囊胚形成促进剂的制作方法

1.本发明涉及由受精卵向囊胚的形成促进剂。


背景技术：

2.在包含人的哺乳类的卵子在输卵管内受精后着床于子宫为止期间，受精卵细胞分裂成2个、4个、8个，转移到输卵管内的同时分化成桑椹胚、胚泡、以及囊胚。在体外受精中，将精子在培养基中添加在卵子中，在体外培养直到胚泡或囊胚回到子宫内。
3.在此，在体外受精中，要提高妊娠率虽然必须提供健康的卵子和精子，而从受精到着床的阶段向囊胚的形成率也是极其重要的。提高该囊胚的形成率在提高正常的妊娠率方面也是重要的。
4.特别是在小鼠的体外受精中，已知细胞分裂在分裂到2个细胞后不进行的现象、两个细胞块(2cell block)，受精率即使提高，如果向囊胚的形成率低，则妊娠率也不会提高(非日本专利文献1)。
5.另一方面，已知不含蒜氨酸、蒜素的无味大蒜增强精子数、精子活动力(日本专利文献1)，大蒜或大蒜提取物减低雄性生殖道的炎症、使精巢睾丸酮浓度增加(日本专利文献2)，s-烯丙基半胱氨酸抑制精子数、精子活动力的降低(日本专利文献3)。
6.现有技术文献
7.日本专利文献
8.日本专利文献1：日本特开平11-346712号公报
9.日本专利文献2：日本特表2008-544994号公报
10.日本专利文献3：日本特开2012-17295号公报
11.非日本专利文献
12.非日本专利文献1：int.j.dev.biol.53:129-134(2009)


技术实现要素：

13.课题发明要解决的课题
14.本发明的课题在于，提供从受精卵向囊胚的形成促进剂及应用它的体外受精用胚泡或囊胚的制造法。
15.用于解决课题的手段
16.于是，本发明者们为了发现对受精卵形成囊胚起作用的成分，进行了各种研究，结果发现，酵母发酵大蒜或其提取物具有促进受精卵形成囊胚的作用，具有提高受精卵的着床率、乃至提高妊娠率的效果。另外发现，酵母发酵大蒜或其提取物作为体外受精后由受精卵形成囊胚为止的培养基成分也是有用的。
17.即，本发明提供下面的发明[1]～[14]。
[0018]
[1]一种囊胚形成促进剂，其含有酵母发酵大蒜或其提取物。
[0019]
[2]根据[1]所述的囊胚形成促进剂，其是从受精卵向囊胚的形成促进剂。
cerevisiae)。
[0038]
酵母发酵大蒜例如能够通过将大蒜在80℃以上加热处理后，利用酵母发酵而获得。首先，作为加热处理，只要是80℃以上，就能够抑制杂菌的繁殖，优选85℃以上，更优选80℃～120℃。另外加热处理时间优选5分钟～1小时，5分钟～30分钟就足够。酵母发酵优选添加酵母在30～40℃下进行2天～5天进行。此外，对于发酵优选添加葡萄糖等糖类进行。发酵的进行能够通过大蒜特有的臭味的变化和ph的降低(降低到ph6以下)来确认。
[0039]
获得的酵母发酵大蒜也能够直接使用，也能够进行粉碎处理以粉末形式使用，也能够以提取物形式使用。作为酵母发酵大蒜提取物，可以举出从酵母发酵大蒜中经水、热水、乙醇等有机溶剂提取而得的提取物，更优选水或热水提取物。提取手段没有特别限定，采集在酵母发酵大蒜或其粉碎物中添加水等溶剂在溶剂中溶解的成分即可。
[0040]
当溶剂提取时，可以进行加热等，也可以采用索氏提取等方法。
[0041]
如后述实施例所示，酵母发酵大蒜或其提取物对于从受精起到分裂成两个细胞胚几乎没有作用，具有有意义地促进从两个细胞胚起形成胚泡或囊胚的作用。从大蒜或大蒜所含的成分的作用考虑，这样的作用是完全不能预测的。
[0042]
因此，酵母发酵大蒜或其提取物作为囊胚形成促进剂、特别是从受精卵到囊胚的形成促进剂是有用的。另外，酵母发酵大蒜或其提取物作为体外受精用培养基的成分也是有用的，如果在含有酵母发酵大蒜或其提取物的培养基中培养受精卵，则会促进体外受精用胚泡或者囊胚的形成。
[0043]
如果在受精时和/或受精后应用本发明的囊胚形成促进剂，会提高受精后的着床率、乃至妊娠率。作为囊胚形成促进剂的应用手段，可以举出对包含人的哺乳动物以药品、食品组合物、外用组合物形式摄取、涂敷或施与的手段、和对体外受精中的受精卵应用的手段。因此，本发明的囊胚形成促进剂包含在受精卵培养基中的添加剂、药品、食品组合物、外用组合物的形式。
[0044]
优选在这些囊胚形成促进剂中以干燥固体分量计含有0.001～50质量％的酵母发酵大蒜或其提取物，更优选含有0.001～20质量％。
[0045]
当以药品、食品组合物、外用组合物的形式使用本发明的囊胚形成促进剂时，能够含有在通常的食品、药品、外用剂等制剂化中使用的任意成分。作为这样的任意成分，如果是口服给药组合物，则例如能够优选例示乳糖和/或白糖等赋形剂、淀粉、纤维素、阿拉伯胶、羟基丙基纤维素等粘合剂、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙等崩解剂、大豆卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯等表面活性剂、麦芽糖醇和/或山梨糖醇等甜味剂、柠檬酸等酸味剂、磷酸盐等缓冲剂、虫胶和/或玉米醇溶蛋白等成膜剂、滑石、蜡类等润滑剂、轻质硅酸酐、干燥氢氧化铝凝胶等助流剂、生理食盐水、葡萄糖水溶液等稀释剂、矫味剂、着色剂、杀菌剂、防腐剂、香料等。
[0046]
如果是外用组合物，则能够含有角鲨烯、凡士林、微晶蜡等烃类、西蒙得木油、巴西棕榈蜡、油酸辛基十二烷基酯等酯类、橄榄油、牛油、椰子油等甘油三酯类、硬脂酸、油酸、视黄酸等脂肪酸、油醇、硬脂醇、辛基十二烷基醇等高级醇、磺基琥珀酸酯和/或聚氧乙烯烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂类、烷基甜菜碱盐等两性表面活性剂类、单烷基铵盐、二烷基铵盐等阳离子表面活性剂类、山梨糖醇酐脂肪酸酯、脂肪酸单甘油酯、这些聚氧乙烯加成物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯等非离子表面活性剂类、聚乙二醇、甘油、1,3-丁二醇
等多元醇类、增稠和凝胶化剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、上色剂、防腐剂等。
[0047]
制造能够根据常用方法通过适用于各种制剂化的手段进行。另外，作为本发明的囊胚形成促进剂的形式，优选片剂、软胶囊、硬胶囊、颗粒、饮剂、阴道外用剂、果冻状外用剂等。
[0048]
如果将本发明的囊胚形成促进剂用作体外受精用培养基的添加剂，则会获得提高了从受精卵到囊胚的形成率的体外受精用培养基。酵母发酵大蒜或其提取物在体外受精用培养基中的添加量，以干燥固体分量计优选0.001～50质量％，更优选0.001～20质量％。
[0049]
在含有酵母发酵大蒜或其提取物的精子预培养培养基中培养精子，其后在不含提取液的培养基中培养后，使卵子与精子受精，接着在该培养基中培养受精卵，则会高效地获得体外受精用胚泡或囊胚。
[0050]
在此，作为体外受精用培养基，可以举出通常的体外受精中使用的培养基。例如，在精子的预培养中可以举出card fertiup
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精子预培养培养基(九动、佐贺、日本)。在卵子块的预培养中可以举出card medium
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高性能体外受精用培养基(九动、佐贺、日本)。在受精卵的培养中使用card mhtf体外受精用培养基(九动、佐贺、日本)。在两个细胞胚的培养中可以举出ksom-aa(merck、nj、usa)。
[0051]
受精手段例如通过精子的预培养和其后的体外受精进行。作为精子的预培养培养基，可以举出fertiup
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精子预培养培养基(九动、佐贺、日本)等。精子是在含有酵母发酵大蒜或其提取物的培养基中，在37℃、5％co2、95％空气条件下预培养30分钟。其后，在fertiup
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精子预培养培养基中，在37℃、5％co2、95％空气条件下进行培养60分钟。卵子的预培养培养基可以举出card medium
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(九动、佐贺、日本)等。经预培养的精子和卵块在card mhtf体外受精用培养基等体外受精用培养基中，在37℃、5％co2、95％空气条件下进行体外受精。
[0052]
培养手段例如为将经预培养的精子和卵块体外受精，在37℃、5％co2、95％空气条件下，3小时后，用card mhtf体外受精用培养基(九动、佐贺、日本)洗涤3次受精卵，在37℃、5％co2、95％空气条件下培养一夜。第二天，将2细胞期胚转移到ksom-aa(merck、nj、usa)培养基，在37℃、5％co2、95％空气条件下进行3天培养。
[0053]
这样获得的受精卵(4～8细胞期、胚泡或囊胚)回到子宫。通常的胚移植在4～8细胞期移植到子宫。另外，发育到囊胚后移植的囊胚移植着床率高。但是，存在培养的全部胚不能形成囊胚的问题。通过使用本发明的囊胚形成促进剂的体外受精，会促进从受精卵到4～8细胞和/或囊胚的形成，因此，会形成对移植良好的受精卵，并提高着床率、乃至妊娠率。
[0054]
实施例
[0055]
接着，举出实施例进一步详细地说明本发明。
[0056]
制造例1(酵母发酵大蒜末)
[0057]
用搅拌机将100g生大蒜的剥皮肉制糊，接着在75～85℃加热30分钟。接着，用接种环将酵母(saccharomyces cerevisiae)接种添加葡萄糖，使其在35℃下发酵约3天。在85℃加热30分钟停止发酵后，用冷冻干燥机冷冻干燥48小时，获得酵母发酵大蒜末(产量30g)。
[0058]
试验例
[0059]
(试验方法)
[0060]
试验动物
[0061]
本实验中，从2只雄c57bl/6j和balb/c小鼠(均为12周龄)中取精子。另外，从6只雌c57bl/6j小鼠(4周龄)中取卵子。
[0062]
试剂和培养基
[0063]
在精子的预培养中使用card fertiup
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精子预培养培养基(九动、佐贺、日本)。在卵块的预培养中使用card medium
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高性能体外受精用培养基(九动、佐贺、日本)。在受精卵的培养中使用card mhtf体外受精用培养基(九动、佐贺、日本)。在两个细胞胚的培养中使用ksom-aa(merck、nj、usa)。
[0064]
精子的采集
[0065]
通过颈椎脱臼使试验动物安乐死后，摘取出两侧的附睾尾部，去除附着的血液和脂肪。用小镊子将附睾尾部固定，用noes剪刀切下尾部中央的附睾。用解剖针从附睾尾部切下部中舀取精子块，在fertiup
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精子预培养培养基(九动、佐贺、日本)中预培养(37℃、5％co2、95％air)30分钟后，在包含酵母发酵大蒜提取液(1％)的fertiup
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精子预培养培养基(九动、佐贺、日本)中预培养(37℃、5％co2、95％air)60分钟。对照为同样地在预培养(37℃、5％co2、95％air)30分钟后，在不包含提取液的fertiup
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精子预培养培养基(九动、佐贺、日本)中预培养(37℃、5％co2、95％air)60分钟。
[0066]
卵块的采集
[0067]
对雌c57bl/6j小鼠(4周龄)腹腔内注射0.1ml的card hyperova
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过量排卵诱导剂(九动、佐贺、日本)，在其48小时后腹腔内注射37.5iu/ml的人绒毛促性腺激素hcg(促性腺激素，aska制药公司，东京，日本)诱导过量排卵。在施与hcg16小时后通过颈椎脱臼使过量排卵的雌小鼠安乐死摘除输卵管，在细胞培养用液体石蜡(nacalai tesque，京都，日本)内裂开输卵管肿大部，采集卵块，用card medium
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(九动、佐贺、日本)预培养。
[0068]
体外受精和初期胚培养
[0069]
将经预培养的精子和卵块体外受精(37℃、5％co2、95％air)。3小时后，在card mhtf体外受精用培养基(九动、佐贺、日本)中洗涤3次受精卵，培养(37℃、5％co2、95％air)一夜。第二天，将2细胞期胚转移到ksom-aa(merck、nj、usa)培养(37℃、5％co2、95％air)3天。
[0070]
受精率和囊胚率
[0071]
在实施了体外受精的第二天，分别将2细胞期胚和未受精卵、死亡卵计数，计算出受精率(％、2细胞期胚数/全部的细胞数)。另外，将2细胞期胚转移到ksom-aa(merck、nj、usa)培养3天，分别将囊胚和2细胞期胚、死亡胚计数，计算出囊胚率(囊胚数/全部的胚数)和2细胞期胚率(2细胞期胚数/全部的胚数)、死亡胚率(死亡胚数/全部的胚数)。
[0072]
统计解析
[0073]
全部的数据用平均
±
标准误差(sem)标记。统计解析用student t检验实施，判定p＜0.05为统计学上有意义。
[0074]
(结果)
[0075]
将到两个细胞胚为止的收率和到囊胚形成为止的收率示于图1。
[0076]
由图1，添加酵母发酵大蒜的提取物培养的受精卵到两个细胞胚为止的比例，与对照相比是同等的。另一方面，添加酵母发酵大蒜的提取物培养的受精卵到囊胚为止的形成率，与对照相比为有意义地增加。
[0077]
因此可知，酵母发酵大蒜或其提取物具有促进由受精卵形成囊胚的作用。