一种合成苯丙醇衍生物的方法与流程

技术特征：
1.一种合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，包括：如下步骤：步骤一，提取酶基因，构建工程菌：提取羧酸还原酶、乙醇脱氢酶、烯键还原酶的基因，经过聚合酶链式反应扩增后，制备重组表达质粒，将重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的工程菌；步骤二，培养工程菌，筛选有效表达的菌种，并保存菌种：将重组大肠杆菌加入培养基中培养，得重组大肠杆菌的种子液；将重组大肠杆菌的种子液进行扩大培养、发酵，得到转化后溶液；检测其中目的酶类的含量，筛选酶类表达含量较高的菌种；将筛选到的菌种利用无菌水制成高浓度的菌悬液，取菌种保藏保护剂放入菌悬液中充分混匀，冻存，得到备用种子液；步骤三，利用重组大肠杆菌将3,4-二羟基肉桂酸转化为3,4-二羟基苯丙醇：将腺嘌呤核苷三磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黄素单核苷酸以质量比为1：(1-2)：(1-12)：(1-3)的比例溶解形成溶液，将溶液添加到步骤二得到的备用种子液中进行生物转化，最终得到粗产物；调节粗产物的ph值为5-8，并经过搅拌、抽滤、洗涤、干燥后得到纯化的r1包括：-ch3、-oh、-h或-och3；r2包括：-ch3、-oh、-h或-och3；r3包括：-ch3、-oh、-h或-och3。2.根据权利要求1所述的一种合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述提取羧酸还原酶的基因的来源包括：mycobacterium marinum的hxw97-rs16665，序列为seq01，或mycobacterium paraintracellulare的ocq-rs16610，序列为seq02；所述提取乙醇脱氢酶的基因的来源包括：saccharomyces cerevisiae的adh1，序列为seq03，或fusarium subglutinans的fsubg-7421，序列为seq04；所述提取烯键还原酶的基因的来源包括：tarenaya hassleriana的loc104820880，序列为seq05，或camelina sativa的loc1047699854，序列为seq06。3.根据权利要求1所述的一种合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述步骤一种聚合酶链式反应扩增的pcr反应体系包括：10
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pcr buffer 20ul，dntp 16ul，正向引物6ul，反向引物6ul，taq dna聚合酶10ul，dd h2o 140ul，模板dna 0.1-2ug；扩增程序及条件：为94℃预变性3min；随后35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。4.根据权利要求3所述的一种合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述正向引物包括：hxw97-rs16665的正向引物的序列为seq07，ocq-rs16610的正向引物的序列为seq08，adh1的正向引物的序列为seq09，fsubg-7421的正向引物的序列为seq10，loc104820880的正向引物的序列为seq11，loc1047699854的正向引物的序列为seq12；反向引物包括：
hxw97-rs16665的反向引物的序列为seq13，ocq-rs16610的反向引物的序列为seq14，adh1的反向引物的序列为seq15，fsubg-7421的反向引物的序列为seq16，loc104820880的反向引物的序列为seq17，loc1047699854的反向引物的序列为seq18。5.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述步骤一中制备重组表达质粒的具体方法是：采用限制性内切酶nde i/xho i双酶切体系针对基因及质粒载体pet-28a( )的酶切位点进行酶切处理，并使用t4连接酶在18℃条件下连接过夜，获得重组表达质粒。6.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述步骤一中获得重组表达的工程菌的具体方法是：取由cacl2处理过的感受态大肠杆菌菌悬液，加入重组质粒溶液，再加入培养基，使细菌恢复正常生长状态；将培养后的菌液涂布于筛选平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，继续培养；从筛选平板上挑取新活化的单个菌落，接种于培养基中培养，直至对数生长后期；将该菌悬液接种于培养基中培养至od600＝0.5。7.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述步骤二中检测目的酶类的含量的方法是：羧酸还原酶的检测方法为利用紫外分光光度计检测转化后溶液在340nm下的吸光度；乙醇脱氢酶的检测方法为利用紫外分光光度计检测转化后溶液在340nm下的吸光度；烯键还原酶的检测方法为利用紫外分光光度计检测转化后溶液在340nm下的吸光度。8.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述包括：3,4-二羟基肉桂酸、2-羟基-4-甲氧基肉桂酸或2-羟基-3,4-二甲氧基肉桂酸。9.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述包括：3,4-二羟基苯丙醇、2-羟基-4-甲氧基苯丙醇、2-羟基-3,4-二甲氧基苯丙醇。

技术总结
本发明公开了一种合成苯丙醇衍生物的方法，涉及生物化学领域，方法包括：如下步骤：步骤一，提取羧酸还原酶、乙醇脱氢酶、烯键还原酶的基因，构建工程菌；步骤二，培养工程菌，筛选有效表达的菌种，并保存菌种：步骤三，将腺嘌呤核苷三磷酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黄素单核苷酸溶解形成溶液，再进行生物转化，最终得到粗产物；经过调节pH值、搅拌、抽滤、洗涤、干燥后得到纯化的本方法合成得到的苯丙醇衍生物纯度高，且操作简单、能耗低。能耗低。能耗低。


技术研发人员：占纪勋 陶福平 张炜
受保护的技术使用者：杭州唯铂莱生物科技有限公司
技术研发日：2021.08.05
技术公布日：2023/2/17