除草剂耐受性基因及其使用方法与流程

1.本发明总体上涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及编码降解除草剂的酶的重组dna分子。本发明还涉及含有重组dna分子的转基因植物、部分、种子、细胞和植物部分，以及使用它们的方法。


背景技术：

2.农作物生产通常利用使用生物技术方法产生的转基因性状。将异源基因(也称为转基因)引入植物中以产生转基因性状。转基因在植物中的表达赋予植物以期望的性状，如除草剂耐受性。转基因除草剂耐受性性状的实例包括草甘膦耐受性、草铵膦耐受性和麦草畏耐受性。随着对最常用的除草剂有抗性的杂草物种的增加，在所述领域中需要新的除草剂耐受性性状。特别感兴趣的除草剂是吡啶基氧基酸类除草剂。吡啶基氧基酸类除草剂提供对一系列抗草甘膦杂草的控制，从而产生赋予这些除草剂耐受性的特别用于与其他除草剂耐受性性状组合的作物系统中的性状。
3.从2,4-滴丙酸(dichloroprop)降解土壤样品分离的食除草剂鞘脂菌(sphingobium herbicidovorans)菌株mh被鉴定为能够裂解各种苯氧基烷酸(phyenoxyalkanoic acid)除草剂的醚键，从而利用此作为其生长的唯一碳源和能量来源(hpe kohler,journal of industrial microbiology&biotechnology(1999)23:336-340)。除草剂的分解代谢通过两种不同的对映选择性α-酮戊二酸依赖性双加氧酶rdpa(r-2,4-滴丙酸双加氧酶)和sdpa(s-2,4-滴丙酸双加氧酶)进行。(a westendorf,等人,microbiological research(2002)157:317-322；westendorf,等人,actabiotechnologica(2003)23(1):3-17)。rdpa已自食除草剂鞘脂菌(genbank登录af516752(dna)和aam90965(蛋白质))和食酸代尔夫特菌(delftia acidovorans)(genbank登录ng_036924(dna)和yp_009083283(蛋白质))(ta mueller,等人,applied and environmental microbiology(2004)70(10):6066-6075)。rdpa和sdpa基因已经用于植物转化以赋予作物以除草剂耐受性(tr wright,等人,proceedings of the national academy of sciences usa,(2010)107(47):20240-5)。使用蛋白质工程化技术改进rdpa酶的活性以产生用于转基因植物的蛋白质将允许更高的除草剂施加率，从而改进转基因作物安全性和杂草控制措施。
4.发明简述
5.本发明提供一种重组dna分子，其包含编码多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列与如seq id no:1所示的rdpa氨基酸序列相比，具有下述突变：在第82位氨基酸由亮氨酸突变为组氨酸。在一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列还具有选自下组的一个或多个突变：在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸、蛋氨酸或异亮氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，且第104位氨基酸由精氨酸突变为丙氨酸、天冬氨酸或亮氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，且第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，且第103位氨基酸由甘氨酸突变为亮氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，且第104位氨基酸由
精氨酸突变为甘氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，且第103位氨基酸由甘氨酸突变为亮氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，且第112位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，且第80位氨基酸由缬氨酸突变为苏氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，且第180位氨基酸由精氨酸突变为色氨酸或蛋氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，且第108位氨基酸由天冬氨酸突变为半胱氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，且第109位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，且第219位氨基酸由谷氨酰胺突变为半胱氨酸或脯氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第103位氨基酸由甘氨酸突变为亮氨酸，且第180位氨基酸由精氨酸突变为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸、色氨酸或苏氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第103位氨基酸由甘氨酸突变为亮氨酸，且第80位氨基酸由缬氨酸突变为苏氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第103位氨基酸由甘氨酸突变为亮氨酸，且第112位氨基酸由苏氨酸突变为丙氨酸、丝氨酸或蛋氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第103位氨基酸由甘氨酸突变为亮氨酸，且第247位氨基酸由苯丙氨酸突变为酪氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，且第77位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸；在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，第112位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸，且第180位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸或谷氨酰胺；和/或在第187位氨基酸由缬氨酸突变为亮氨酸，第182位氨基酸由苯丙氨酸突变为色氨酸，第103位氨基酸由甘氨酸突变为亮氨酸，第104位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸，且第105位氨基酸由缬氨酸突变为酪氨酸。在另一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列进一步与seq id no:1所示的rdpa氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。
6.本发明还提供一种重组dna分子，所述重组dna分子包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性的多肽的核酸序列：seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138和142。在一个实施方案中，所述重组dna分子包含选自由以下组成的组的核酸序列：seq id no:3、4、5、7、8、9、11、12、13、15、16、17、19、20、21、23、24、25、27、28、29、31、32、33、35、36、37、39、40、41、43、44、45、47、48、49、51、52、53、55、56、57、59、60、61、63、64、65、67、68、69、71、72、73、75、76、77、79、80、81、83、84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、97、99、100、101、103、104、105、107、108、109、111、112、113、115、116、117、
119、120、121、123、124、125、127、128、129、131、132、133、135、136、137、139、140、141和143-181，以及因遗传密码的简并性而与所示序列编码相同氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，所述重组dna分子编码对至少一种选自由以下组成的组的除草剂具有加氧酶活性的多肽：吡啶基氧基酸类除草剂。在另一个实施方案中，所述重组dna分子可操作地连接至在植物细胞中有功能的异源启动子。在另一个实施方案中，所述重组dna分子可操作地连接至编码叶绿体转运肽的dna分子，所述叶绿体转运肽用于将可操作地连接的多肽定位在细胞内。
7.本发明提供一种dna构建体，所述dna构建体包含在植物细胞中有功能的异源启动子，所述异源启动子可操作地连接至本发明所述重组dna分子。在一个实施方案中，所述重组dna分子可操作地连接至编码叶绿体转运肽的dna分子，所述叶绿体转运肽用于将可操作地连接的多肽定位在细胞内。在另一个实施方案中，所述重组dna分子编码的多肽在转基因植物中的表达赋予植物除草剂耐受性。在另一个实施方案中，所述dna构建体存在于转基因植物的基因组中。
8.本发明提供一种包含本发明所述重组dna分子的转基因植物、种子、细胞或植物部分。在一个实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含对至少一种选自由以下组成的组的除草剂的耐受性的转基因性状：吡啶基氧基酸类除草剂。在另一个实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含本发明的dna构建体。在另一个实施方案中，所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含本发明的多肽。
9.本发明提供一种多肽，其氨基酸序列与如seq id no:1所示的rdpa氨基酸序列相比，具有下述突变：在第82位氨基酸由亮氨酸突变为组氨酸。在一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列还具有上述的一个或多个突变。在另一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列进一步与seq id no:1所示的rdpa氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。
10.本发明还提供一种多肽，所述多肽与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性：seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138和142。在一个实施方案中，所述多肽对至少一种选自由以下组成的组的除草剂具有加氧酶活性：吡啶基氧基酸类除草剂。
11.本发明提供一种用于赋予植物、种子、细胞或植物部分除草剂耐受性的方法，所述方法包括在所述植物、种子、细胞或植物部分中表达本发明的多肽。在一个实施方案中，所述用于赋予除草剂耐受性的方法与包含含有本发明的重组dna分子的转基因性状的转基因植物、种子、细胞或植物部分一起使用。在一个实施方案中，所述用于赋予除草剂耐受性的方法与选自由以下组成的组的除草剂一起使用：吡啶基氧基酸类除草剂。
12.本发明提供一种植物转化方法，所述方法包括将本发明的重组dna分子或dna构建体引入植物细胞或组织中并且从其再生包含所述重组dna分子或dna构建体并且对至少一种选自由以下组成的组的除草剂耐受的植物：吡啶基氧基酸类除草剂。在一个实施方案中，所述植物转化方法包括使所述再生的植物与其本身或与第二植物杂交并且从所述杂交收集种子。
13.本发明提供一种用于通过使包含本发明的转基因植物或种子的植物生长区与至
少一种选自由以下组成的组的除草剂接触来控制植物生长区中的杂草的方法：吡啶基氧基酸类除草剂，其中所述转基因植物或种子对所述除草剂具有耐受性。
附图说明
14.图1中示出培养基中添加0.5μm、1μm化合物b19天后的对照金粳818植物和含seq idno:42蛋白编码基因的转基因金粳818植物(表达相同蛋白质的植物之间生长的变化可能是由于构建体设计或转基因插入位置的变化所致，下同)。
15.图2中示出在施加20g、40g、60g、80g、100g、120g/亩化合物b相应天数(dat)后的对照金粳818植物和含seq id no:42蛋白编码基因的转基因金粳818植物。
16.图3中示出培养基添加0.15μm化合物a筛选11天后的对照野生型和含seq id no:46蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子。
17.图4中示出植物叶片喷洒40g/亩化合物b12天后的对照转rdpa野生型基因拟南芥植物和含seq id no:42蛋白编码基因的拟南芥植物。
18.图5中示出培养基中添加1μm化合物b17天后的对照金粳818植物和含seq idno:138/86蛋白编码基因的转基因金粳818植物。
19.图6中示出培养基中添加1μm化合物b 22天后的对照金粳818植物和含seq id no:102蛋白编码基因的转基因金粳818植物。
20.图7中示出培养基中添加1μm化合物b17天后的对照金粳818植物和含seq id no:82蛋白编码基因的转基因金粳818植物。
21.图8中示出培养基中添加1μm化合物b 22天后的对照金粳818植物和含seq id no:106蛋白编码基因的转基因金粳818植物。
22.图9中示出培养基中添加1μm化合物b 26天后的对照金粳818植物和含seq id no:126蛋白编码基因的转基因金粳818植物。
23.图10中示出培养基中添加1μm化合物b 26天后的对照金粳818植物和含seq id no:142蛋白编码基因的转基因金粳818植物。
24.图11中示出培养基中添加1μm化合物b 22天后的对照金粳818植物和含seq id no:38蛋白编码基因的转基因金粳818植物。
25.图12中示出施加0g、5g、10g/亩化合物精喹禾灵20dat后的对照金粳818植物和含seq id no:46蛋白编码基因的转基因金粳818植物的测试结果(图中方框内为野生型对照金粳818植物，其余为含seq id no:46蛋白编码基因的转基因金粳818植物)。
26.图13中示出添加0.3μm化合物b浸种20天后，含不同蛋白编码基因的t1代转基因金粳818种子相比较野生型金粳818的根长比较。
27.图14中示出添加0.15μm化合物a筛选20天后，含seq id no:42蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
28.图15中示出添加0.15μm化合物a筛选19天后，含seq id no:78蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
29.图16中示出添加0.15μm化合物a筛选24天后，含seq id no:82蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
30.图17中示出添加0.15μm化合物a筛选21天后，含seq id no:86蛋白编码基因的t2
代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
31.图18中示出添加0.15μm化合物a筛选19天后，含seq id no:98蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
32.图19中示出添加0.15μm化合物a筛选19天后，含seq id no:102蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
33.图20中示出添加0.15μm化合物a筛选20天后，含seq id no:126蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
34.图21中示出添加0.15μm化合物a筛选19天后，含seq id no:138蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
35.图22中示出添加0.15μm化合物a筛选24天后，含seq id no:142蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子与野生型拟南芥(第一行)的出苗情况对比。
36.图23中示出t0代含seq id no:46蛋白编码基因的转基因大豆与野生型大豆的抗性对比(化合物c10g)。
37.图24中示出t1代含seq id no:46蛋白编码基因的转基因大豆与野生型大豆的抗性对比(化合物c10g)。
38.图25中示出t1代含seq id no:42蛋白编码基因的转基因大豆与野生型大豆的抗性对比(化合物c10g)。
39.图26中示出t1代含seq id no:42蛋白编码基因的转基因大豆与野生型大豆的抗性对比(化合物c 20g、40g、80g)。
40.图27中示出对t0代转基因玉米小植株喷药150g、250g、400g、600g、800g 30％草甘膦
·
化合物c(25 5)me测试结果。
41.42.43.44.[0045][0046]
发明详述
[0047]
提供以下定义和方法以更好地限定本发明并指导本领域的普通技术人员实施本发明。除非另外说明，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
[0048]
工程化蛋白质和重组dna分子
[0049]
本发明提供新颖的工程化蛋白质和编码它们的重组dna分子。如本文所用，术语“工程化的”是指通常不会在自然界中发现并且通过人为干预产生的非天然dna、蛋白质或生物体。“工程化蛋白质”是在实验室中使用一种或多种蛋白质工程化技术，如使用定点诱变的蛋白质设计和使用随机诱变和dna改组的定向进化来设想和创建其多肽序列的蛋白质。例如，工程化蛋白质可相对于野生型蛋白质的编码序列具有一个或多个缺失、插入或取代，并且每个缺失、插入或取代可由一个或多个氨基酸组成。工程化蛋白质的实例在本文提供为seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138和142。
[0050]
本发明提供的工程化蛋白质是具有加氧酶活性的酶。如本文所用，术语“加氧酶活性”意指通过将氧从分子氧转移至底物、副产物或中间物来氧化底物的能力。本发明提供的工程化蛋白的加氧酶活性可使吡啶基氧基酸类除草剂中的一种或多种失活。
[0051]
如本文所用，“野生型”意指天然存在的。如本文所用，“野生型dna分子”、“野生型多肽”或“野生型蛋白质”是天然存在的dna分子、多肽或蛋白质，即在自然界中预先存在的dna分子、多肽或蛋白质。多肽、蛋白质或dna分子的野生型型式可适用于与工程化蛋白质或基因进行比较。蛋白质或dna分子的野生型型式可适用作实验中的对照。
[0052]
如本文所用，“对照”意指为比较目的而设计的实验对照。例如，转基因植物分析中的对照植物是与实验植物(即其待测试的植物)相同类型但不含实验植物的转基因插入片段、重组dna分子或dna构建体的植物。适用于与转基因玉米植物比较的对照植物的实例是非转基因lh244玉米(美国专利号6,252,148)并且适用于与转基因大豆植物比较的对照植物的实例是非转基因a3555大豆(美国专利no.7,700,846)。
[0053]
如本文所用，术语“重组”是指为遗传工程化的结果并且因此通常不会在自然界中发现并且通过人为干预产生的非天然dna、多肽或蛋白质。“重组dna分子”是包含不天然存在的并且因此是人为干预的结果的dna序列的dna分子，例如编码工程化蛋白质的dna分子。另一个实例是由至少两个彼此异源的dna分子(如编码蛋白质的dna分子和可操作地连接的
异源启动子)的组合组成的dna分子。重组dna分子的实例是包含至少一个选自以下的序列的dna分子：seq id no:3、4、5、7、8、9、11、12、13、15、16、17、19、20、21、23、24、25、27、28、29、31、32、33、35、36、37、39、40、41、43、44、45、47、48、49、51、52、53、55、56、57、59、60、61、63、64、65、67、68、69、71、72、73、75、76、77、79、80、81、83、84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、97、99、100、101、103、104、105、107、108、109、111、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129、131、132、133、135、136、137、139、140、141和143-181。“重组多肽”或“重组蛋白质”是包含不天然存在的氨基酸序列并且因此是人为干预的结果的多肽或蛋白质，例如工程化蛋白质。
[0054]
术语“转基因”是指作为人为干预(如通过植物转化方法)的结果人工并入生物体基因组中的dna分子。如本文所用，术语“转基因的”意指包含转基因，例如“转基因植物”是指在其基因组中包含转基因的植物，“转基因性状”是指由并入植物基因组中的转基因的存在传递或赋予的特征或表型。作为这种基因组改变的结果，所述转基因植物是与相关的野生型植物明显不同的植物，并且转基因性状是未在野生型植物中天然发现的性状。本发明的转基因植物包含通过本发明提供的重组dna分子和工程化蛋白质。
[0055]
如本文所用，术语“异源”是指源自不同来源且因此在自然界中通常不相关的两种或更多种物质之间的关系。例如，编码蛋白质的重组dna分子相对于可操作地连接的启动子是异源的，如果这种组合在自然界中通常不存在。此外，当特定重组dna分子不天然存在于所述特定细胞或生物体中时，其可相对于其所插入的细胞或生物体是异源的。
[0056]
如本文所用，术语“编码蛋白质的dna分子”或“编码多肽的dna分子”是指包含编码蛋白质或多肽的核苷酸序列的dna分子。“编码蛋白质的序列”或“编码多肽的序列”意指编码蛋白质或多肽的dna序列。“序列”意指核苷酸或氨基酸的顺序排列。编码蛋白质的序列或编码多肽的序列的边界通常由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子决定。编码蛋白质的分子或编码多肽的分子可包含编码蛋白质或多肽序列的dna序列。如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白质表达”、“多肽表达”、“表达蛋白质”和“表达多肽”意指通过将dna分子转录成信使rna(mrna)并且将mrna翻译成多肽链(其可最终折叠成蛋白质)的过程产生蛋白质或多肽。编码蛋白质的dna分子或编码多肽的dna分子可以可操作地连接至dna构建体中的异源启动子，以用于在用重组dna分子转化的细胞中表达蛋白质或多肽。如本文所用，“可操作地连接”是指以使得一个dna分子可影响另一个dna分子的功能的方式连接的两个dna分子。可操作连接的dna分子可以是单个连续分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，启动子与dna构建体中的编码蛋白质的dna分子或编码多肽的dna分子可操作地连接，其中两个dna分子被排列成使得所述启动子可影响转基因的表达。
[0057]
如本文所用，“dna构建体”是包含两个或更多个异源dna序列的重组dna分子。dna构建体适用于转基因表达，并且可包含在载体和质粒中。dna构建体可出于转化(即将异源dna引入宿主细胞中)的目的用于载体中以便产生转基因植物和细胞，并且因此也可包含在转基因植物、种子、细胞或植物部分的质粒dna或基因组dna中。如本文所用，“载体”意指可用于植物转化目的的任何重组dna分子。如序列表中所示的重组dna分子可例如作为构建体的一部分插入载体中，所述构建体具有可操作地连接至启动子的重组dna分子，所述启动子在植物中起作用以驱动由所述重组dna分子编码的工程化蛋白质的表达。用于构建dna构建
体和载体的方法是本领域中熟知的。dna构建体或包含dna构建体的载体的组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：用于表达可操作地连接的dna的合适启动子、可操作地连接的编码蛋白质非人dna分子和3'非翻译区(3
’‑
utr)。适用于实践本发明的启动子包括在植物中起作用以表达可操作地连接的多核苷酸的启动子。此类启动子是多种多样的且是本领域中熟知的，并且包括诱导型的、病毒的、合成的、组成型、时间调控型的、空间调控型的和/或时空调控型的。另外的任选组分包括但不限于以下元件中的一个或多个：5'-utr、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、叶绿体转运肽(ctp)和一个或多个选择性标记转基因。
[0058]
本发明的dna构建体可包含可操作地连接至本发明提供的编码蛋白质的dna分子的ctp分子。适用于实践本发明的ctp包括用于促进工程化蛋白分子在细胞内定位的那些。通过促进细胞内的蛋白质定位，ctp可增加工程化蛋白质的积累，保护其免受蛋白水解降解，增强除草剂耐受性水平，并且由此降低除草剂施加后的损伤水平。用于本发明的ctp分子是本领域中已知的，包括但不限于拟南芥epsps ctp(klee等人,1987)、矮牵牛epsps ctp(della-cioppa等人,1986)、玉米cab-m7信号序列(becker等人,1992；pct wo 97/41228)和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(creissen等人,1991；pct wo 97/41228)。
[0059]
本发明的重组dna分子可通过本领域中已知的方法完全或部分地合成和修饰，特别是在期望提供适用于dna操作的序列(如限制性酶识别位点或重组-基因克隆位点)、植物优选序列(如植物密码子使用或kozak共有序列)或适用于dna构建体设计的序列(如间隔区或接头序列)的情况下。本发明包括重组dna分子和工程化蛋白质，所述重组dna分子和工程化蛋白质与本文提供的重组dna分子或工程化蛋白质序列中的任一个，例如与包含选自由以下组成的组的序列的重组dna分子具有至少约80％(百分比)序列同一性、约85％序列同一性、约90％序列同一性、约91％序列同一性、约92％序列同一性、约93％序列同一性、约94％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性和约99％序列同一性：seq id no:3、4、5、7、8、9、11、12、13、15、16、17、19、20、21、23、24、25、27、28、29、31、32、33、35、36、37、39、40、41、43、44、45、47、48、49、51、52、53、55、56、57、59、60、61、63、64、65、67、68、69、71、72、73、75、76、77、79、80、81、83、84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、97、99、100、101、103、104、105、107、108、109、111、112、113、115、116、117、119、120、121、123、124、125、127、128、129、131、132、133、135、136、137、139、140、141和143-181。如本文所用，术语“百分比序列同一性”或“％序列同一性”是指在最佳比对两个序列时(在比较窗内具有总计少于参考序列的20％的适当核苷酸或氨基酸插入、缺失或空位)，与测试(“主题”)序列(或其互补链)相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或多肽序列中的相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域的技术人员所熟知的并且可由以下工具实施：如smith和waterman的局部同源性算法、needleman和wunsch的同源性比对算法、pearson和lipman的相似性搜索方法，并且由这些算法的计算机化实现方式来实施，如使用默认参数的作为wisconsin(accelrys inc.,san diego,ca)、megalign(dnastar,inc.,1228s.park st.,madison,wis.53715)和muscle(3.6版)(rcedgar,nucleic acids research(2004)32(5):1792-1797)的一部分可获得的gap、bestfit、fasta和tfasta。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共享的相同组分的数目除以参考序列片段中组分的总数，即整个参考序列或参考序列的较小限定部分。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以
100。一个或多个序列的比较可以是针对全长序列或其一部分，或针对更长的序列。
[0060]
可通过改变(即修饰)野生型蛋白质以产生具有有用蛋白质特征(如改变的vmax、km、底物特异性、底物选择性和蛋白质稳定性)的新颖组合的新蛋白质来产生工程化蛋白质。修饰可在蛋白质中的特定氨基酸位置进行，并且可以是在自然界(即在野生型蛋白质中)中在所述位置发现的氨基酸被不同的氨基酸取代。适用于蛋白质工程化的野生型蛋白质rdpa的氨基酸序列如seq id no:1所示。设计工程化蛋白质，所述工程化蛋白质与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性：seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138和142，并且包含这些氨基酸突变中的至少一种。因此，本发明提供的工程化蛋白质提供相对于在自然界中发现的野生型蛋白质具有一种或多种改变的蛋白质特征的新蛋白质。在本发明的一个实施方案中，与类似的野生型蛋白质或此类特征的任何组合相比，工程化蛋白质具有改变的蛋白质特征，如针对一种或多种除草剂的改进的或降低的活性或改进的蛋白质稳定性。在一个实施方案中，本发明提供工程化蛋白质和编码其的重组dna分子，其与选自由以下组成的组的工程化蛋白质序列具有至少约80％序列同一性、约85％序列同一性、约90％序列同一性、约91％序列同一性、约92％序列同一性、约93％序列同一性、约94％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性和约99％序列同一性：seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138和142。氨基酸突变可作为蛋白质中的单个氨基酸取代或与一种或多种其它突变(如一个或多个其它氨基酸取代、缺失或添加)的组合进行。可如本文所描述或通过本领域的技术人员已知的任何其它方法进行突变。
[0061]
转基因植物
[0062]
本发明的一个方面包括包含本发明提供的重组dna分子和工程化蛋白的转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物和转基因种子。包含重组dna分子和工程化蛋白质的这些细胞、组织、植物和种子显示对吡啶基氧基酸类除草剂中的一种或多种的除草剂耐受性。
[0063]
用于转化用于本发明的宿主植物细胞的合适方法实际上包括可将dna引入细胞(例如，其中重组dna构建体稳定整合至植物染色体中)的任何方法并且在本领域中是已知的。用于将重组dna构建体引入植物中的示例性和广泛使用的方法是土壤杆菌属转化系统，其是本领域的技术人员熟知的。转基因植物可通过植物细胞培养的方法从转化的植物细胞再生。关于转基因纯合的转基因植物(即，转基因的两个等位基因拷贝)可通过将包含单个转基因等位基因的转基因植物与其自身(例如r0植物)自花授粉(自交)以产生r1种子。所产生的r1种子的四分之一对于转基因将是纯合的。通常使用snp测定、dna测序或允许杂合子与纯合子之间的区别的热扩增测定来测试从发芽的r1种子生长的植物的接合性，称为接合性测定。
[0064]
本发明提供的植物、种子、植物部分、植物组织和细胞显示对吡啶基氧基酸类除草剂中的一种或多种的除草剂耐受性。吡啶基氧基酸类除草剂是类似于植物生长激素吲哚乙酸(iaa)的合成植物生长素，阔叶植物对这些除草剂敏感，其诱导快速、不受控制的生长，最终杀死植物。
[0065]
所述吡啶基氧基酸类除草剂实例包括但不限于如式ⅰ所示的化合物及其盐、酯衍生物，
[0066][0067]
其中，a、b分别独立地代表卤素、c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、c3-c6环烷基；
[0068]
c代表氢、卤素、c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基；
[0069]
q代表c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、卤素、氰基、氨基、硝基、甲酰基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷氧羰基、羟基c1-c6烷基、c1-c6烷氧基c1-c2烷基、氰基c1-c2烷基、c1-c6烷氨基c1-c2烷基、苄基、萘基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基，以及未取代或被c1-c6烷基取代的未取代或被c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、卤素和c1-c6烷氧基中的至少一个基团所取代的苯基；
[0070]
y代表氨基、c1-c6烷基氨基、c1-c6烷基羰基氨基、苯基羰基氨基、苄基氨基、未取代或卤代c1-c6烷基取代的呋喃基亚甲基氨基；
[0071]
所述盐为金属盐、铵盐nh
4
、伯胺盐rnh2、仲胺盐(r)2nh、叔胺盐(r)3n、季胺盐(r)4n

、吗啉盐、哌啶盐、吡啶盐、氨基丙基吗啉盐、jeff胺d-230盐、2,4,6-三(二甲基氨基甲基)苯酚和氢氧化钠的盐、c1-c14烷基锍盐、c1-c14烷基氧化锍盐、c1-c14烷基鏻盐、c1-c14烷醇鏻盐；
[0072]
其中，r分别独立地代表未取代的c1-c14烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12环烷基或苯基，以及c1-c14烷基任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、羟基c1-c6烷氧基、氨基、c1-c6烷基氨基、氨基c1-c6烷基氨基、苯基；
[0073]
所述酯为其中，x代表o或s；
[0074]
m代表c1-c18烷基、卤代c1-c8烷基、c3-c6环烷基、c2-c6烯基、卤代c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷氧羰基、c1-c6烷基磺酰基、氰基c1-c2烷基、硝基c1-c2烷基、c1-c6烷氧基c1-c2烷基、c1-c6烷氧羰基c1-c2烷基、c2-c6烯氧基羰基c1-c2烷基、-(c1-c2烷基)-z、四氢呋喃基、吡啶基、萘基、呋喃基、噻吩基、以及未取代或c1-c6烷基取代的未取代或被c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、c1-c6烷基氨基、卤素或c1-c6烷氧基取代的苯基；
[0075]
z代表四氢呋喃基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、萘基，以及未取代或被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤代c1-c6烷基、氰基和卤素中的至少一个基团取代的苯基；
[0076]
r3分别独立地代表c1-c6烷基；
[0077]
r4、r5、r6分别独立地代表氢、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基羰基；
[0078]
r’代表氢、c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基。
[0079]
在一个实施方案中，所述通式化合物i和i-1均为r构型(*处碳原子为手性中心)。在另一个实施方案中，所述通式化合物i中a代表氯、b代表氯、c代表氟、y代表氨基、q代表甲基，且为r构型(*处碳原子为手性中心)(即化合物a)；所述通式化合物i-1中a代表氯、b代表氯、c代表氟、y代表氨基、q代表甲基，x代表o，m代表甲基，且为r构型(*处碳原子为手性中心)(即化合物b)；或者所述通式化合物i-1中a代表氯、b代表氯、c代表氟、y代表氨基、q代表甲基，x代表o，m代表四氢呋喃-2-基甲基且为r构型(即化合物c)(*处碳原子为手性中心)。
[0080]
除草剂可施加至包含本发明提供的植物和种子的植物生长区域作为控制杂草的方法。本发明提供的植物和种子包含除草剂耐受性性状，且因此耐受一种或多种吡啶基氧基酸类除草剂的施加。在施加除草剂时，植物生长区可包括或可不包括杂草植物。
[0081]
除草剂施加可依次与几种吡啶基氧基酸类除草剂或任何其它相容性除草剂中的一种、两种或组合槽混。一种除草剂或两种或更多种除草剂组合或单独的多次施加可在生长季节内用于包含本发明的转基因植物的区域以用于控制广谱双子叶杂草、单子叶杂草或两者，例如，两次施加(如种植前施加和芽后施加或芽前施加和芽后施加)或三次施加(如种植前施加、芽前施加和芽后施加或芽前施加和两次芽后施加)。
[0082]
如本文所用，“耐受性”或“除草剂耐受性”意指植物、种子、植物组织、植物部分或细胞抵抗一种或多种除草剂的毒性作用的能力。植物、种子、植物组织、植物部分或细胞的除草剂耐受性可通过将植物、种子、植物组织、植物部分或细胞与合适的对照进行比较来测量。例如，除草剂耐受性可通过将除草剂施加至包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组dna分子的植物(测试植物)和不包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组dna分子的植物(对照植物)，且然后比较两种植物的植物损伤，其中测试植物的除草剂耐受性通过与对照植物的损伤率相比减少的损伤率指示。当与对照植物、种子、植物组织、植物部分或细胞相比时，除草剂耐受性植物、种子、植物组织、植物部分或细胞显示对除草剂的毒性作用的反应降低。如本文所用，“除草剂耐受性性状”是与野生型植物或对照植物相比赋予植物改善的除草剂耐受性的转基因性状。
[0083]
本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞和植物部分还可含有一种或多种另外的转基因性状。可通过使含有包含本发明提供的重组dna分子的转基因的植物与含有另外的转基因性状的另一种植物杂交来引入另外的转基因性状。如本文所用，“杂交”意指培育
两种单独的植物以产生子代植物。因此，两种转基因植物可杂交以产生含有转基因性状的子代。如本文所用，“子代”意指亲本植物的任何传代的后代，并且转基因子代包含由本发明提供并且从至少一种亲本植物遗传的dna构建体。或者，可通过用包含本发明提供的重组dna分子的dna构建体共转化所述另外的转基因性状的dna构建体(例如，其中所有的dna构建体呈现为用于植物转化的同一载体的部分)或通过将另外的性状插入包含本发明提供的dna构建体的转基因植物中或反之亦然(例如，通过使用关于转基因植物或植物细胞的植物转化的任何方法)来引入另外的转基因性状。此类另外的转基因性状包括但不限于增加的昆虫抗性、增加的水利用效率、增加的产量性能、增加的抗旱性、增加的种子质量、改进的营养品质、杂交种种子生产和除草剂耐受性，其中性状是相对于野生型植物或对照植物测量的。此类另外的转基因性状是本领域的技术人员已知的；例如，美国农业部(usda)动物和植物健康检查局(aphis)提供了此类性状的列表，并且可在它们的网站www.aphis.usda.gov上找到。
[0084]
含有本发明提供的转基因性状的转基因植物和子代可与本领域中通常已知的任何培育方法一起使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物系中，转基因性状可在包含三种或更多种转基因性状的植物系中独立地分离、连接或两者的组合。还考虑与亲本植物的回交和与非转基因植物的异交，以及无性繁殖。通常用于不同性状和作物的培育方法的描述是本领域的技术人员熟知的。为了证实转基因在特定植物或种子中的存在，可进行多种测定。此类测定包括例如分子生物学测定，如dna印迹和rna印迹、pcr和dna测序；生物化学测定，如例如通过免疫学方法(elisa和蛋白质印迹)或通过酶功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，如叶或根测定；以及还有通过分析整株植物的表型。
[0085]
作为回交转化过程的结果实现转基因性状向植物基因型的基因渗入。其中已经基因渗入转基因性状的植物基因型可称为回交转化的基因型、系、近交植物或杂交种。类似地，缺乏所需转基因性状的植物基因型可称为未转化的基因型、系、近交植物或杂交种。
[0086]
如本文所用，术语“包含”是指“包括但不限于”。
具体实施方式
[0087]
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并且因此可被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可用所获得的相同或相似的结果代替本文所述的试剂。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改被认为在如由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。
[0088]
实施例一.初始蛋白质工程化和酶分析
[0089]
通过对rdpa同源蛋白建模、分子对接，结合序列比对结果，使用本领域的技术人员已知的方法对候选位点进行突变，如丙氨酸扫描突变、同源性扫描突变、pro/gly扫描突变、区域互换或突变以及这些技术的组合(参见m lehmann和m wyss,current opinion in biotechnology(2001)12(4):371-375；b van den burg和vgh eijsink,current opinion in biotechnology(2002)13(4):333-337；以及weiss等人,proc natl acad sci u s a
(2000)97(16):8950
–
8954)。
[0090]
将合成编码每种工程化蛋白质的基因克隆至c-末端组氨酸标签(his-标签)的细菌表达载体中来实现高通量蛋白表达。将载体转化入大肠埃希氏菌(escherichia coli)(e.coli)，并且诱导工程化蛋白质的表达。挑选大肠埃希氏菌培养物在离心管中过夜培养，同时添加底物和iptg，第二天将培养物离心以沉淀细菌，或者挑选大肠埃希氏菌培养物在离心管中过夜培养，第二天添加底物反应后离心以沉淀细菌。吸取反应液上清至96孔板通过终点比色法测量来自4-氨基安替比林和铁氰化钾在510nm下的吸光度检测酚产物、以及通过高效液相色谱检测底物消减量和产物产生量来测量工程化蛋白的加氧酶活性(即，酶活性)，通过计算转化率来比较蛋白质的活性，结果如表1所示。
[0091]
转化率＝(初始底物峰面积-反应后底物峰面积)/初始底物峰面积*100％
[0092]
表1.各个突变体的转化率
[0093][0094][0095]
注：反应条件1：过夜培养细菌，并加入底物化合物a和iptg反应过夜；反应条件2：过夜培养细菌，第二日加入反应条件1中8倍剂量的底物化合物a反应3h。
[0096]
基于高通量液相测定系统的结果，选择具有代表性的工程化蛋白质进行蛋白纯
化。用来自表2的8种工程化蛋白质进行进一步蛋白质表征，如km、vmax和kcat。蛋白纯化使用常规ni柱亲和层析，通过sds-page分析评估蛋白质提取物纯度，通过bca法测定蛋白质浓度后进行酶活性测定，对照是纯化的野生型酶，使用0、5、10、20、50、200、500或1000μm的化合物a进行蛋白质的酶动力学测定。表2显示出对于化合物a为底物的8种蛋白质测量的km、vmax、kcat、kcat/km。这8种工程化蛋白质的酶动力学参数表明，可通过蛋白质工程化显著提高蛋白质的酶活性，即km和kcat。
[0097]
表2.工程化蛋白质的测定结果
[0098][0099]
注：n/d代表酶活性过低，无法测定其酶动力学参数。
[0100]
实施例二.水稻中工程化蛋白质的表达
[0101]
构建植物转化载体，载体为包含编码针对单子叶植物表达优化的工程化蛋白质(seq idno:42/38/82/86/102/106/126/138/142)编码序列的重组dna分子，使用根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法用这些载体转化水稻(金粳818)愈伤。在水稻苗生根阶段加入不同浓度的激素除草剂化合物b，用于测试激素抗性，其中，培养基中添加0.5μm、1μm化合物b19天后的对照金粳818植物和含seq id no:42蛋白编码基因的转基因金粳818植物的测试结果如图1所示。培养基中添加1μm化合物b后的对照金粳818植物和含seq id no:38/82/86/102/106/126/138/142蛋白编码基因的转基因金粳818植物的测试结果如图5-11所示。相比较野生型植物，含seq id no:42/38/82/86/102/106/126/138/142蛋白编码基因的金粳818植物显示出了更优的耐药性，这表明表达工程化蛋白质的植物在至少1μm化合物b培养基筛选时显示对化合物b除草剂的耐受性。
[0102]
然后，将获得的再生的t0代转基因小植物在温室中生长，并且在大约两叶一心生长阶段用化合物b喷洒。喷洒处理后记录评价植物的抗性程度，其中，施加20g、40g、60g、80g、100g、120g/亩(1亩＝1/15公顷)化合物b相应天数(dat)后的对照金粳818植物和含seq id no:42蛋白编码基因的转基因金粳818植物的测试结果如图2所示，相比较野生型植物，含seq id no:42蛋白编码基因的金粳818植物显示出了更优的耐药性，这表明表达工程化蛋白质的植物在叶片喷洒至少120g/亩化合物b时显示对化合物b除草剂的耐受性。
[0103]
综上所述，在t0代培养基加药测试和温室喷洒测试中，包含工程化蛋白质(seq id no:42/38/82/86/102/106/126/138/142)重组dna分子的载体相比较野生型均显示出明显的耐受性。
[0104]
将获得的再生t0代转基因小植物在温室中生长，并且在大约两叶一心生长阶段用化合物精喹禾灵喷洒。喷洒处理后记录评价植物的抗性程度，其中，施加0g、5g、10g/亩化合物精喹禾灵20dat后的对照金粳818植物和含seq id no:46蛋白编码基因的转基因金粳818植物的测试结果如图12所示，相比较野生型植物，含seq id no:46蛋白编码基因的金粳818
植物显示出了更优的耐药性，这表明表达工程化蛋白质的植物在叶片喷洒至少10g/亩化合物精喹禾灵时显示对化合物精喹禾灵除草剂的耐受性。
[0105]
将转化后的t0转基因植株在温室中生长。收取所有构建体转化产生的t1代水稻植物种子。通过t1代水中添加0.3μm化合物b浸种测试比较各构建体的抗性水平。通过测量各构建体的根长进行比较。如图13所示，添加0.3μm化合物b浸种处理20天后，含不同蛋白编码基因的t1代转基因金粳818种子相比较野生型金粳818均显示出了更优的耐药性，表现为根更长，这表明表达工程化蛋白质的植物在0.3μm化合物b水培浸种筛选时显示对化合物b除草剂的耐受性。
[0106]
实施例三.拟南芥中工程化蛋白质的表达
[0107]
选择工程化蛋白质用于拟南芥转化和植物分析。dna构建体通过根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法进行拟南芥转化。
[0108]
将转化后的t0转基因小植株在温室中生长。在生长约60天后，收取所有构建体转化产生的t1代拟南芥植物种子。通过t1代培养基中添加hyg来筛选转基因t1代拟南芥植物。使t1植物自交以产生t2拟南芥植物种子。其中，在培养基中添加化合物a筛选测试所有构建体产生的含有通过t1代筛选的独特事件的t2代拟南芥植物种子，如图3、14-22所示，添加0.15μm化合物a筛选相应天数后，含seq id no:46/42/78/82/86/98/102/126/138/142蛋白编码基因的t2代转基因拟南芥种子相比较野生型拟南芥显示出了更优的耐药性，表现为根更长，叶片更大。这表明表达工程化蛋白质的植物在0.15μm化合物a培养基筛选时显示对化合物a除草剂的耐受性。
[0109]
另外，通过喷洒化合物b测试部分构建体产生的含有通过t1代筛选的独特事件的t2代拟南芥植物，其中，植物叶片喷洒40g/亩化合物b12天后的对照转rdpa野生型基因拟南芥植物和含seq id no:42蛋白编码基因的拟南芥植物的测试结果如图4所示，相比较转野生型植物，含seq id no:42蛋白编码基因的拟南芥植物显示出了更优的耐药性，这表明表达工程化蛋白质的植物在叶片喷洒化合物b 40g/亩时显示对化合物b除草剂的耐受性。
[0110]
实施例四.大豆中工程化蛋白质的表达
[0111]
选择工程化蛋白质用于大豆转化和植物分析。dna构建体通过根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法进行大豆转化。
[0112]
将转化后的t0转基因小植株在温室中生长。对t0代转基因小植株喷药10g化合物c测试。如图23所示，含seq id no:46蛋白编码基因的转基因大豆相比较野生型大豆表现出明显的抗性。收取所有构建体转化产生的t1代大豆植物种子，对t1代苗喷洒10g化合物c测试。如图24所示，含seq id no:46蛋白编码基因的转基因大豆相比较野生型大豆仍表现出明显的抗性。对部分构建体的t1代转基因小植株喷洒10g、20g、40g、80g化合物c，如图25-26，含seq id no:42蛋白编码基因的转基因大豆相比较野生型大豆在至少40g化合物c时具有更优的耐药性。
[0113]
实施例五.玉米中工程化蛋白质的表达
[0114]
选择工程化蛋白质用于玉米转化和植物分析。dna构建体通过根癌土壤杆菌和本领域中已知的标准方法进行玉米转化。
[0115]
将转化后的t0转基因小植株在温室中生长。对t0代转基因小植株喷药150g、250g、400g、600g、800g 30％草甘膦
·
化合物c(25 5)me测试。如图27所示，各浓度处理野生型均
死亡，转基因小植株处理浓度低于600g时无明显药害反应(低于600g的数据代表图如图27最左侧所示)；600g时茎基部略微膨大，整株生长抑制明显，植株状态正常；800g时茎基部膨大明显，整株生长受抑制进一步加强，叶色变浅无光泽。由此得出含seq id no:46蛋白编码基因的转基因玉米相比较野生型玉米可在600g 30％草甘膦
·
化合物c(25 5)me时有更优的抗药性。
[0116]
同时经过很多测试发现，将本发明所述重组dna分子导入拟南芥、二穗短柄草等模式植物中，都产生了对吡啶基氧基酸类除草剂相应水平的耐药性提升。由此可知，将其转基因到其他植物，如粮食作物、豆类作物、油料作物、纤维作物、水果类作物、根茎类作物、蔬菜类作物、花卉作物、药用作物、原料作物、牧草作物、糖料作物、饮料作物、草坪植物、树木作物、坚果作物等，也会产生相应的抗性性状，具有良好的产业价值。