一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法与流程

1000nt。
13.在一些实施例中，所述方法由自动化操作台实现。
14.第二方面，本发明的实施例提出一种根据第一方面任一实施例在以下中的至少一种中的应用：a.纳米核酸制品的制备；b.分子克隆；和c.疾病诊断。
15.在一些实施例中，其中所述纳米核酸制品包括包覆有环状核酸分子的磁珠、核酸纳米球、包含环状核酸分子的纳米线、纳米盒和纳米芯片，其中所述核酸为dna和/或rna。
16.本发明实施例提供的基于单次加样的连接环化单链核酸的方法具有以下有益效果：
17.(1)能够一次性添加所有组分形成单链核酸的环化体系，能够应用于自动化环化，减少了人工成本。
18.(2)能够应用于高温催化，提高了单链核酸的环化连接效率。
附图说明
19.图1是本发明实施例的基于单次加样的连接环化单链核酸的方法示意图；
20.图2是本发明实施例的分子内环化效率结果图；
21.图3是本发明另一个实施例的分子内环化效率结果图；
22.图4是本发明实施例的分子间环化效率结果图。
23.标记：
24.a:dna marker；b:ssdna；c:连接环化产物。
具体实施方式
25.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
26.应理解，本发明的实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
27.第一方面，本发明的实施例提出一种基于单次加样的连接环化单链核酸的方法，其特征在于，包括：将待连接环化的单链核酸和其他组分一次性混合，以形成环化体系；和将所述环化体系置于连接环化条件，以使所述待连接环化的单链核酸连接环化，其中所述核酸为dna和/或rna，所述其他组分包括热稳定性dna连接酶和/或rna连接酶和可选地反应缓冲液。
28.在一些实施例中，所述连接环化为分子间或分子内的连接环化，所述单链dna的5
’‑
磷酸基团末端的核苷酸序列和3
’‑
羟基基团末端的核苷酸序列互补配对。当所述单链dna的5
’‑
磷酸基团末端的核苷酸序列和3
’‑
羟基基团末端的核苷酸序列互补配对时，两个末端的空间距离接近，有利于热稳定性dna连接酶和/或rna连接酶发挥催化作用。
29.在一些实施例中，所述其他组分还包括接头，其中：在所述连接环化为分子内的连接环化的情况下，所述接头与同一条所述单链dna的5
’‑
磷酸基团末端的核苷酸序列和3
’‑
羟基基团末端的核苷酸序列互补配对；在所述连接环化为分子间的连接环化的情况下，所
述接头分别与两条所述单链dna中的一者的5
’‑
磷酸基团末端的核苷酸序列和另一者的3
’‑
羟基基团末端的核苷酸序列互补配对。
30.在一些实施例中，所述连接环化条件包括：变性、复性和反应，其中变性温度为70-80℃，复性温度为0-70℃，反应温度为55-70℃。
31.在一些实施例中，所述连接环化条件包括：变性、复性和反应，其中变性温度为70℃，复性温度为室温25℃，反应温度为65℃。
32.在一些实施例中，所述变性持续2-10分钟，所述复性持续2-40分钟，并且所述反应持续30-240分钟。
33.在一些实施例中，所述变性持续5分钟，所述复性持续5分钟，并且所述反应持续120分钟。
34.在一些实施例中，在所述复性后、进行所述反应前，不进行将所述其他组分添加至所述环化体系的步骤。
35.在一些实施例中，所述其他组分中不包括atp。
36.在一些实施例中，所述热稳定性dna连接酶和/或rna连接酶为非atp依赖的circligase。
37.需要说明的是，circligase是一种热稳定连接酶，对同时具有5
’‑
磷酸基团和3
’‑
羟基基团的单链dna和/或rna底物的分子内连接(即环化)进行催化。通常线性ssdna能够被circligase ii ssdna连接酶环化的长度大于15个碱基。能够理解的是，ssdna的序列可以影响环化反应的效率。
38.在一些实施例中，所述单链dna的长度为50-1000nt，连接环化产物的长度为50-1000nt。
39.在一些实施例中，所述方法由自动化操作台实现。所述自动化操作台包括自动加样装置，控温装置等。
40.在一些实施例中，所述单链dna具有如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的序列。
41.seq id no:1具有的核苷酸序列为5
’‑
atccaccggtcatggtgagcaagggcgccgagctgttcaccggcatcgtgcccatcctgatcgagctgaatggcgatgtgaatggccacaagttcagcgtgagcggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcctgtgccctggcccaccctggtgaccaccctgagctacggcgtgcagtgcttctcacgctaccccgatcacatgaagcagcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggctacatccaggagcgcaccatcttcttcgaggatgacggcaactacaagtcgcgcgccgaggtgaagttcgagggcgataccctggtgaatcgcatcgagctgaccggcaccgatttcaaggaggatggcaacatcctgggcaataagatggagtacaactacaacgcccacaatgtgtacatcatgaccgacaaggccaagaatggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggatggcagcgtgcagctggccgaccactaccagcagaatacccccatcggcgatggccctgtgctgctgcccgataaccactacctgtccacccagagcgccctgtccaaggaccccaacgagaagcgcgatcacatgatctacttcggcttcgtgaccgccgccgccatcacccacggcatggatgagctgtacaagtgagcggccgcgactctagataattcttgctcaccatgaccggcaagt，下划线部分互补配对。
42.seq id no:2具有的核苷酸序列为
[0043]5’‑
atccaccggtcatggtgagcaagggcgccgagctgttcaccggcatcgtgcccatcctgatcgagctgaatggcgatgtgaatggccacaagttcagcgtgagcggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctga
ccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcctgtgccctggcccaccctggtgaccaccctgagctacggcgtgcagtgcttctcacgctaccccgatcacatgaagcagcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggctacatccaggagcgcaccatcttcttcgaggatgacggcaactacaagt。
[0044]
seq id no:3具有的核苷酸序列为5
’‑
atccaccggtcatggtgagcaagggcgccgagctgttcaccggcatcgtgcccatcctgatcgagctgaatggcgatgtgaatggccacaagttcagcgtgagcggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagct。
[0045]
seq id no:4具有的核苷酸序列为5
’‑
atgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcctgtgccctggcccaccctggtgaccaccctgagctacggcgtgcagtgcttctcacgctaccccgatcacatgaagcagcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggctacatccaggagcgcaccatcttcttcgaggatgacggcaactacaagt。
[0046]
在一些实施例中，所述接头dna具有如seq id no:5或seq id no:6所示的序列。
[0047]
seq id no:5具有的核苷酸序列为
[0048]5’‑
tgctcaccatgaccggtagttgccgtcatcct，下划线部分与seq id no:2具有的核苷酸序列中下划线部分互补配对。
[0049]
seq id no:6具有的核苷酸序列为
[0050]5’‑
tcagcttgccgtaggtgccgtaggtggcatcg，下划线部分与seq id no:3和seq id no:4具有的核苷酸序列中下划线部分互补配对。
[0051]
第二方面，本发明的实施例提出一种根据第一方面任一实施例所述的方法在以下中的至少一种中的应用：a.纳米核酸制品的制备；b.分子克隆；和c.疾病诊断。
[0052]
在一些实施例中，其中所述纳米核酸制品包括包覆有环状核酸分子的磁珠、核酸纳米球、包含环状核酸分子的纳米线、纳米盒和纳米芯片，其中所述核酸为dna和/或rna。
[0053]
实施例1
[0054]
本实施例为单个单链dna的分子内末端互补配对的连接环化。
[0055]
(1)将所有组分一次性加入pcr管中以形成环化体系，环化体系如表1所示。
[0056]
表1环化体系
[0057][0058]
(2)将pcr管按照表2所述条件进行环化。
[0059]
表2环化条件
[0060]
[0061][0062]
获得的环化单链dna如图2所示，环化产物条带明显，副产物少。
[0063]
实施例2
[0064]
实施例2为单个单链dna的分子内末端非互补配对的连接环化。
[0065]
(1)将所有组分一次性加入pcr管中以形成环化体系，环化体系如表3所示。
[0066]
表3环化体系
[0067][0068]
(2)将pcr管按照表4所述条件进行环化。
[0069]
表4环化条件
[0070]
70℃5minrt5min65℃2h85℃10min(alternative)
[0071]
通过本实施例能够获得分子内环化单链dna，如图3所示。
[0072]
实施例3
[0073]
实施例3为两个单链dna的分子间末端非互补配对的连接环化。
[0074]
(1)将所有组分一次性加入pcr管中以形成环化体系，环化体系如表5所示。
[0075]
表5环化体系
[0076][0077]
(2)将pcr管按照表6所述条件进行环化。
[0078]
表6环化条件
[0079]
70℃5minrt5min65℃2h85℃10min(alternative)
[0080]
通过本实施例能够获得分子间末端非互补配对的环化单链dna，如图4所示。
[0081]
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0082]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0083]
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0084]
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示
第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
[0085]
在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0086]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。