用于检测2019冠状病毒病(COVID-19)的测定的制作方法

用于检测2019冠状病毒病(covid-19)的测定
1.相关申请的交叉参考本技术要求2020年3月26日递交的美国临时申请号63/000,304、2020年3月27日递交的美国临时申请号63/000,971、2020年4月3日递交的美国临时申请号63/004,773、2020年7月8日递交的美国临时申请号63/049,237和2021年3月2日递交的美国临时申请号63/155,599的权益，上述申请中每一个的内容通过参考以其全部结合至本文中。
2.以电子方式提交的资料的通过参考结合本文通过参考以其全部结合的是随同此文同时提交并且标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：2021年3月24日创建的命名为“2021-03-24_38391-601_sql_st25.txt”的一个5136字节的ascii(文本)文件。
3.领域本公开涉及用于从sars-cov-2扩增目标核酸序列并检测covid-19的方法。
4.发明背景2019年底，一种新型冠状病毒(sars-cov-2(2019-ncov))作为人类病原体，导致发烧、严重呼吸道疾病和肺炎。与sars-cov-2相关的疾病命名为covid-19。这种新型冠状病毒为乙型冠状病毒属的一个成员，与几种蝙蝠冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)密切相关。然而，与sars-cov不同，sars-cov-2在人类之间快速传播。
5.截至2021年2月底，在超过200个国家确诊了超过1亿例covid-19病例，covid-19并发症被引证为导致超过250万个体的死亡。
6.发明概述本公开提供用于扩增和检测样品中的冠状病毒sars-cov-2的包括寡核苷酸在内的试剂。在一些实施方案中，寡核苷酸组包含至少一种第一扩增寡核苷酸、至少一种第二扩增寡核苷酸和至少一种探针寡核苷酸。探针寡核苷酸可包含可检测标记(例如荧光团)。在一些实施方案中，寡核苷酸组用于样品中的sars-cov-2的重组酶-聚合酶扩增和检测。在一些实施方案中，试剂包含含有一组或更多组寡核苷酸的寡核苷酸群组。
7.在一些实施方案中，用于样品中sars-cov-2的重组酶-聚合酶扩增和检测的寡核苷酸组包含：含有与seq id no:17具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:19具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:18具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或含有与seq id no:20或21具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:25或26具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:22-24中的任何一个具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或其组合，其中每个探针寡核苷酸含有可检测标记。在一些实施方案中，第一扩增寡核苷酸包含与seq id no:20具有至少70％相似性的核酸序列，第二扩增寡核苷酸包含与seq id no:25具有至少70％的相似性的核酸序列，和探针寡核苷酸包含与seq id no:22或23具有至少70％相似性的核酸序列。在一些实施方案中，第一扩增寡核苷酸包含与seq id no:21具有至少70％相似性的核酸序列，第二扩增寡核苷酸包含与seq id no:25或26具有至少70％的相似性的核酸序列，和探针寡核苷酸包
含与seq id no:24具有至少70％相似性的核酸序列。
8.在一些实施方案中，用于扩增和检测样品中的sars-cov-2的寡核苷酸群组包含第一组寡核苷酸，第一组寡核苷酸包含含有与seq id no:2具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:4具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:6具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸群组进一步包含第二组寡核苷酸，第二组寡核苷酸包含：含有与seq id no:11和15中的任何一个具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:3具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id:5具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸。
9.本公开还提供用于检测样品中的sars-cov-2的方法。样品可包含鼻拭子或鼻刷、唾液、粘液、血液、血清、血浆或粪便。
10.在一些实施方案中，方法包括：使样品与如本文所述的寡核苷酸组或群组和用于扩增的试剂接触；使用重组酶-聚合酶扩增(rpa)来扩增样品中存在的一个或多个目标sars-cov-2核酸序列；使一个或多个寡核苷酸探针与一个或多个扩增的目标sars-cov-2核酸序列杂交；和通过测量来自可检测标记的信号，检测一个或多个探针寡核苷酸序列与一个或多个扩增的sars-cov-2目标核酸序列的杂交。在一些实施方案中，方法进一步包括使来自寡核苷酸组的第一和第二扩增寡核苷酸与重组酶剂接触。来自可检测标记的一个或多个信号的存在可表明一个或多个探针寡核苷酸与一个或多个扩增的sars-cov-2目标核酸序列的杂交。
11.用于扩增的试剂可包括：聚合酶；重组酶剂；重组酶负载蛋白；单链结合蛋白；切口酶；解旋酶；解离酶；酶辅助因子；缓冲剂；脱氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸；群集剂；atp、atp类似物或atp生成系统；或其组合。
12.本公开进一步提供用于检测样品中的sars-cov-2的试剂盒，其包含至少一个寡核苷酸组、如本文公开的任何寡核苷酸、用于扩增和检测核酸序列的试剂和/或使用说明。
13.根据以下详细描述和附图，本公开的其他方面和实施方案将显而易见。
14.附图简述本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开的复印件将由专利局根据要求并支付必要的费用后提供。
15.图1a和1b为使用各种扩增和探针寡核苷酸组合的sars-cov-2的重组酶-聚合酶扩增(rpa)的图表。
16.发明详述本公开至少部分地基于一系列便于快速检测covid-19的寡核苷酸序列的开发。
17.如本文使用的术语“包含”、“包括”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以”、“含有”及其变体旨在为不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡性短语、术语或词语。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个”、“和”和“该”包括复数指涉。本公开还考虑“包含”本文呈现的实施方案或要素、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施方案，无论是否明确阐述。
18.对于本文数字范围的叙述，均明确地考虑具有相同程度的精度的每个之间的中间数字。例如，对于6-9的范围，除6和9之外，也考虑数字7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地考
虑数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
19.术语“第一”和“第二”在本公开中仅以其相对意义使用。应当理解的是，除非另外说明，否则使用这些术语仅是为了方便描述一个或多个实施方案起见。术语“第一”和“第二”仅用于区分一个要素与另一个要素，并且所公开技术的权利范围不应受这些术语的限制。例如，第一元素可指定为第二要素，并且类似地第二元素也可指定为第一要素。
20.如本文使用的术语“寡核苷酸”是指包含约2-约100个核苷酸(例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100个核苷酸，或由任何上述值定义的范围)的短核酸序列。如本文使用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，可为核糖核苷酸(rna)或脱氧核糖核苷酸(dna)。这些术语是指分子的一级结构，并且因此包括双链和单链dna以及双链和单链rna。这些术语包括作为等价物的由核苷酸类似物和修饰的多核苷酸(比如甲基化和/或加帽多核苷酸)制成的rna或dna类似物。核酸一般地经磷酸酯键连接以形成核酸序列或多核苷酸，尽管本领域已知许多其他键合(例如硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯等)。
21.寡核苷酸可为单链或双链的，或者可含有双链和单链序列两者的部分。寡核苷酸可为dna(基因组和互补dna(cdna)两者)、rna或杂合体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合。寡核苷酸可通过化学合成方法或通过重组方法得到。
22.如本文使用的术语“百分比序列同一性”是指在比对两个序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大百分比同一性之后，与参考序列中相应的核苷酸或氨基酸相同的核酸序列中核苷酸或核苷酸类似物或者氨基酸序列中氨基酸的百分比。因此，如果根据该技术的核酸长于参考序列，则对于确定序列同一性不考虑核酸中不与参考序列比对的另外的核苷酸。用于比对的方法和计算机程序为本领域众所周知的，包括blast、align 2和fasta。
23.除非本文另外定义，否则与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当是清楚的；然而，如果存在任何潜在歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。进一步地，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数和复数术语应包括单数。
24.以下描述优选的方法和材料，尽管可在本公开的实践或测试中使用与本文描述的方法和材料类似或等效的那些。本文中提及的所有公开、专利申请、专利和其他参考文献通过参考以其全部结合。本文公开的材料、方法和实例仅为说明性的，并且不旨在为限制性的。本文使用的章节标题仅出于组织目的，并且不得解释为以任何方式限制描述的主题。
25.1.扩增和探针寡核苷酸在一个实施方案中，本文描述的寡核苷酸可用于核酸扩增(例如引物)或作为用于核酸杂交和检测的探针。如本文使用的术语“引物”、“引物序列”、“引物寡核苷酸”和“扩增寡核苷酸”是指当在存在核苷酸和核酸聚合剂(例如dna依赖性或rna依赖性聚合酶)的情况下置于合适的扩增条件(例如缓冲剂、盐、温度和ph)下时，能够充当作为核酸(所有类型的dna或rna)的互补链的延伸产物的合成起始点的寡核苷酸。本公开的扩增寡核苷酸可具有任何合适的大小，并且期望地包含约15-50个核苷酸，优选地约20-40个核苷酸，基本上由其组成或由其组成。本公开的寡核苷酸除本文描述的那些之外还可含有另外的核苷酸。根据
所采用的扩增过程的类型，扩增寡核苷酸可包括例如切口酶位点和上游稳定区(参见例如美国专利号9,689,031、9,617,586、9,562,264和9,562,263，其每一个通过参考以其全部结合至本文中)。
26.术语“探针”、“探针序列”和“探针寡核苷酸”是指可在适当的杂交条件下与目标序列的至少一部分(例如已扩增的目标序列的一部分)选择性地杂交的寡核苷酸。通常，探针序列标识为“互补”(例如与编码或有义链( )互补)或“反向互补”(例如与反义链(-)互补)。本公开的探针可具有任何合适的大小，并且期望地包含约10-50个核苷酸，优选地约12-35个核苷酸，基本上由其组成或由其组成。
27.如本文使用的术语“组”、“引物组”、“探针组”以及“引物和探针组”是指一起能够引发感兴趣的目标序列或目标核酸(例如sars-cov-2内的目标序列)的扩增的两个或更多个寡核苷酸和/或至少一个可检测目标序列或目标核酸的探针。在某些实施方案中，术语“组”是指一对寡核苷酸，其包括与要扩增的目标序列或目标核酸的5
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末端杂交的第一寡核苷酸和与要扩增的目标序列或目标核酸的互补物杂交的第二寡核苷酸。
28.本文描述的寡核苷酸组可用于扩增和检测样品中的一个或多个目标sars-cov-2(2019-ncov)序列。术语“目标序列”和“目标核酸”在本文中可互换使用，并且是指将通过所公开的方法检测其存在或不存在的特定核酸序列。在本公开的情况下，目标序列优选地包括一个或多个寡核苷酸将与之杂交并由此开始扩增的核酸序列。目标序列还可包括探针可与之在适当扩增条件下形成稳定杂合体的探针杂交区域。目标序列可为单链或双链的。目标sars-cov-2序列可位于sars-cov-2基因组的任何部分内，例如编码核衣壳(n)蛋白的基因或编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp)的基因内。
29.在一些实施方案中，该组包含第一扩增寡核苷酸、第二扩增寡核苷酸和探针寡核苷酸。在一些实施方案中，该组包含含有与seq id no:1和10-16中的任何一个具有至少70％(例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:3具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:5具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或者含有与seq id no:2具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:4具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:6具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或者含有与seq id no:7具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:8具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:9具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或者含有与seq id no:17具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id:19具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:18具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或者含有与seq id no:20或21具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq idno:25或26具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:22-24中的任何一个具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或其组合。
30.在一些实施方案中，该组包含含有与seq id no:1和10-16中的任何一个具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:3具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:5具有至少70％相似性的核酸序列的探
针寡核苷酸；和含有与seq id no:2具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:4具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:6具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸。
31.在一些实施方案中，该组包含含有与seq id no:20具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:25具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:22或23具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸。
32.在一些实施方案中，该组包含含有与seq id no:21具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:25或26具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:24具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸。
33.在一些实施方案中，该组包含用于重组酶-聚合酶扩增和检测样品中的sars-cov-2(2019-ncov)的寡核苷酸，其包含：含有与seq id no:17具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:19具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:18具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或者含有与seq id no:20或21具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:25或26具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:22-24中的任何一个具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或其组合，其中每个探针寡核苷酸包含可检测标记。在一些实施方案中，第一扩增寡核苷酸包含与seq id no:20具有至少70％相似性的核酸序列，第二扩增寡核苷酸包含与seq id no:25具有至少70％相似性的核酸序列，和探针寡核苷酸包含与seq id no:22或23具有至少70％相似性的核酸序列。在一些实施方案中，第一扩增寡核苷酸包含与seq id no:21具有至少70％相似性的核酸序列，第二扩增寡核苷酸包含与seq id no:25或26具有至少70％相似性的核酸序列，和探针寡核苷酸包含与seq id no:24具有至少70％相似性的核酸序列。
34.在一些实施方案中，用于扩增和检测样品中的sars-cov-2(2019-ncov)的寡核苷酸群组包含第一组寡核苷酸，其包含：含有与seq id no:2具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:4具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与序列id no：6具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸，其中探针寡核苷酸包含可检测标记。
35.在一些实施方案中，该群组进一步包含第二组寡核苷酸，其包含：含有与seq id no：11和15中的任何一个具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no：3具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no：5具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸，其中探针寡核苷酸包含可检测标记。
36.表1：寡核苷酸序列 序列5’至3’长度seq id no：1aaagaagaaggctgatgaaact22seq id no：5ccttaccgcagagacagaagaaacagc27seq id no：3tggagaaatcatccaaatctg21seq id no：2tgcttagaattatggcctcact22seq id no：6cgtgttgtagcttgtcacaccgtttcta28seq id no：4atacttgagcacactcattag21
seq id no：7cgactccacacggagtcgcattgtgcaaacttt33seq id no：8cgactccacacggagtcgtgggaacactgtaga33seq id no：9ctttaatgtttactgtagagaataaaacattaaag35seq id no：10aaagaagaacgctgatgaaact22seq id no：11aaagaagaagcctgatgaaact22seq id no：12aaagaagaacgctgatgaaac21seq id no：13gagcctaaaaaggacaaaaagaag24seq id no：14gagcctaaataggacaaaaagaag24seq id no：15ggctgatgaaactcaagc18seq id no：16attcccaccaacagagcct19表2：寡核苷酸序列本文描述的任何寡核苷酸均可以任何合适的方式进行修饰，以稳定或增强寡核苷酸对其目标的结合亲和力。例如，如本文描述的寡核苷酸序列可包含一个或多个修饰的寡核苷酸。此外，列出的任何序列(其包括内部间隔基或修饰)均可在没有修饰或间隔基的情况下使用。
37.本文描述的任何寡核苷酸可包括例如间隔基、封闭基团和修饰核苷酸。修饰核苷酸为在组成和/或结构上不同于天然核苷酸和核苷三磷酸的核苷酸或核苷三磷酸。修饰包括由修饰核苷酸的酶比如甲基转移酶修饰而产生的天然存在的那些。修饰核苷酸还包括合成或非天然存在的核苷酸。例如，修饰核苷酸包括具有2’修饰比如2
’‑
o-甲基和2
’‑
氟的那些。其他2
’‑
修饰核苷酸为本领域已知的，并且描述于例如美国专利号9,096,897中，其通过参考以其全部结合至本文中。例如，本文中使用的修饰核苷酸或核苷三磷酸可以以下方式进行修饰，所述方式使得当修饰存在于其中存在限制性核酸内切酶识别位点的双链核酸的一条链上时，修饰核苷酸或核苷三磷酸保护修饰链免受限制性酶的切割。
38.封闭基团或聚合酶阻止分子(polymerase-arresting molecule)为抑制经由聚合酶的目标序列独立的核酸聚合的化学部分。封闭基团可使寡核苷酸能够结合目标核酸分
reagent company(midland,tx)、eurofins scientific(louisville,ky)、biosearch technologies,inc.(novato,ca)等。寡核苷酸可使用本领域已知的任何合适的方法纯化，所述方法比如天然丙烯酰胺凝胶电泳、阴离子交换hplc(参见例如pearson等人,j.chrom.,255:137-149(1983)，通过参考结合至本文中)和反相hplc(参见例如mcfarland等人,nucleic acids res.,7:1067-1080(1979)，通过参考结合至本文中)。
41.寡核苷酸的序列可使用本领域已知的任何合适的测序方法验证，所述测序方法包括但不限于化学降解(参见例如maxam等人,methods of enzymology,65:499-560(1980)，通过参考结合至本文中)、基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof)质谱(参见例如pieles等人,nucleic acids res.,21:3191-3196(1993)，通过参考结合至本文中)、碱性磷酸酶和核酸外切酶消化组合后的质谱(wu等人,anal.biochem.,290:347-352(2001)，通过参考结合至本文中)等。
42.2.可检测标记本文描述的任何一个或多个寡核苷酸序列可包含可检测标记，使得可测量一个或多个扩增寡核苷酸和/或探针寡核苷酸。在一个实施方案中，本文描述的每个探针寡核苷酸序列包含可检测标记。如本文使用的术语“可检测标记”是指产生可测量的并且其强度同与之结合的实体量相关(例如成比例)的信号的部分或化合物。可使用任何合适的可与寡核苷酸缀合或连接以检测寡核苷酸与目标序列的结合的可检测标记，其中许多为本领域已知的。在一个实施方案中，可间接地检测可检测标记。间接可检测标记一般地为连同连接或偶联于直接可检测标记的“缀合物”一起使用的特异性结合成员。用于合成这种缀合物的偶联化学为本领域众所周知的，并且经设计使得特异性结合成员的特异性结合特性和标记的可检测特性保持完整。如本文所用的“特异性结合成员”和“缀合物”是指结合对的两个成员，例如两个不同分子，其中特异性结合成员与本公开的多核苷酸特异性地结合，而“缀合物”与特异性结合成员特异性地结合。成对的两个成员之间的结合一般地在性质上为化学或物理的。这种结合对的实例包括但不限于抗原和抗体、亲和素/链霉亲和素和生物素、半抗原和半抗原特异性抗体、互补核苷酸序列、酶辅助因子/底物和酶等。
43.每个探针寡核苷酸序列均期望地包含可检测标记。每个探针可用相同的可检测标记或不同的可检测标记进行标记。
44.在一些实施方案中，可检测标记可直接检测。这种直接可检测标记包括例如放射性同位素、荧光团、化学发光体、酶、胶体颗粒、荧光微粒、嵌入染料(例如sybr green或溴化乙啶)等。在选定实施方案中，可检测标记可为荧光团，比如荧光素族染料、多卤代荧光素族染料、六氯荧光素族染料、香豆素族染料、罗丹明族染料、花青族染料、嗪族染料、噻嗪族染料、方酸族染料、螯合镧系族染料、偶氮族染料、三苯基甲烷族染料或族染料。荧光团的实例包括但不限于fam
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、、hex
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、joe
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、ned
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、rox
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、tamra
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、tet
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、texas和本领域的技术人员应当意识到，直接可检测标记可能需要另外的成分，比如底物、触发试剂、光等，以使得能够检测标记。用于标记寡核苷酸(比如探针)的方法为本领域众所周知的，并且描述于例如l.j.kricka,ann.clin.biochem.,39:114-129(2002)；van gijlswijk等人,expert rev.mol.diagn.,1:81-91(2001)；joos等人,j.biotechnol.,35:135-153(1994)；smith等人,nucl.acids res.,13:2399-2412(1985)；connoly等人,nucl.acids.res.,13:4485-4502(1985)；broker
等人,nucl.acids res.,5:363-384(1978)；bayer等人,methods of biochem.analysis,26:1-45(1980)；langer等人,proc.natl.acad.sci.usa,78:6633-6637(1981)；richardson等人,nucl.acids res.,11:6167-6184(1983)；brigati等人,virol.,126:32-50(1983)；tchen等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:3466-3470(1984)；landegent等人,exp.cell res.,15:61-72(1984)；a.h.hopman等人,exp.cell res.,169:357-368(1987)；和temsamani等人,mol.biotechnol.,5:223-232(1996)中，其每一个通过参考以其全部结合至本文中。
45.在一些实施方案中，本文描述的任何一个或多个寡核苷酸也可包含淬灭剂部分。当可检测标记(例如荧光团)和淬灭剂部分保持非常接近时(比如在探针末端)，淬灭剂部分阻止来自可检测标记的信号(例如荧光)被检测。当两个部分物理分离时，信号变为可检测。淬灭剂可选自本领域已知的任何合适的淬灭剂，比如black holeholeholeblack hole2black holeholeholeiowafq和iowarq。例如，寡核苷酸探针可包含fam荧光团、或quasar荧光团和bhq-1或bhq-2淬灭剂。
46.特定标记和标记技术的选择将取决于几个因素，比如标记方法的容易程度和成本、使用的不同可检测标记之间的光谱间距、期望的样品标记质量、可检测部分对杂交反应(例如对杂交过程的速率和/或效率)的影响、使用的扩增方法的性质、检测系统的性质、由可检测标记产生的信号的性质和强度等。
47.3.用于扩增和检测sars-cov-2(2019-ncov)的方法本公开提供一种用于检测样品中的sars-cov-2(2019-ncov)的方法。方法包括：使样品与本文公开的寡核苷酸组和用于扩增的试剂接触；扩增样品中存在的一个或多个目标sars-cov-2核酸序列；使一个或多个寡核苷酸探针与一个或多个扩增的目标sars-cov-2核酸序列杂交；和通过测量来自可检测标记的信号，检测一个或多个探针寡核苷酸序列与一个或多个扩增的sars-cov-2目标核酸序列的杂交。本文关于上述寡核苷酸组阐述的寡核苷酸的描述也适用于所公开的方法。
48.样品可为获自任何合适的受试者，一般地为哺乳动物(例如狗、猫、兔、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、非人灵长类或人类)的任何合适的样品。优选地，受试者为人类。样品可获自任何合适的生物来源(比如鼻拭子或鼻刷)或生理流体(包括但不限于全血、血清、血浆、间质液、唾液、接目镜液、脑脊液、汗液、尿液、奶、腹水、粘液、滑液、腹膜液、阴道液、月经、羊水、精液、粪便等)。
49.可使用本领域技术人员已知的常规技术从受试者获得样品，并且可如从生物来源所获得的那样直接使用样品，或者在预处理以修改样品的特性后使用样品。这种预处理可包括例如从血液制备血浆、稀释粘性流体、过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰成分的灭活、添加试剂、裂解等。
50.在从受试者获得样品之后，样品可与包含如本文描述的扩增寡核苷酸和探针的寡核苷酸组接触以形成反应混合物。然后将反应混合物置于扩增条件下。如本文使用的术语“扩增条件”是指促进扩增寡核苷酸退火和/或延伸的条件。这种条件为本领域众所周知的并且取决于选择的扩增方法。扩增条件包括所有反应条件，包括但不限于温度和/或温度循环、缓冲剂、盐、离子强度、ph等。
51.扩增样品中的sars-cov-2核酸序列可使用本领域已知的任何合适的核酸序列扩增方法进行。在一些实施方案中，扩增包括但不限于聚合酶链反应(pcr)、反转录酶pcr(rt-pcr)、实时pcr、转录介导扩增(tma)、滚环扩增、基于核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)、转录介导扩增(tma)、单引物等温扩增(spia)、解旋酶依赖性扩增(hda)、环介导扩增(lamp)、重组酶-聚合酶扩增(rpa)和连接酶链反应(lcr)。在一些实施方案中，sars-cov-2(2019ncov)核酸序列的扩增使用等温扩增(例如rpa或near)进行。在一些实施方案中，sars-cov-2核酸序列的扩增和检测使用护理点装置(例如id now系统(abbott))进行。
52.在一些实施方案中，sars-cov-2核酸序列的扩增使用实时pcr进行。如本文使用的“实时pcr”是指其中随着反应进行实时测量扩增产物的累积并在每个循环之后进行产物定量的pcr方法，与其中在终点分析中检测扩增的dna产物的常规pcr形成对比。实时pcr在本领域也称为“定量pcr(qpcr)”。pcr产物的实时检测一般地涉及使用插入任何双链dna的非特异性荧光染料和序列特异性荧光标记的dna探针。实时pcr技术和系统为本领域已知的(参见例如dorak,m.tevfik,ed.real-time pcr.taylor&francis(2007)；和fraga等人,“real-time pcr,”current protocols essential laboratory techniques:10-3(2008)，其每一个通过参考以其全部结合至本文中)和从各种来源市售获得(例如m2000rt realtime
tm pcr系统(abbott molecular,inc.,des plaines,il)、cfx real-time pcr detection systems(bio-rad laboratories,inc.,hercules,ca)和taqman
tm real-time pcr system(thermofisher scientific,waltham,ma))，其任何一种均可用于本文描述的方法中。
53.用于扩增的寡核苷酸组可包含含有与seq id no:1和10-16中的任何一个具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:3具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:5具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸和/或含有与seq id no:2具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:4具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:6具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸。
54.在选定实施方案中，等温扩增方法可依赖于切口和延伸反应——“切口和延伸扩增”，以比传统扩增反应更快的时间框架扩增更短的序列。这些方法可包括例如在等温条件下仅使用两种扩增寡核苷酸、一种或两种切口酶以及聚合酶的反应。用于切口和延伸扩增的寡核苷酸组可包含含有与seq id no:7具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:8具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:9具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸。
55.在切口和延伸扩增中，具有有义和反义链的目标核酸序列与一对扩增寡核苷酸接触。第一扩增寡核苷酸包含含有以下的核酸序列：3’末端处与目标序列反义链的3’末端互补的识别区、所述识别区上游的切口酶位点和所述切口酶位点上游的稳定区。第二扩增寡核苷酸包含含有以下的核苷酸序列：3’末端处与目标序列有义链的3’末端互补的识别区、所述识别区上游的切口酶位点和所述切口酶位点上游的稳定区。提供了两种切口酶。一种切口酶能够在第一扩增寡核苷酸的切口酶位点处切口，但不能在所述目标序列内切口。另一种切口酶能够在第二扩增寡核苷酸的切口酶位点处切口，但不能在所述目标序列内切口。dna聚合酶在用于扩增的条件下使用，该扩增涉及扩增寡核苷酸的多个延伸循环，从而
产生双链切口酶位点，该酶位点被切口酶切口以产生扩增产物。例如参见美国专利号：9,689,031、9,617,586、9,562,264和9,562,263，和美国专利申请号：15/467,893、15/600,951和16/243/829，其每一个通过参考以其全部结合至本文中。
56.在一些实施方案中，id now covid-19测定使用切口酶扩增反应(near)，一种等温核酸扩增技术，以靶向sars-cov-2 rna中rdrp基因的高度保守区域。在一些实施方案中，测定系统包含：样品接收器，其含有洗脱/裂解缓冲液；测试基底，其含有两个密封反应管，每个反应管含有冻干颗粒；转移筒，其用于将洗脱样品转移至测试基底；和idnow仪器。id now covid-19测定在短至5分钟内产生阳性结果和在13分钟内产生阴性结果，在广泛范围的医疗环境中提供快速的covid-19结果。
57.在一些实施方案中，id now covid-19 poc测定提供125拷贝/ml或更少的检测下限(lod)。计算机分析发现所有模板和探针与来自45个国家和中国21个省市报告的957个sars-cov-2序列具有100％同源性，并且预测对导致常见呼吸道疾病的微生物(包括其他冠状病毒、流感、rsv和鼻病毒)没有显著的交叉反应性。
58.临床性能在30个含有已知浓度sars-cov-2 rna的人造样品和30个人造阴性样品进行测定。在所有阳性样品中检测到sars-cov-2 rna(阳性百分比一致性100％[ci,88.6-100％])，而在阴性样品中均未检测到(阴性百分比一致性100％[ci,88.6-100％])。
[0059]
在选定实施方案中，sars-cov-2核酸序列的扩增使用重组酶-聚合酶扩增(rpa)进行，rpa依赖于重组酶和相关蛋白的特性，以单链同源dna侵入双链dna，允许dna聚合酶反应的序列特异性引发。
[0060]
用于rpa的寡核苷酸组可包含含有与seq id no:17具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:19具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:18具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸；或者含有与seq id no:20或21具有至少70％相似性的核酸序列的第一扩增寡核苷酸、含有与seq id no:25或26具有至少70％相似性的核酸序列的第二扩增寡核苷酸和含有与seq id no:22-24中的任何一个具有至少70％相似性的核酸序列的探针寡核苷酸。
[0061]
在一些实施方案中，其中第一扩增寡核苷酸包含与seq id no:20具有至少70％相似性的核酸序列，第二扩增寡核苷酸包含与seq id no:25具有至少70％相似性的核酸序列，和探针寡核苷酸包含与seq id no:22或23具有至少70％相似性的核酸序列。在一些实施方案中，第一扩增寡核苷酸包含与seq id no:21具有至少70％相似性的核酸序列，第二扩增寡核苷酸包含与seq id no:25或26具有至少70％相似性的核酸序列，和探针寡核苷酸包含与seq id no:24具有至少70％相似性的核酸序列。
[0062]
在rpa中，重组酶剂与第一和第二扩增寡核苷酸接触以形成核蛋白。这些核蛋白与目标序列接触以在所述第一链的第一部分形成第一双链结构和在所述第二链的第二部分形成双链结构，因此，所述第一扩增寡核苷酸和第二扩增寡核苷酸的3’末端在包含目标序列的dna上朝向彼此。核蛋白中扩增寡核苷酸的3’末端通过dna聚合酶延伸，以产生第一和第二双链核酸，以及第一和第二移位核酸链。重复这些步骤直至达到期望的扩增水平。
[0063]
用于目标核酸序列的rpa的方法和材料为本领域已知的。参见美国专利号：7,270,981、8,460,875、7,399,590、7,666,598、8,030,000、8,426,134、8,945,845、9,663,820、10,329,603、10,329,602、8,017,339、8,574,846、8,962,255、10,036,057、8,071,308、10,093,
908和8,637,253，和美国专利申请号：15/099,754、16/442,007、14/705,150和16/155,133，其每一个通过参考以其全部结合至本文中。例如，合适的重组酶剂包括大肠杆菌reca蛋白、t4 uvsx蛋白或来自任何门的任何同源蛋白或蛋白复合体。其他非同源重组酶剂可用于代替reca，例如rect或reco。合适的重组酶负载蛋白可包括例如t4uvsy、大肠杆菌reco、大肠杆菌recr以及这些蛋白的衍生物和组合。合适的单链dna结合蛋白可为大肠杆菌ssb或t4 gp32或者这些蛋白的衍生物或组合。dna聚合酶可为真核或原核聚合酶。真核聚合酶的实例包括pol-α、pol-β、pol-δ、pol-ε及其衍生物和组合。原核聚合酶的实例包括大肠杆菌dna聚合酶i klenow片段、噬菌体t4 gp43 dna聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)聚合酶i大片段、phi-29 dna聚合物、t7 dna聚合酶、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)pol i、大肠杆菌dna聚合物i、大肠杆菌dna聚合酶ii、大肠杆菌dna聚合酶iii、大肠杆菌dna聚合酶iv、大肠杆菌dna聚合酶v及其衍生物和组合。rpa的其他组件包括atp、atp类似物或用于atp再生的系统(转化adp为atp)。这种系统可利用例如磷酸肌酸和肌酸激酶。atp或atp类似物可为atp、atp-γ-s、atp-β-s、ddatp或其组合中的任何一种。rpa反应也可包括从amp再生adp的系统和转化焦磷酸为磷酸的系统(焦磷酸)。rpa中使用的合适的群集剂包括聚乙二醇(peg)、葡聚糖和ficoll。
[0064]
在扩增样品中存在的一个或多个sars-cov-2病毒核酸序列后，所公开的方法可进一步包括使本文公开的一个或多个探针寡核苷酸序列与一个或多个扩增的目标sars-cov-2(2019-ncov)核酸序列杂交。
[0065]
在一个或多个探针寡核苷酸序列与一个或多个扩增的目标核酸序列杂交后，该方法包括通过评价来自每个可检测标记的信号，检测一个或多个探针寡核苷酸序列与一个或多个扩增的目标核酸序列的杂交，藉此(i)一个或多个信号的存在表明一个或多个探针寡核苷酸序列与一个或多个目标sars-cov-2核酸序列杂交和样品中sars-cov-2的存在；和(ii)信号的不存在表明样品中不存在sars-cov-2。来自一个或多个探针寡核苷酸序列的信号的检测可根据可检测标记的类型使用各种众所周知的方法进行。例如，检测可使用溶液实时荧光或使用固体表面方法进行。
[0066]
4.对鉴定为患有sars-cov-2的受试者的治疗和监测根据本文描述的方法鉴定为患有sars-cov-2的受试者可使用本领域已知的常规技术进行治疗、监测(例如在来自受试者的样品中确定的sars-cov-2核酸的存在)、治疗和监测和/或监测和治疗。在一些实施方案中，本文描述的方法进一步包括当使用本方法在从受试者获得的一个或多个样品中确定存在sars-cov-2核酸时对受试者进行治疗。
[0067]
治疗可采取各种形式，这取决于受试者为无症状还是经受轻度、中度或重度sars-cov-2感染症状。例如，经受轻度症状的受试者将经受发烧、咳嗽(有或无痰液产生)、厌食、不适、肌肉痛、喉咙痛、呼吸困难、鼻塞、头痛、腹泻、恶心、呕吐或其任何组合。经受中度症状的受试者将经受持续几天高于100.4℉的发烧、发冷、呼吸短促、昏睡或其任何组合。这种受试者还可能患有肺炎。经受重度感染的受试者将经受呼吸困难、胸部持续疼痛或压力、意识错乱、无法唤醒、嘴唇或面部发青或其任何组合。这种受试者还可能患有重症肺炎。
[0068]
如果受试者为无症状或具有轻度症状，则受试者可通过休息、睡眠、通过保暖、摄入流体(例如保持水分)、尽量减少与其他受试者的社交互动(例如保持隔开或隔离，比如在家)或其任何组合进行治疗。另外，可对受试者进行监测以查看症状是否出现和/或恶化。
[0069]
患有sars-cov-2感染的中度或重度症状的受试者可接受一种或多种药物(例如瑞德西韦)、疫苗、康复者血浆疗法(例如接受来自从感染sars-cov-2存活的受试者采集的血液的血浆)、呼吸支持或辅助(例如通过鼻插管、面罩或者无创或有创(例如插管)通气接受补充供氧)或其组合进行治疗。接受任何上述治疗的受试者还可进一步使用本领域已知的常规技术进行监测。
[0070]
5.疫苗接种在另一个实施方案中，本公开涉及本文描述的方法与对受试者进行至少一次针对sars-cov-2(2019-ncov)的疫苗接种和/或再接种(例如进一步疫苗接种)相关的用途。在一些实施方案中，本方法用于检测获自受试者的至少一个样品中sars-cov-2核酸的存在，以确定受试者是否应当或可以给予至少一次针对sars-cov-2的疫苗(例如第一次或初始疫苗，一次或多次进一步或另外的疫苗等)。在一些实施方案中，测试的受试者可为幼稚的，使得受试者对sars-cov-2没有任何免疫力或缺乏免疫学免疫力，并且先前没有针对sars-cov-3进行疫苗接种。在一些实施方案中，受试者可为幼稚的，尽管先前已经针对sars-cov-2进行疫苗接种。在一些实施方案中，受试者目前可能感染有sars-cov-2，表现出无症状或轻度症状，并且缺少任何先前的疫苗接种。在一些实施方案中，受试者目前可能感染有sars-cov-2，表现出无症状或轻度症状，并且先前已经针对sars-cov-2进行疫苗接种。在一些实施方案中，受试者可能已从先前sars-cov-2感染中恢复，并且先前没有针对sars-cov-2进行疫苗接种。在一些实施方案中，受试者可能已从先前sars-cov-2感染中恢复，并且先前已经针对sars-cov-2进行疫苗接种。
[0071]
无论先前感染sars-cov-2的时间和/或严重程度如何变化，均可实施以上方法。使用本文描述的方法，如果在样品中检测到sars-cov-2核酸的存在，则受试者可能需要等待一段时间(例如30天、60天、90天等)才能给予至少一次针对sars-cov-2的疫苗；无论待给予的疫苗是第一剂疫苗，第二(例如加强)剂疫苗，第三或任何进一步另外(例如加强)剂疫苗。或者，如果在样品中没有检测到sars-cov-2核酸的存在，那么可给予受试者至少一次疫苗。
[0072]
短语“至少一次进一步的疫苗或疫苗接种”或“至少一次另外的疫苗或疫苗接种”包括以下情况，其中在给予受试者第一次或当前疫苗后，在后来的一段时间里，进行至少一次另外或进一步的疫苗或疫苗接种(例如n 1(其中n为第一次或当前的疫苗加上一次另外或进一步的疫苗)、n 2(其中n为第一次或当前的疫苗加上2次另外的疫苗)、n 3、n 4、n 5、n 6、n 7、n 8、n 9、n 10至n n’(其中n’为1-1000、1-500、1-100的整数))。
[0073]
在另一个实施方案中，本文描述的方法用于检测在向受试者给予至少一次针对sars-cov-2的疫苗之后的时间框架内获自受试者的至少一个样品中sars-cov-2核酸的存在，以：确定受试者是否应当给予至少一次进一步的针对sars-cov-2的疫苗(例如接受一个或多个增强剂)；和/或在给予至少一次针对sars-cov-2的疫苗后对受试者进行监测。在一些实施方案中，该方法涉及在向受试者给予至少一次针对sars-cov-2的疫苗之后的时间框架内获得样品。向受试者给予至少一次sars-cov-2疫苗之后的时间框架可为至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天、至少32天、至少33天、至少34天、至少35天、至少36天、至
少37天、至少38天、至少39天、至少40天、至少41天、至少42天、至少43天、至少44天、至少45天、至少46天、至少47天、至少48天、至少49天、至少50天等。在一些实施方案中，样品在向受试者给予至少一次sars-cov-2疫苗之后约7-约21天内获得。另外，在仍然进一步的实施方案中，监测受试者涉及在受试者接受一次或多次疫苗之后(例如第一剂针对sars-cov-2的疫苗、第二剂针对sars-cov-2的疫苗等之后)监测疫苗后的症状或副作用(例如疲劳或不适、头痛、头晕或头昏、发烧或发冷、肌肉、骨骼、关节或神经症状、恶心、呕吐、腹泻或其他消化道症状、睡眠变化、淋巴结肿大、皮肤/指甲或面部变化、眼睛、耳朵、口腔或喉咙变化、咳嗽、胸部或呼吸症状和/或记忆或情绪变化中的一种或多种)。
[0074]
使用本文描述的方法，如果样品中未检测到sars-cov-2核酸，则可给予受试者至少一次进一步的疫苗(例如一个或多个增强剂)。或者，如果样品中检测到sars-cov-2核酸，则可以给予或可以不给予受试者至少一次进一步的疫苗。
[0075]
6.试剂盒本公开还提供一种用于扩增和检测样品中的sars-cov-2(2019-ncov)的试剂盒。试剂盒包含至少一种如本文描述的寡核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含本文描述的寡核苷酸组或群组。试剂盒可进一步包含用于扩增和检测核酸序列的试剂以及用于扩增和检测sars-cov-2的说明。本文关于上述方法阐述的寡核苷酸和寡核苷酸组的描述也适用于本文描述的试剂盒的那些相同方面。许多这种试剂在本文中得到描述或者在其他方面为本领域已知并且可市售获得。用于纳入试剂盒中的合适试剂的实例(除本文描述的寡核苷酸之外)包括用于核酸扩增反应的常规试剂，比如一种或多种具有聚合酶活性的酶、酶辅助因子(比如镁或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad))、盐、缓冲剂、脱氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸(dntp/rntp；例如脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸)、阻断剂、标记剂等。用于扩增反应的其他试剂包括切口酶、单链结合蛋白、解旋酶、解离酶等。
[0076]
试剂盒可包含关于以下的说明：使用本文描述的扩增试剂和寡核苷酸，例如用于处理测试样品、提取核酸分子和/或进行测试；和解释获得的结果。说明可打印或以电子方式提供(例如dvd、cd或可用于经互联网资源查看或获取)。
[0077]
试剂盒可以固体(例如冻干)或液体形式提供。本公开试剂盒的各种成分可任选地包含在用于每种单个成分(例如扩增寡核苷酸、探针寡核苷酸或缓冲剂)的不同容器(例如小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)内。每种成分通常适合作为在其各自容器中等分或以浓缩形式提供。也可提供适合于进行某些用于扩增/检测测定的步骤的其他容器。单个容器优选地保持封闭密闭以供商业销售。
[0078]
试剂盒可进一步包含用于获取生物样品的拭子。在一些实施方案中，试剂盒包含用于从生物样品中获取核酸和/或从生物样品中提取/分离核酸的试剂。
[0079]
7.实施例实施例1sars-cov-2(2019-ncov)核酸序列的扩增通过pcr，使用各种第一扩增寡核苷酸与包含seq id no:3的第二扩增寡核苷酸和包含seq id no:5的探针寡核苷酸进行。
[0080]
sars-cov-2样品为来自sars相关冠状病毒2，分离物usa-wa1/2020(bei resources)的基因组rna。基因组rna为从来自感染sars-cov-2，分离物usa-wa1/2020的非
洲绿猴(cercopithecus aethiops)肾上皮细胞(vero e6,crl-1586
tm
)的细胞裂解液和上清液制备物中提取的。病毒基因组rna位于细胞核酸和载体rna的背景中。
[0081]
pcr循环参数：pcr反应混合物包含sars-cov-2、含有seq id no:3和seq id no:1、10、12-14或16中的一个的covid-19引物组(引物组1)以及seq id no:5的探针寡核苷酸。内部对照核酸和内部对照的引物组也作为阳性对照包括在内(当说明时)。反应混合物还以本领域通常使用的浓度包含反应缓冲剂、dntp、参考染料、dna聚合酶(rtth)。
[0082]
表3显示每个引物组的结果。sars-cov-2目标和内部对照rna两者在循环条件下扩增。
[0083]
表3：具有不同正向引物的引物组1的pcr结果
*
ct＝循环阈值mr＝最大比率drn＝减去基线的报告值在选择第一covid-19引物组的情况下进行包括第二covid-19引物组(引物组2)的另外pcr反应。第二covid-19引物组包括seq id no：2和seq id no：4。反应还包括seq id no：6作为探针寡核苷酸。如表4所示，与任何引物组1相比较，引物组2提供更强的信号
(drn)，但引物组1添加到引物组2提供最强的总体信号。
[0084]
表4：具有引物组1的引物组2的pcr结果*ct＝循环阈值mr＝最大比率drn＝减去基线的报告值实施例2sars-cov-2(2019-ncov)核酸序列的扩增使用重组酶-聚合酶扩增(rpa)利用扩增寡核苷酸和探针寡核苷酸的各种组合进行。测试的组合如表5所示。组合1针对目标区域，而组合2-5针对第二目标区域。
[0085]
表5：用于rpa的扩增和探针寡核苷酸的组合组合编号：fprp探针阳性信号1seq id no:17seq id no:19seq id no:18y2seq id no:20seq id no:25seq id no:22y3seq id no:20seq id no:25seq id no:23y4seq id no:21seq id no:25seq id no:24y5seq id no:21seq id no:26seq id no:24y图1a和1b显示5种组合中每一种的drn值随着时间推移的图表。对所有组合在反应条件下扩增sars-cov-2目标，扩增的可检测水平在反应开始后10分钟内出现。对于组合1、4和5，在4-6分钟内检测到目标扩增(图1a-1b)。
[0086]
实施例3通过分析每个sars-cov-2引物和探针序列与截至2020年4月28日genbank中可获得的所有全长sars-cov-2序列的同源性，证明了包容性。共分析了来自26个国家/地区(澳大利亚、巴西、中国、哥伦比亚、捷克共和国、法国、希腊、印度、伊朗、以色列、意大利、马来西亚、尼泊尔、荷兰、巴基斯坦、秘鲁、南非、韩国、西班牙、斯里兰卡、瑞典、土耳其、美国和越南)的1383个全长sars-cov-2基因组序列。99.5％(1376/1383)与所有sars-cov-2引物和探针序列表现出100％同一性，和0.5％(7/1383)对一种引物或探针含有单个错配。
[0087]
通过分析每个sars-cov-2引物和探针序列与截至2020年5月5日在gisaid数据库中可获得的所有全长sars-cov-2序列的同源性，进一步证明了包容性。共分析了来自81个国家/地区的14,964个全长sars-cov-2基因组序列；1.1％(170/14,964)含有单个错配，
0.04％(6/14964)含有2个错配，和0.007％(1/14964)含有4个错配。
[0088]
实施例4用abbott alinity m系统，使用已知的sars cov-2阳性、阴性和非sars cov-2呼吸道样品，使用实时rt-pcr评估公开的引物组。如表6所示，已知阳性样品的稀释系列确定了100拷贝/ml的检测限。检测限(lod)定义为大于或等于95％的所有(真阳性)重复测试为阳性的sars-cov-2的最低可检测浓度。
[0089]
表6：sars-cov-2测定的lod拷贝/ml阳性数/测试数平均cn检测到％40010/1037.5210020010/1038.8710010019/2039.7895509/1040.2090252/1039.0520将109份先前测试的冷冻鼻咽拭子，在如以上对阳性(ppa)和阴性(npa)百分比一致性使用的实时pcr测定中进行重新测试(表7)。发现ppa为89.8％(53/59)和发现npa为98％(49/50)。
[0090]
表7：sars-cov-2测定的npa和ppaacn 27.84-31.43bcn 40.99还使用abbott m2000实时sars-cov-2测定评估临床相关性、交叉反应性和检测限(表8)。
[0091]
表8：m2000实时sars-cov-2性能研究
*angeli等人，jvc，validation and vcrification of the abbott realtime sars-cov-2 assay analytical and clinical performancc，2020年5月，通过参考结合至本文中。通过abbott m2000实时sars-cov-2和alinity m sars-cov-2实时rt-pcr测定分析共104个样本。两种测定之间的阳性百分比一致性(ppa)为100％(47/47)和阴性百分比一致性(npa)为96.5％(55/57)。结果概述于表9和10中。
[0092]
表9：alinity m sars-cov-2测定的评估a这些样品具有40.99的alinity m sars-cov-2 cn表10：alinity m sars-cov-2测定的npa和ppa2测定的npa和ppa实施例5在英国首次鉴定的sars-cov-2b.1.1.7毒株为最值得关注的评估对象，因为观察到传播性增加与刺突基因突变之间存在联系。尽管刺突基因突变主要定义了b.1.1.7谱系，但整个基因组中另外突变的存在可影响各种诊断测定的性能。
[0093]
gisaid中b.1.1.7谱系序列(n＝1787，如2020年12月21日访问的)的初步计算机检查显示，对本文描述的引物、探针和方法的性能没有值得关注的谱系定义突变。将病毒培养物(bei nr-54011，epi_isl_751801)在65℃下热灭活30分钟，并以稀释系列进行测试。在先前用其他毒株观察的预期范围内检测多个稀释度(表11)。这些结果证实了计算机预测，即
本引物、探针和方法可以可靠地检测b.1.1.7毒株，并与英国公共卫生部(public health england)进行的最近评估一致。
[0094]
用剩余患者鼻咽拭子样本进行进一步评估。所有样本的基因组序列均已完成并证实属于b.1.1.7谱系。由于剩余体积有限，测试之前将剩余vtm(病毒传输介质)稀释5-62.5x。检测到足够数量的所有样本(表11)。
[0095]
表11.sars-cov-2测定结果样品idlog ge/测试*tcid50/测试结果bei5.555.6检测到3/3bei4.490.56检测到3/3bei3.300.056检测到3/4bei2.450.0112检测到0/344.28na
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检测到63.82na
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检测到133.41na
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检测到
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na，不适用，对于患者样本未测定tcid
50*
根据r2值为0.99的标准曲线计算对数基因组当量(ge)/测试b.1.351谱系首次在南非鉴定，并自此已传播到超过十几个国家，初步报告表明该变体可能逃逸中和抗体。b.1.351谱系的独特突变谱主要由刺突基因突变k417n、e484k和n501y定义，然而，整个基因组中另外突变的存在可能会影响各种诊测定的性能。
[0096]
gisaid中b.1.351谱系序列(n＝195，如2020年12月27日访问的)的初步计算机检查没有显示，对本文描述的引物、探针和方法的性能有值得关注的任何谱系定义突变。将两种病毒培养物(bei nr-54008、nr-54009)热灭活，以稀释系列进行测试，并在先前用其他毒株观察的范围内进行检测(表12)。这些结果证实了计算机预测，即本引物、探针和方法可以可靠地检测b.1.351谱系。
[0097]
表12：sars-cov-2测定结果
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根据r2值为0.99的ge/ml标准曲线和r2值为0.97的tc1d50/ml相对于ge/ml的单位转换图计算基因组当量(ge)/测试应当理解，上述详细描述和随附实施例仅为说明性的，并且不应视为对本公开范围的限制，本公开范围仅由所附权利要求及其等效物定义。
[0098]
对所公开实施方案的各种变化和修改对本领域技术人员而言为显而易见的，并且可在不背离其精神和范围的情况下进行。