肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法与流程

技术特征：
1.肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，其特征在于：包括以下步骤：a.将肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组大肠杆菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；b.将步骤a中稀释液于选择培养基上37℃恒温培养10～14h，选择培养基配方为酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、琼脂粉20g/l、肌肉肌醇5g/l、iptg 0.1mm，其余为去离子水，ph值自然；c.挑选步骤b中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养10～14h，平板培养基为lb固体培养基，ph值自然；d.挑选步骤c中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落，一部分用于保存，一部分接种于摇瓶培养基中37℃、200～240rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.6～1.8；摇瓶培养基为lb培养基，ph值自然；e.先配制补料液，然后将步骤d中的菌液接种到发酵培养基中，接种量为总重量的0.5～2％；发酵液初始ph值为7.0，初始空气流量为0.5m3/l，维持压力为0.02mpa，发酵温度30℃，转速为300rpm进行发酵；发酵过程中适时补充补料液，保持制do值为30～50％培养至菌液od600值为25～35，加诱导剂iptg，30℃恒温诱导10～14h，1000rpm离心收集湿菌体；其中发酵培养基为柠檬酸2g/l、磷酸二氢钾14g/l、磷酸氢二钾4.5g/l、硫酸铵4g/l、葡萄糖20g/l、七水硫酸镁0.6g/l、酵母粉1g/l、消泡剂0.1g/l；诱导剂添加量为0.8～1.2mm iptg；补料液为葡萄糖600g/l、七水硫酸镁2g/l、酵母粉10g/l；f.将步骤e中的湿菌体加入50mm hepes缓冲液，重悬菌体至od600至80～120，将重悬菌体70℃热处理20min；g.将步骤f热处理后的重悬菌体中，加入终浓度为200g/l肌肉肌醇，在60℃、150rpm的水浴摇床反应48h，取样进行hplc分析。2.如权利要求1所述的肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，其特征在于：所述步骤a中梯度稀释为从10-1
到10-9
。3.如权利要求1所述的肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，其特征在于：所述步骤b中37℃恒温培养12h。4.如权利要求1所述的肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，其特征在于：所述步骤c中菌落形态为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落；37℃恒温培养12h。5.如权利要求1所述的肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，其特征在于：所述步骤d中菌落形态为白色、菌落凸起、菌落直径为1～2mm的菌落；220rpm转速恒温培养至菌液为od600值为1.7。6.如权利要求1所述的肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，其特征在于：所述步骤e中接种量为1％，发酵时保持制do值为40％；300rpm转速恒温培养至菌液为od600值为30；加1.0mm诱导剂iptg，30℃恒温诱导12h。7.如权利要求1所述的肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，其特征在于：所述步骤f中重悬菌体至od600至100。

技术总结
本发明属于微生物育种技术领域，公开了肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶重组菌选育方法，通过利用选择培养基进行定向筛选，选择培养基配方为酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L、肌肉肌醇5g/L、IPTG 0.1mM，其余为去离子水，pH值自然；然后将筛选到的菌株在低温环境下进行高密度发酵培养，发酵温度30℃，培养至菌液OD600值为25～35，得到可稳定遗传的高产量菌株。本发明能够提高肌肉肌醇脱氢酶和肌醇单酮异构酶酶含量，从而提高转化率，提高D-手性肌醇的产量，减少了生产成本。本。


技术研发人员：朱理平 徐良平 马旭 魏萍萍
受保护的技术使用者：诸城市浩天药业有限公司
技术研发日：2023.07.21
技术公布日：2023/9/12