omicron突变株mrna疫苗制剂滴加到细胞并上下左右晃动使 转染复合物均匀分布，37℃，5％co2孵育18h后收取细胞，转染前后无需更换细胞培 养液。
[0136]
提取细胞总蛋白：细胞用pbs清洗两次后，利用细胞裂解液ripa(金普莱，p06m11) 蛋白酶抑制剂100
×
(金普莱，p01c01)，涡旋，以充分裂解细胞。冰浴30min后， 4℃，离心13800
×
g，15min，取上清液。
[0137]
细胞总蛋白定量：利用bca蛋白定量试剂盒(金普莱，p06m16)对细胞裂解上清 液中总蛋白进行定量。将细胞裂解上清液与bca工作液混匀，37℃，孵育45min，a562 nm下检测吸光度，并计算细胞总蛋白浓度。
[0138]
western blotting(wb)检测目标蛋白表达：利用蛋白电泳预制胶bolt
tm
4 to 12％, bis-tris,1.0mm,mini protein gel(invitrogen,nw04120box)电泳(200v，22min)进 行总蛋白(20μg)分离。将凝胶上的分离蛋白在梯度电压(20v，1min；23v，4min； 25v，2min)作用下转移到iblot 2 transfer stacks，pvdf(invitrogen，ib24001)膜上 后，在含5％脱脂奶粉的1
×
tbst中室温摇育，20r/min,封闭1h。新冠omicron突变 株刺突蛋白s鼠单抗稀释液(1:2000)，sars-cov-2 spike antibody,omicron reactive, mouse mab(义翘神州，40592-mm117)，20r/min，室温摇育2h。用1
×
tbst清洗膜， 60r/min，室温摇育10min，并重复3次，以彻底去除一抗残余。二抗采用辣根过氧化 物酶(hrp)标记的山羊抗鼠igg二抗稀释液(1:10000)，goat anti-mouse igg secondaryantibody(hrp)(义翘神州，ssa007)，20r/min，室温摇育1h。用1
×
tbst清洗膜， 60r/min，室温摇育10min，并重复3次，以彻底去除二抗残余。利用ecl化学发光超 敏显色试剂盒(翊圣生物，36208es60)与膜室温避光孵育3min，在化学发光仪中检测 hrp标记的抗体结合抗原。通过曝光显现条带与蛋白marker，pageruler
tm
prestainedprotein ladder(invitrogen，26617)条带比对，验证目标抗原蛋白的表达。利用膜再生 液(索莱宝，sw3020)去除膜上抗体，再次对膜进行封闭后，孵育内参抗体，以检测蛋 白上样量的一致性。一抗采用β-actin兔单抗稀释液(1:50000)，actb rabbit mab (abclonal,ac038)，二抗采用辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗兔igg二抗稀释 液(1:10000)，goat anti-rabbit igg secondary antibody(hrp)(义翘神州，ssa004)。
[0139]
结果如图5所示，结果显示：新冠omicron突变株mrna疫苗制剂lpx-mrna
‑ꢀ
1080d、lnp-mrna-1080d和yk009 lnp-mrna-1080d转染hek293t细胞后，wb均 检测到高效表达的新冠omicron突变株刺突蛋白受体结合域(rbd)蛋白目的抗原。
[0140]
实施例2、新冠omicron突变株mrna疫苗免疫小鼠后的血清抗体检测
[0141]
一、新冠omicron突变株mrna疫苗的小鼠肌肉免疫：
[0142]
将实验动物balb/c小鼠(雌，6-8周，16-18g，北京维通利华)随机分为新冠omicron 突变株lnp-mrna-1080d疫苗免疫剂组(mrna＝10μg/只)，新冠omicron突变株yk009 lnp-mrna-1080d疫苗免疫剂组(mrna＝10μg/只)和阴性对照组(pbs,ph＝7.4)(每 组5只，正常
喂养)，以肌肉注射方式免疫小鼠。免疫一次，于免疫后的第10天采用 眼眶取血获得足够量的小鼠血清。
[0143]
二、新冠omicron突变株mrna疫苗的免疫小鼠血清假病毒中和抗体检测
[0144]
通过新冠omicron突变株假病毒评价小鼠免疫血清对新冠omicron突变株假病毒 的中和作用以及测定中和抗体效价nt
50
，从而对新冠omicron突变株lnp-mrna-1080d 疫苗和yk009 lnp-mrna-1080d疫苗的体内免疫效力进行评价。
[0145]
新冠omicron突变株假病毒中和抗体nt50效价测定：
[0146]
利用新冠omicron突变株假病毒，对新冠omicron突变株mrna疫苗免疫小鼠血 清的抗体中和作用进行评价。评价使用的新冠omicron突变株假病毒由中国食品药品检 定研究院提供，评价方法学参照文献“基于假病毒的新冠病毒临床血清及相应生物制品 中和活性抗体定量检测方法”，doi:10.1038/s41596-020-0394-5。具体检测方法如下：
[0147]
用dmem完全培养基对小鼠免疫血清从1/30进行连续3倍稀释，得到6个不同稀 释度血清，与650
×
tcid
50
假病毒37℃孵育。同时设有无假病毒的细胞对照组和无血清 样品的假病毒对照组。孵育1h后，各孔加入2
×
104个huh 7细胞，37℃，5％co2下进 行细胞培养。因假病毒进入细胞会表达萤火虫荧光素酶，24小时后，与发光底物反应并 进行发光检测。通过与假病毒对照组发光值比较，计算假病毒被抑制的百分比。通过计 算公式可以计算出当假病毒50％被抑制时血清的稀释倍数，从而来计算半数抑制稀释度。 用半数抑制稀释度来表示半数中和稀释度nt
50
，即血清抗体对假病毒中和活性的情况。
[0148]
结果如图6显示：新冠omicron突变株lnp-mrna-1080d疫苗(图6中上图)和 yk009 lnp-mrna-1080d疫苗(图6中下图)免疫的小鼠血清均对新冠omicron突变 株假病毒具有中和作用。单次免疫后，平均假病毒中和抗体滴度nt
50
分别为～1:1038和 ～1:1269。
[0149]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽 管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其 依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特 征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施 例技术方案的范围。