人源T细胞淋巴母细胞淋巴瘤PDX模型细胞及其应用

人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤pdx模型细胞及其应用
技术领域
1.本发明属于细胞模型技术领域，具体涉及一种人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤(t-lbl)pdx模型细胞的构建和应用。


背景技术：

2.t细胞淋巴母细胞淋巴瘤(t cell lymphoblastic lymphoma，t-lbl)是一种非霍奇金淋巴瘤(nhl)，发病率占成人nhl的2％～4％，占儿童nhl的40％左右，男性多于女性。t-lbl具有高度的侵袭性，自然病程短，预后差。t-lbl常表现出纵膈中生长迅速的肿块，伴胸水及心包积液，甚至出现上腔静脉阻塞综合征。外周淋巴结、骨髓、中枢神经系统受累均比较常见，其他少见累及部位有肝、脾、膈下淋巴结、骨、皮肤及肠道等。在who淋巴造血系统恶性肿瘤的分类中，lbl与急性淋巴细胞白血病(all)被认为是具有不同临床表现和属于不同疾病发展阶段的同一种疾病，故将其归入同一类疾病，并将骨髓中幼稚淋巴细胞比率小于25％的归为lbl，大于25％的定义为all。目前t-lbl仍缺乏标准的治疗方案，多数研究推荐使用all类似的化疗方案。但是，与all相比，t-lbl诱导化疗失败、早期复发率和中枢神经系统复发率均较高。而自体或者异基因造血干细胞移植(hsct)治疗t-lbl尚存在争议。因此，建立有效的体内、外t-lbl模型，深入研究其发病机制并开发新型治疗药物有其必要性和重要临床意义。然而，目前尚无t-lbl细胞株供研究使用，大大限制了对t-lbl研究的开展。
3.pdx(patient-derived xenograft)模型是将患者的原位肿瘤接种到免疫缺陷小鼠体内的一种临床前研究模型。与传统的皮下接种肿瘤细胞株成瘤的小鼠模型相比，pdx模型能更好地反映原发病人的病理特性以及基因表达，更准确地预测临床疗效，因此已成为近年来研究疾病发病机制及新的抗肿瘤药物筛选中不可或缺的工具。大量研究表明以pdx模型开展临床ii期试验，能够极大的提高新药的临床通过率，缩短研发周期，减少研发费用。因此，2016年美国fda停止肿瘤细胞系作为抗肿瘤药物的药效评价，将pdx模型列为药物反应检测的必备环节，使得pdx模型在肿瘤及药物研究中的作用日益凸显。目前，小鼠pdx模型技术主要集中在肠癌、胰腺癌、乳腺癌等实体瘤，商品化的pdx小鼠模型大大推进了实体瘤研究靶向新药物的研发进程。然而，由于t-lbl的异质性高，标本获取难，细胞数少、植入率低等原因，尚无稳定的pdx模型供研究使用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，提供一种能稳定传代，细胞表型改变与病人一致，并且侵犯全身组织脏器包括外周血、骨髓、肝脏和脾脏的人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤(t-lbl)pdx模型细胞，对于研究t-lbl的发病机制以及筛选新的靶点和治疗药物提供了重要的临床前研究模型。
5.本发明的第二个目的在于，提供人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤(t-lbl)pdx模型细胞的应用。
6.为了实现上述目的，本发明提供了人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤pdx模型细胞，所
述细胞保藏编号为cctcc no:c2022175。
7.为了实现上述第二个目的，本发明提供了人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤pdx模型细胞在体外筛药中的应用，将所述pdx模型细胞体外培养，筛选化合物库，获得对t细胞淋巴母细胞淋巴瘤敏感的化合物。
8.作为一个优选实施例，本发明提供了人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤pdx模型细胞在制备治疗t细胞淋巴母细胞淋巴瘤药物中的应用。
9.作为一个优选实施例，本发明提供了人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤pdx模型细胞在建立人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤pdx动物模型中的应用。
10.本发明t-lbl的pdx小鼠模型的建立包括如下步骤：
11.(1)提取t-lbl患者肿瘤穿刺样品0.5ml，采用生理盐水洗涤，然后以0.5-2ml pbs重悬；
12.(2)取步骤(1)细胞用pbs制成单细胞悬液；
13.(3)细胞悬液注射于小鼠腋下，接种量为1
×
106/只，接种方式为皮下注射；
14.(4)注射后4-12周每隔一周取小鼠尾静脉血300-500ul，裂解红细胞后用pbs重悬制成有核细胞悬液，标记humancd45(hcd45)、hcd3、hcd4共3个抗体组合，流式检测人细胞比率，以动态监测细胞植入情况；
15.(5)16-24周之间，p1代小鼠出现突然活动度明显下降或死亡。死亡小鼠立即取骨髓、肝脏和和脾脏组织，制成单细胞悬液，标记hcd45、hcd3、hcd4共3个抗体组合，流式检测以明确小鼠是否发生人源t-lbl的组织浸润。如果骨髓或脾脏组织中人源细胞阳性率超过3％，则认为构建成功，命名为人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤(t-lbl)pdx模型细胞(tlbl-h-pdx)；
16.(6)明确已发病的p1小鼠的骨髓或者脾脏制成单细胞悬液，注射于用x-ray放射线辐照的nsg小鼠体内，接种量为1
×
106/只，接种方式为经鼠尾静脉注射。此为p2代小鼠；
17.(7)p2小鼠出现突然活动度明显下降后，将骨髓或者脾脏制成单细胞悬液，重复上述步骤(5)，明确小鼠是否发生人源t-lbl。
18.本发明所要保护的细胞命名为：人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤(t-lbl)pdx模型细胞，保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心邮编430072)，保藏日期是2022年6月10日，保藏编号：cctcc no:c2022175。
19.本发明的优点在于，本发明利用t-lbl的纵隔肿瘤组织，建立了能稳定传代，细胞表型改变与病人一致，并且侵犯全身组织脏器包括外周血、骨髓、肝脏和脾脏的pdx模型。利用第一代pdx(p1)小鼠肿瘤细胞，能够在移植鼠中稳定重建该疾病模型(p2)，并利用该细胞模型，本课题组筛选出小分子化合物库中t-lbl敏感的前十名化合物。总之，本细胞模型填补了t淋巴母细胞瘤pdx的空白，为t-lbl发病机制和筛选靶向药物提供了理想平台，可以满足实验室和制药公司的需求，具有很好的推广应用价值。
附图说明
20.图1tlbl-h-pdx模型细胞来源小鼠(p1)的发病照片及浸润细胞的流式验证。a.tlbl患者肿瘤组织经制成单细胞悬液，尾静脉注射nsg小鼠，16周后小鼠活动度降低实验
结束采集组织，观察到明显增大的肿瘤细胞浸润的肝脏。b.t-lbl的pdx发病小鼠的浸润脏器骨髓(bone marrow,bm)、肝脏(liver)、外周血(peripheral blood，pb)和脾脏(spleen)，制成细胞悬液，流式细胞术观察hcd45、hcd3和hcd4细胞比例，表明造模成功。
21.图2二代pdx小鼠(p2)发病的验证。a.发病的二代pdx小鼠(p2)脾脏增大。b.发病的二代pdx小鼠(p2)骨髓(bm)中人源细胞浸润的流式细胞学检测(hcd45阳性)，表明二代造模成功。
22.图3利用tlbl-h-pdx模型细胞体外化合物筛选。取该pdx模型细胞进行体外培养，用小分子化合物库中进行处理，检测细胞活率，筛选出能有效杀伤该细胞的化合物前10名化合物。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
24.实施例
25.一、t-lbl患者样本处理：
26.1.采集t-lbl患者穿刺肿瘤组织样本，用生理盐水洗涤两遍，以0.5ml体积生理盐水重悬，细胞计数。
27.2.经尾静脉注射于小鼠体内，接种细胞数为1
×
106/只。
28.二、nsg小鼠饲养及接种：
29.1.小鼠饲养条件：8周龄雌性nsg小鼠，spf级条件下饲养。室温18-25℃,相对湿度40％-60％，饲料及饮水经高压灭菌。每周至少更换2次垫料。
30.2.nsg小鼠接种前辐照：取5只小鼠进行称重，记录，用半致死剂量(1.25gy)x光辐照。
31.3.nsg小鼠接种：辐照后6
ꢀ‑
12h尾静脉注射上述细胞，数量为1
×
106/只。注射细胞前细胞先用0.2μm滤膜过滤，重悬于pbs中，注射体积为200μl。
32.三、造模成功评判指标：
33.1.一般指标：接种后，观察小鼠有无活动减少、消瘦、弓背、腹泻、脱毛、偏瘫等表现。每周给小鼠称重并记录。
34.2.尾静脉采血：注射后每周取小鼠尾静脉血300-500ul，用红细胞裂解液裂解20分钟，pbs洗一遍，加入500μl pbs重悬制成有核细胞悬液。标记hcd45抗体，流式检测人细胞比率，以判断是否移植接种成功。
35.3.发病小鼠各组织器官检查：小鼠于活动度明显下降立即处死或死亡后立即解剖，采集小鼠的外周血、骨髓、脾脏、肝脏，拍照记录脏器尺寸(图1a)。脾脏和骨髓细胞悬液标记hcd45，hcd3、hcd4共3个抗体组合，用流式细胞术分析免疫表型，明确植入细胞比例(图1b)。植入成功的判定为p1代小鼠，细胞命名为人源t细胞淋巴母细胞淋巴瘤(t-lbl)pdx模型细胞(tlbl-h-pdx模型细胞)，并保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2022年6月10日，保藏编号：cctcc no:c2022175。
36.四、t-lbl细胞传代造模：
37.1.p1代t-lbl细胞的保种冻存：将p1代nsg小鼠的骨髓和脾脏制成单细胞悬液，用胎牛血清 10％ dmso长期冻存保存于液氮中。
38.2.t-lbl细胞连续接种传代：传代前将p1代nsg小鼠的骨髓和脾脏迅速于42℃水浴中解冻，pbs洗涤，经鼠尾静脉注射于用x-ray放射线辐照过的nsg小鼠体内，细胞数为1
×
106/只。
39.3.p2代发病的评判：观察指标同p1代，包括接种后动态尾静脉取血和发病后的各脏器的病理和流式指标(图2a,b)。
40.4.p2代pdx的传代：将p2代小鼠脾脏和骨髓细胞液氮冻存，接种步骤同2，同批次小鼠脾脏和肝脏浸润情况高度一致，可用于功能学实验。
41.五、t细胞淋巴母细胞淋巴瘤pdx模型体外化合物筛选的技术应用。
42.取造模成功的t-lbl-pdx模型的肿瘤组织，制成单细胞悬液。以3
×
105密度接种至96孔板中，分别加入化合物库中的小分子，48小时后检测细胞活率。细胞活率低于50％的被判定为有效化合物。根据细胞活率进行排序，筛选出有效浓度最低的小分子化合物作为对t-lbl有效的候选化合物(参见图3)。
43.综上，本发明提供了t-lbl的pdx模型及其建立方法，可用于t-lbl发病机制研究和大规模药物筛选实验，具有良好的应用前景。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。