肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法与流程

1.本发明属于微生物育种技术领域，具体涉及肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法。


背景技术：

2.d-手性肌醇(d-chiro-inositol，简称dci)是肌肉肌醇(myo-inositol，mi)的一种差向异构体，在自然界中主要存在于豆科植物中。研究表明，d-手性肌醇在胰岛素信号传递过程中发挥着重要作用，是一种调节机体血糖的功能因子，其可改善机体对胰岛素的敏感性和葡萄糖代谢，因此可用于治疗ii型糖尿病。另外，由于d-手性肌醇可降低血液中的雄性激素并促进排卵，目前在美国市场已有多个品牌的d-手性肌醇保健品用于治疗多囊卵巢综合征。此外，d-手性肌醇还具有抗氧化活性和抗炎活性，并可抑制肝纤维化的发展。目前，d-手性肌醇的制备通常是采用以下三种方式：植物提取、化学合成和生物合成，但植物提取法中植物中的含量不高，导致资源的利用率较差，分离提取的成本较高；有机合成法则存在步骤繁琐，副产物难以分离，同时会有毒性物质的残留，影响产品的品质的缺陷；因此生物合成相对于以上两种方法更具有优势，专利cn109706189b提供了一种利用表达肌肉肌醇脱氢酶(简称idh)和肌醇单酮异构酶(简称kii)的全细胞和/或其裂解液催化肌肉肌醇生产d-手性肌醇的方法。但该方法重组大肠杆菌的依然存在酶含量较低、转化率较低的缺陷，导致生产成本较高，因此需要继续优化才能解决这些缺陷。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是：提供一种肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，克服了现有技术中的缺陷，得到的菌种能够提高肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶酶含量，从而提高转化率，提高d-手性肌醇的产量，减少了生产成本。
4.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
5.肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，包括以下步骤：
6.a.将肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组大肠杆菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；
7.b.将步骤a中稀释液于选择培养基上37℃恒温培养10～14h，选择培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l、肌肉肌醇5g/l、iptg 0.1mm，其余为去离子水，ph值自然；
8.c.挑选步骤b中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养10～14h，平板培养基为lb固体培养基，ph值自然；
9.d.挑选步骤c中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，一部分用于保存，一部分接种于摇瓶培养基中37℃、200～240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6～1.8；摇瓶培养基为lb培养基，ph值自然；
10.e.先配制补料液，然后将步骤d中的菌液接种到发酵培养基中，接种量为总重量的
0.5～2％；发酵液初始ph值为7.0，初始空气流量为0.5m3/l，维持压力为0.02mpa，发酵温度30℃，转速为300rpm进行发酵；发酵过程中适时补充补料液，保持制do值为30～50％(空气饱和度)培养至菌液od600值为25～35，加诱导剂iptg，30℃恒温诱导10～14h，1000rpm离心收集湿菌体；其中发酵培养基为柠檬酸2g/l、磷酸二氢钾14g/l、磷酸氢二钾4.5g/l、硫酸铵4g/l、葡萄糖20g/l、七水硫酸镁0.6g/l、酵母粉1g/l、消泡剂0.1g/l；诱导剂添加量为0.8～1.2mm iptg；补料液为葡萄糖600g/l、七水硫酸镁2g/l、酵母粉10g/l；
11.f.将步骤e中的湿菌体加入50mm hepes缓冲液(ph 7.0)，重悬菌体至od600至80～120，将重悬菌体70℃热处理20min；
12.g.将步骤f热处理后的重悬菌体中，加入终浓度为200g/l肌肉肌醇，在60℃、150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行hplc分析。
13.优选的，所述的步骤a中肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组大肠杆菌为专利cn109706189b中方法构建的共表达肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶的重组大肠杆菌，梯度稀释为从10-1
到10-9
。
14.优选的，所述的步骤b中37℃恒温培养12h。
15.优选的，所述的步骤c中菌落形态为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落；37℃恒温培养12h。
16.优选的，所述的步骤d中菌落形态为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落；220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7。
17.优选的，所述的步骤e中接种量为1％，发酵时保持制do值为40％；300rpm转速恒温培养至菌液为od600值为30；加1.0mm诱导剂iptg，30℃恒温诱导12h。
18.优选的，所述的步骤f中重悬菌体至od600至100。
19.由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
20.本发明通过在选择培养基内加入肌肉肌醇和少量iptg来选择培养并筛选，获得生长健壮、性能优良、更适用于生产的重组大肠杆菌；
21.在发酵控制方面，本发明改良了培养温度和生长周期的工艺条件：大肠杆菌最适合生长的温度在37～39℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生产包涵体，而低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例，本发明发酵温度为30℃，该培养温度有3个优势：1、发酵培养基中的氧气溶解性更高，在高密度培养时，能有效防止菌体厌氧生产，防止对菌体生产和外源蛋白表达有抑制作用的乙酸产生；2、次级代谢物的半衰期更长，质粒稳定性也可能会增加；3、降低培养温度能降低可溶蛋白降解速率，提高可溶蛋白的稳定性；
22.本发明还采用高密度培养技术提高菌体发酵密度，最终提高产物的生产率，不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，减少设备投资，从而降低生产成本，选育得到的菌株中最高产量达到d-手性肌醇含量为40.3g/l(现有技术中最高含量为37.4g/l)，相对于现有技术的产量显著提高；
23.选育得到的菌株经过50代传代实验，证明遗传稳定性良好，因此能够应用到生产中。
附图说明
24.图1为实施例5产物的hplc图；
25.图2为d-手性肌醇标准品的hplc图。
具体实施方式
26.下面结合实施例对本发明的技术方案进一步描述：
27.实施例1:菌株选育一
28.a.将肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组大肠杆菌(利用专利cn109706189b方法构建的能共表达肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶的重组大肠杆菌)用灭菌水进行梯度稀释，得到10-1
到10-9
稀释液；
29.b.将步骤a中的10-5
到10-9
稀释液分别涂布于选择培养基上，37℃恒温培养10h，选择培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l、肌肉肌醇5g/l、iptg 0.1mm，其余为去离子水，ph值自然；
30.c.挑选步骤b中颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养10h，平板培养基为bl固体培养基，ph值自然；选择颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，一部分进行保存并命名为s101、s102、s103、s104、s105、s106、s107、s108、s109、s110，同时将另一部分转移到液体培养基中进行培养并测定酶活。
31.实施例2:菌株选育二
32.a.将肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组大肠杆菌(菌种同实施例1)用灭菌水进行梯度稀释，得到10-1
到10-9
稀释液；
33.b.将步骤a中的10-5
到10-9
稀释液分别涂布于选择培养基上37℃恒温培养12h，选择培养基配方同实施例1；
34.c.挑选步骤b中颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养12h，平板培养基同实施例1；选择颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，一部分进行保存并命名为s201、s202、s203、s204、s205、s206、s207、s208、s209、s210，同时将另一部分转移到液体培养基中进行培养并测定酶活。
35.实施例3:菌株选育三
36.a.将肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组大肠杆菌(菌种同实施例1)用灭菌水进行梯度稀释，得到10-1
到10-9
稀释液；
37.b.将步骤a中的10-5
到10-9
稀释液分别涂布于选择培养基上37℃恒温培养14h，选择培养基配方同实施例1；
38.c.挑选步骤b中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养14h，平板培养基配方同实施例1；选择颜色为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，一部分进行保存并命名为s301、s302、s303、s304、s305、s3061、s307、s308、s309、s310，同时将另一部分转移到液体培养基中进行培养并测定酶活。
39.通过实施例1-3，初筛共得到30株菌株，分别是s101-s110，s201-s210，s301-s310。
40.实施例4:发酵筛选一
41.d.挑选实施例2中筛选到的s201接种于装有50ml摇瓶培养基的摇瓶中，37℃、200rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6；摇瓶培养基为lb培养基，ph值自然；
42.e.将步骤d中的菌液10ml转移到装有2000ml发酵培养基中，30℃、维持压力为0.02mpa、300rpm转速恒温培养，适时补入补料液至菌液为od600值为25，加诱导剂iptg，30℃恒温诱导10h，1000rpm离心收集得到湿菌体60克；其中发酵培养为柠檬酸2g/l、磷酸二氢钾14g/l、磷酸氢二钾4.5g/l、硫酸铵4g/l、葡萄糖20g/l、七水硫酸镁0.6g/l、酵母粉1g/l、消泡剂0.1g/l，接种量为总重量的0.5％，诱导剂添加量为0.8mm iptg，补料液为葡萄糖600g/l、七水硫酸镁2g/l、酵母粉10g/l。
43.f.将步骤e中的湿菌体加入50mm hepes缓冲液(ph 7.0)，使重悬菌体od600至80，将重悬菌体70℃热处理20min。
44.g.将步骤f中的重悬热处理后的菌体在在5ml反应体系中，加入终浓度为200g/l肌肉肌醇，在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行hplc分析。
45.h.结果显示，d-手性肌醇的含量为35.4g/l。
46.实施例5:发酵筛选二
47.d.挑选实施例2中筛选到的s201接种于装有50ml摇瓶培养基的摇瓶中，37℃、220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7；摇瓶培养基为lb培养基，ph值自然；
48.e.将步骤d中的菌液20ml转移到装有2000ml发酵培养基中，30℃、维持压力为0.02mpa、300rpm转速恒温培养，适时补入补料液至菌液为od600值为30，加诱导剂iptg，30℃恒温诱导12h，1000rpm离心收集得到湿菌体73克；其中发酵培养基和补料液与实例4相同，接种量为总重量的1.0％，诱导剂添加量为1.0mm iptg。
49.f.将步骤e中的湿菌体加入50mm hepes缓冲液(ph 7.0)，使重悬菌体od600至100，将重悬菌体70℃热处理20min。
50.g.将步骤f中的重悬热处理后的菌体在在5ml反应体系中，加入终浓度为200g/l肌肉肌醇，在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行hplc分析(见图1)。
51.h.结果显示，d-手性肌醇的含量为40.3g/l。
52.实施例6:发酵筛选三
53.d.挑选实施例2中筛选到的s201接种于装有50ml摇瓶培养基的摇瓶中，37℃、240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.8；摇瓶培养基为lb培养基，ph值自然；
54.e.将步骤d中的菌液40ml转移到装有2000ml发酵培养基中，30℃、维持压力为0.02mpa、300rpm转速恒温培养，适时补入补料液至菌液为od600值为35，加诱导剂iptg，30℃恒温诱导14h，1000rpm离心收集得到湿菌体80克；其中发酵培养基和补料液与实例4相同，接种量为总重量的2.0％，诱导剂添加量为1.2mm iptg。
55.f.将步骤e中的湿菌体加入50mm hepes缓冲液(ph 7.0)，使重悬菌体od600至120，将重悬菌体70℃热处理20min。
56.g.将步骤f中的重悬热处理后的菌体在在5ml反应体系中，加入终浓度为200g/l肌肉肌醇，在60℃和150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行hplc分析。
57.h.结果显示，d-手性肌醇的含量为39.8g/l。
58.通过实施例4-6可得出结论，实施例5为最佳发酵实验条件。
59.实施例7:发酵筛选四
60.将实施例1-3筛选到的所有菌株分别通过实施例5发酵方法进行发酵，得到的d-手性肌醇含量分别如表1：
61.表1实施例1-3筛选到的菌种发酵实验结果
[0062][0063]
通过上述结果可见，s101,s103,s105,s108,s204,s205,s209,s210,s301,s306,s307菌株产量较高。
[0064]
实施例8:稳定性实验
[0065]
将实施例7得到的产量较高的菌株进行遗传稳定性实验结果显示，s105、s209、s307等菌传代50代后收率不变。证明可以用于工业生产。
[0066]
对比例1:
[0067]
不用肌醇和iptg进行筛选，其它条件同实施例2，得到菌株d01～d10共10株，将d01～d10分别按实施例5条件进行发酵培养；得到的d-手性肌醇的最高含量为37.5g/l。
[0068]
对比例2：
[0069]
将实施例2中筛选到的s201按实施例5进行选育，其中发酵温度改为37℃，发酵液do控制在20，其它条件同实施例5；得到的d-手性肌醇的含量为38.3g/l。结果分析:
[0070]
通过对实施例及对比例的产品分析得出如下结论：
[0071]
不使用肌醇和iptg进行筛选，得到的菌株进行低温高密度发酵结果与现有技术相比略高，对比例1十个菌株发酵得到的d-手性肌醇的最高含量为37.5g/l，现有技术最高含量为37.4g/l，所以效果并不明显；
[0072]
使用肌醇和iptg进行筛选，常规发酵条件进行发酵可以显著提高d手性肌醇的含量。
[0073]
总之，本发明通过使用肌醇和iptg进行筛选，通过低温高密度发酵，得到了最高产
量为40.3g/l的可以稳定遗传的s307菌株。证明本发明方法确实有效，得到的菌种能够提高肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶酶含量，从而提高转化率，提高d-手性肌醇的的产量，减少了生产成本。
[0074]
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。