一种用于检测麻鸭隐性白羽基因的方法及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测麻鸭隐性白羽基因的方法及其应用。


背景技术：

2.我国肉鸭业产值居世界第一，在我国畜牧业中占有重要地位。由于各地区消费习惯差异及消费观念的转变，我国肉鸭产业呈现多元化发展趋势，优质麻鸭产业拥有巨大的发展空间。鸭的外观性状主要包括羽色、喙色和蹼色，这些性状不仅是鸭的品种特征，还可以作为品种的特征标签用于品种资源开发，如根据市场对鸭羽色、喙色和蹼色的偏好，培育出特定的鸭品系，提高鸭产品的市场竞争力。鸭的羽色及羽色整齐度在市场中能够直接影响消费者的购买意愿，因此是养殖企业十分关注的一项经济性状，同时羽色是鸭主要的外观性状之一，整齐一致、遗传稳定的羽色性状是畜禽品种评定过程中的重要判断依据，对畜禽良种的保护和利用有重要意义。
3.在实际生产中，麻鸭群体内常出现少数白化个体，且有部分正常麻鸭个体于尾部和翅膀等处出现正常麻羽外的白色羽毛，严重影响了麻鸭群体的整体外观整齐度，不仅会降低养殖企业的经济效益，而且不利于育种工作者对优良品种和配套系稳定遗传表型特征的建立与育种工作开展。因此，建立一种针对麻鸭隐性白羽的分子鉴定方法，对于解决养殖企业生产实际问题，并为麻鸭种质资源保护、开发与利用至关重要。
4.麻羽肉鸭在肉鸭产业中作为优质肉鸭的代表，由于遗传和育种工作起步较晚，其在羽色整齐度上存在不能满足现代化生产和市场要求的问题。在麻鸭群体中，存在羽毛白化的后代，且有少数麻鸭个体，于翅膀、尾部等身体局部出现白色羽毛。早期研究表明，鸭白羽的产生是由常染色体上的隐性基因控制的，传统的方法采用测交的方式，通过观察子代的羽毛颜色，淘汰后代中出现白羽的鸭群，从而达到剔除含有隐性白羽基因的杂合子个体的目的。然而这种方法非常耗费时间和精力，需要大量人力物力的投入且不能达到对杂合子个体百分之百剔除的效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于检测麻鸭隐性白羽基因的方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明所构建的分子检测技术具有耗时短价格低廉的优势。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.技术方案一：用于检测麻鸭隐性白羽和非白羽等位基因的引物组，所述引物组的核苷酸序列如seq id no.1-3所示。
8.技术方案二：用于检测麻鸭隐性白羽和非白羽等位基因的试剂盒，包括如权利要求1所述的引物组。
9.技术方案三：一种用于检测麻鸭隐性白羽和非白羽等位基因的方法，包括以下步骤：
10.(1)以待测鸭全基因组dna为模板，利用核苷酸序列如seq id no.1-3所示的引物组进行pcr扩增，得到扩增产物；
11.(2)对所得扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判定基因型。
12.进一步地，在步骤(1)中，利用核苷酸序列如seq id no.1-3的引物组进行pcr扩增的方法，包括：利用核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的引物扩增鸭mitf基因m等位基因，利用核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.3所示的引物扩增鸭mitf基因m等位基因。
13.进一步地，在步骤(1)中，所述pcr扩增的反应体系包括：引物各1μl、模板dna 1μl和ddh2o 4μl，还包括酶tsingke tse101金牌mix(green)7μl。
14.进一步地，在步骤(1)中，所述pcr扩增的热循环参数为：95℃预变性2min；95℃变性30s，58.8℃退火30s，72℃延伸30s，36个循环；72℃终延伸5min；12℃保存。
15.进一步地，在步骤(2)中，根据电泳结果判定基因型的方法，包括：扩增后仅有一条237bp大小的条带，为mm基因型，即隐性白羽纯合子；扩增后仅有一条354bp大小的条带，为mm基因型，即有色羽显性纯合子；扩增后分别出现354bp和237bp的两条条带，为mm基因型，即有色羽杂合子。
16.技术方案四：一种所述的引物组或所述的试剂盒在检测麻鸭羽色性状中的应用。
17.技术方案五：一种所述的引物组或所述的试剂盒在麻鸭育种中的应用。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明以鸭正常mitf基因序列和含插入突变的鸭mitf基因序列为参考，设计特异性引物，建立用于鉴定鸭隐性白羽基因的pcr分子检测技术。相比于传统的测交方法，pcr分子检测技术具有耗时短，价格低廉且能做到百分之百剔除杂合子个体的效果。利用分子检测技术可以快速淘汰实际生产中麻鸭群体内含有隐性白羽基因的杂合子个体，从而建立麻羽和白羽两个纯合子群体。由于隐性白羽麻鸭同样具有正常麻羽肉鸭肉质好，风味佳的特点，且白羽对其他羽色性状为隐性，所以在配套系构建和品种改良过程中，可达到最大程度保留原品种外观性状，同时改善肉品质的效果。因此本发明所构建的分子检测技术，除可提高麻鸭群体外观整齐度、满足生产和市场要求外，还可以尝试通过分离，建立隐性白羽麻鸭群，并将其作为其他品种的改良材料。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为试验群体1的pcr分子检测鉴定结果；其中marker为dl2000 plus dna marker，mm即白羽隐性纯合子，mm即有色羽显性纯合子，mm即有色羽杂合子，2号样本为基因型mm的个体，1-7为试验群体1的部分中山麻鸭样本；
22.图2为试验群体2的pcr分子检测鉴定结果；其中marker为dl2000 plus dna marker，mm即白羽隐性纯合子，mm即有色羽显性纯合子，mm即有色羽杂合子，1-7为试验群体2的部分中山麻鸭样本；
23.图3为试验群体1的pcr分子检测鉴定结果；其中marker为dl2000 plus dna marker，mm即白羽隐性纯合子，mm即有色羽显性纯合子，mm即有色羽杂合子，1-6为试验群体3的部分三水白鸭样本。
具体实施方式
24.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
25.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
26.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
27.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
28.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
29.tsingke tse101金牌mix(green)为市售商品，购自广州擎科生物科技有限公司，tsingke tse101金牌mix(green)含有的taq dna聚合酶、dntps、氯化镁和pcr反应缓冲液等配套产品也均为市售商品，可通过购买得到。
30.实施例1
31.1.试验动物
32.选用来自广东省肇庆四会市温氏仁马种鸭场的中山麻鸭，依据批次不同，分为试验群体1和2；选用来自华南农业大学动物科学学院家禽遗传育种团队的三水白鸭作为隐性白羽鸭的试验样本，即试验群体3。试验群体1-3各50只，共150只。
33.2.具体实施步骤
34.2.1基因组dna提取
35.采血所得样品置于-20℃冰箱中保存，使用前置于常温环境中进行解冻处理，利用血液基因的dna提取试剂盒(货号：d0715-02；omega bio-tek)对中山麻鸭和三水白鸭基因组dna进行提取，使用紫外可见光分光光度计对提取所得的基因组dna进行纯度鉴定，选取od值均在1.8～2.0之间，浓度均大于100ng/μl，合格的基因组dna置于-20℃中保存待用。
36.2.2引物设计及pcr扩增
37.从美国国家生物技术信息中心网站(national center for biotechnology information，ncbi)获取绿头野鸭mitf基因序列(nc_051784:5178923-5282692)以及在外
显子1m和外显子2之间含插入突变的鸭mitf基因序列(nc_040058:5005069-5109847)。使用primer5.0软件进行pcr引物设计，限定引物设计特点是共用同一条上游引物，总共2对3条引物，分别命名为mitf-f，mitf-r，mitf-ri，引物序列如下。序列送往广州擎科生物科技有限公司进行合成。
38.上游引物mitf-f(seq id no.1)：5
’‑
aacgtgcacggtcagttgta-3’；
39.下游引物mitf-r(seq id no.2)：5
’‑
gcgtctccggtcagatcaat-3’；
40.下游引物mitf-ri(seq id no.3)：5
’‑
ggacccccagttttggtgaa-3’。
41.利用2对3条引物对鸭基因组dna进行pcr扩增，pcr反应体系采用15μl反应体系，各组分使用量为：酶tsingke tse101金牌mix(green)：7μl；引物mitf-f：1μl；引物mitf-r：1μl；引物mitf-ri：1μl；模板dna：1μl；ddh2o：4μl。pcr热循环参数为：95℃预变性2min；95℃变性30s，58.8℃退火30s，72℃延伸30s，36个循环；72℃终延伸5min；12℃保存。
42.2.3凝胶电泳分析
43.采用1.0％的琼脂糖凝胶对鸭基因组dna的pcr扩增产物进行电泳分析，电泳条件为210v，25min，凝胶电泳结果通过tanon凝胶成像系统观察和拍照。
44.2.4结果分析
45.通过对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，对于mm基因型个体(即白羽隐性纯合子)，经pcr扩增后仅有一条237bp大小的条带；对于mm基因型个体(即有色羽显性纯合子)，经pcr扩增后仅有一条354bp大小的条带；而对于mm基因型个体(即有色羽杂合子)，经pcr扩增后可出现大小分别为354bp和237bp的两条条带。部分电泳结果见图1～3，试验群体检测结果统计见表1。
46.表1试验群体检测结果
[0047][0048]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。