一种混菌原位发酵制备食品胶基细菌纤维素联产食品胶的方法

1.本发明涉及细菌纤维素和食品胶生物发酵领域，具体涉及一种混菌原位发酵制备食品胶基细菌纤维素联产食品胶的方法。


背景技术：

2.细菌纤维素(bacterial cellulose，简称bc)是一种由细菌合成的高分子胞外聚合物，因其高纯度、高结晶度、高保水性、良好的机械性能、可控的形状和质地以及三维纳米纤维结构而被广泛应用于食品、生物医药及化工等领域，具有广阔的应用价值。细菌纤维素的原位改性是一种重要的细菌纤维素改性方法，其工艺一般指在细菌纤维素生产过程开始前，将添加剂加入到发酵培养基中，添加剂在细菌纤维素生长过程中被载入细菌纤维素纤维纳米网络中，从而得到具有添加剂性能的细菌纤维素复合材料。
3.近年来，食品胶作为添加剂加入发酵培养基中对细菌纤维素进行原位改性的方法受到一定关注，如专利cn112695009a公开了一种原位发酵制备细菌纤维素的方法，将生产细菌纤维素的菌株接种到含结冷胶的发酵培养基中进行发酵，能促进细菌纤维素的合成；另外专利cn111321184a公开了一种将大肠杆菌fy-07种子液接入含黄原胶的发酵培养基中发酵，提高细菌纤维素产量或性能的方法，上述这些均是通过添加外源食品胶(结冷胶、黄原胶)来提高细菌纤维素的产量，不仅成本高，且外源食品胶作为培养基组分在灭菌过程中其性能也会受到一定影响，难以回收利用，虽然提高了细菌纤维素的产量但也造成食品胶浪费。


技术实现要素：

4.本发明的目的为提供一种混菌原位发酵制备食品胶基细菌纤维素联产食品胶的方法，用于降低细菌纤维素的原位发酵成本的同时联产食品胶，提高细菌纤维素的产量和糖利用率。
5.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
6.本发明将生产细菌纤维素的菌株接入到发酵培养基一段时间后，再将生产食品胶的菌株以一定比例接入培养基中进行混菌动态共同发酵，最后转为静态发酵或继续动态发酵，最终实现在同一发酵体系中同时获得两种产物，提高发酵糖利用率，提高发酵效率和经济效益。
7.本发明提供一种混菌原位发酵制备食品胶基细菌纤维素联产食品胶的方法，包括以下步骤：
8.s1.在发酵培养基中接入生产细菌纤维素的菌株进行动态发酵；
9.s2.在步骤s1进行发酵的培养基中接入生产食品胶的菌株，进行混菌动态发酵；
10.s3.将步骤s2中混菌动态发酵的培养基转为静态发酵培养或继续动态发酵培养；
11.s4.步骤s3混菌发酵结束后，固液分离获得培养基中的水不溶物，通过碱溶液处理
去除菌体及杂质，即得食品胶基细菌纤维素；
12.s5.往步骤s4剩余的培养基发酵液中加入有机溶剂进行沉淀，并进行固液分离，去除液体获得食品胶。
13.本发明将生产细菌纤维素的菌株接入发酵培养基中，再接入生产食品胶的菌株，在不同发酵状态下进行发酵，制备得食品胶基细菌纤维素和食品胶，在提高细菌纤维素产量的同时，还可以联产食品胶。细菌纤维素在单菌发酵时糖利用率低，发酵效率低，在采用本发明提供的混菌原位发酵的方法能使糖利用率提高，生产的食品胶会负载在细菌纤维素上，可以促进发酵，提高食品胶基细菌纤维素的产量，同时联产食品胶。
14.优选地，步骤s1中的生产细菌纤维素的菌株为木糖驹形氏杆菌。
15.更优选地，所述木糖驹形氏杆菌菌株的接种量为5～15％。
16.优选地，步骤s1中的发酵条件为：温度25～35℃，时间10～24h，转速50～150rpm。
17.更优选地，所述步骤s1中的发酵条件为：温度30℃，时间18h，转速100rpm。
18.优选地，步骤s2中接入生产食品胶的菌株为野油菜黄单胞菌时，菌株的接种量为0.01～0.3％。
19.优选地，步骤s2中接入生产食品胶的菌株为少动鞘氨醇单胞菌时，菌株的接种量为0.1～0.3％。
20.优选地，步骤s2中的发酵条件为：温度25～35℃，时间4～14h，转速50～150rpm。
21.更优选地，所述步骤s2中的发酵条件为：温度30℃，时间6h，转速100rpm。
22.优选地，步骤s3为静态发酵时，发酵条件为：温度25～35℃，时间6～15天。
23.更优选地，所述步骤s3为静态发酵时，发酵条件为：温度30℃，时间10天。
24.优选地，步骤s3为继续动态发酵时，发酵条件为：温度25～35℃，时间6～15天，转速20～100rpm。
25.更优选地，所述步骤s3为继续动态发酵时，发酵条件为：温度30℃，时间10天，转速50rpm。
26.优选地，所述步骤s4中所述碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，其浓度为0.25～1mol/l。
27.更优选地，所述碱溶液为0.5mol/l的氢氧化钠。
28.优选地，步骤s1中采用的发酵培养基为hs培养基或稻壳酸水解液发酵培养基。
29.更优选地，采用的发酵培养基为hs培养基，配方为：葡萄糖18～24g/l，细菌学蛋白胨3～6g/l，酵母粉3～6g/l，一水合柠檬酸1～2g/l，na2hpo4·
12h2o 5～8g/l，ph 5.8～6.0。
30.更优选地，hs培养基的配方为：葡萄糖20g/l，细菌学蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，一水合柠檬酸1.15g/l，na2hpo4·
12h2o 6.8112g/l，ph 6.0。
31.优选地，步骤s5中所述有机溶剂为无水乙醇，采用无水乙醇与上清液的体积比为1～4：1。
32.更优选地，所述步骤s5中无水乙醇与上清液的体积比为3：1。
33.优选地，步骤s5中沉淀条件为：温度-20℃～30℃，时间为1～12h。
34.优选地，步骤s5中固液分离法采用离心或者过滤。
35.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
36.本发明通过混菌原位发酵，在细菌纤维素的发酵过程中接入生产食品胶的菌株，制备食品胶基细菌纤维素联产食品胶，通过接入生产菌的合理配比，在提高食品胶基细菌纤维素的产量的同时，还能联产食品胶，获得两种产物；本发明提供的方法能提高发酵效率和发酵糖利用率，并可调控食品胶基细菌纤维素和食品胶的产量，以满足实际生产需求，避免现有技术中将外源食品胶作为添加剂单纯来提高细菌纤维素产量的缺陷，从而提高了发酵效率和经济效益。
具体实施方式
37.以下结合说明书具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
38.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
39.本发明实施例中所述hs培养基配方为：葡萄糖20g/l；细菌学蛋白胨5g/l；酵母粉5g/l；一水合柠檬酸1.15g/l；na2hpo4·
12h2o 6.812g/l，ph 6.0。
40.本发明实施例中所述稻壳酸水解液为：利用稻壳原料通过酸水解制备得稻壳酸水解液，采用稻壳酸水解液配制发酵培养基，其糖分含量为1.07％，ph 6.0。
41.实施例1 hs培养基制备食品胶基细菌纤维素联产黄原胶
42.在hs培养基中以15％(v/v)的接种量接入木糖驹形氏杆菌，在温度30℃、转速为100rpm的条件下培养18h；然后接入0.017％(v/v)的野油菜黄单胞菌在温度30℃、转速为100rpm的条件下继续共同培养6h，最后转移至30℃的条件下静态发酵培养10天。
43.发酵完成后，通过过滤获得培养基中的上层膜，采用0.5mol/l的氢氧化钠对过滤获得的上层膜进行处理，用于去除上层膜中的菌体及其它杂质，获得食品胶基细菌纤维素，其产品产量为4.460g/l。
44.在过滤后剩余的发酵液中加入与其体积比为3：1的无水乙醇，在4℃放置一小时后，离心得到黄原胶，其产量为1.650g/l。与相同条件下单独接入木糖驹形氏杆菌发酵相比，糖利用率提高5.7％。
45.实施例2 hs培养基制备食品胶基细菌纤维素联产黄原胶
46.在hs培养基中以15％(v/v)的接种量接入木糖驹形氏杆菌，在温度为30℃、转速为100rpm的条件下培养18h，然后接入0.05％(v/v)的野油菜黄单胞菌在温度为30℃、转速为100rpm的条件下共同培养6h，最后转移至30℃的条件下静态发酵培养10天。
47.发酵完成后，通过过滤获得培养基中的上层膜，采用0.5mol/l氢氧化钠对过滤获得的上层膜进行处理，用于去除上层膜中的菌体及其它杂质，获得食品胶基细菌纤维素，其产量为3.259g/l。
48.在过滤后剩余的发酵液中加入与其体积比为3：1的无水乙醇，4℃放置一小时后，离心得到黄原胶，其产量为3.020g/l。与相同条件下单独接入木糖驹形氏杆菌发酵相比，糖利用率提高21.1％。
49.实施例3稻壳酸水解液发酵培养基制备食品胶基细菌纤维素联产黄原胶
50.采用稻壳酸水解液配制发酵培养基，灭菌后备用。以15％(v/v)的接种量接入木糖驹形氏杆菌，在温度为30℃、转速为100rpm的条件下培养18h，然后接入0.05％(v/v)的野油
菜黄单胞菌在温度为30℃、转速为100rpm的条件下共同培养6h，最后转移至30℃的条件下静态发酵培养10天。
51.发酵完成后，通过过滤获得培养基中的上层膜，采用0.5mol/l氢氧化钠对过滤获得的上层膜进行处理，用于去除上层膜中的菌体及其它杂质，获得食品胶基细菌纤维素，其产量为1.362g/l。
52.在过滤后剩余的发酵液中加入与其体积比为3：1的无水乙醇，4℃放置一小时后，离心得到粗黄原胶产品，经过透析纯化48h后的黄原胶产量为2.188g/l。与相同条件下单独接入木糖驹形氏杆菌发酵相比，糖利用率提高33.3％。
53.实施例4稻壳酸水解液发酵培养基制备食品胶基细菌纤维素联产黄原胶
54.采用稻壳酸水解液配制发酵培养基，灭菌后备用。以15％(v/v)的接种量接入木糖驹形氏杆菌，在温度为30℃、转速为100rpm的条件下培养18h，然后接入0.1％(v/v)的野油菜黄单胞菌在温度为30℃、转速为100rpm的条件下共同培养6h，最后转移至30℃的条件下静态发酵培养10天。
55.发酵完成后，通过过滤获得培养基中的上层膜，采用0.5mol/l氢氧化钠对过滤获得的上层膜进行处理，获得食品胶基细菌纤维素，其产量为1.468g/l。
56.在过滤后剩余的发酵液中加入与其体积比为3：1的无水乙醇，4℃放置一小时后，离心得到粗黄原胶产品，经过透析纯化48h后的黄原胶产量为2.463g/l。与相同条件下单独接入木糖驹形氏杆菌发酵相比，糖利用率提高33.3％。
57.实施例5 hs培养基制备食品胶基细菌纤维素联产黄原胶
58.在hs培养基中以15％(v/v)的接种量接入木糖驹形氏杆菌，在温度为30℃、转速为100rpm的条件下培养18h，然后接入0.017％(v/v)的野油菜黄单胞菌在温度为30℃、转速为100rpm的条件下共同培养6h，继续在温度为30℃，摇瓶转速为50rpm的条件下动态发酵培养10天。
59.发酵完成后，通过离心获得培养基中的细菌纤维素产物，采用0.5mol/l氢氧化钠进行处理，去除菌体及其它杂质，获得食品胶基细菌纤维素，其产量为2.524g/l。
60.在离心后剩余的发酵液中加入与其体积比为3：1的无水乙醇，4℃放置一小时后，离心得到黄原胶，其产量为1.160g/l。与相同条件下单独接入木糖驹形氏杆菌发酵相比，糖利用率提高16.8％。
61.实施例6 hs培养基制备食品胶基细菌纤维素联产黄原胶
62.在hs培养基中以15％(v/v)的接种量接入木糖驹形氏杆菌，于温度为30℃、转速为100rpm的条件下培养18h，然后接入0.2％(v/v)的野油菜黄单胞菌在温度为30℃、转速为100rpm的条件下共同培养6h，继续在温度30℃，摇瓶转速50rpm的条件下动态发酵培养10天。
63.发酵完成后，通过离心获得培养基中的细菌纤维素产物，通过0.5mol/l氢氧化钠处理去除菌体及其它杂质，获得食品胶基细菌纤维素，其产量为1.212g/l。
64.在离心后剩余的发酵液中加入与其体积比为3：1的无水乙醇，4℃放置一小时后，离心得到黄原胶，其产量为2.940g/l。与相同条件下单独接入木糖驹形氏杆菌发酵相比，糖利用率提高27.9％。
65.实施例7 hs培养基制备食品胶基细菌纤维素联产结冷胶
66.在hs培养基中以15％(v/v)的接种量接入木糖驹形氏杆菌，在温度为30℃、转速为100rpm的条件下培养18h，然后接入0.2％(v/v)的少动鞘氨醇单胞菌在温度为30℃、转速为100rpm的条件下共同培养6h，最后转移至30℃的条件下静态发酵培养15天。
67.发酵完成后，通过过滤获得培养基中的上层膜，采用0.5mol/l氢氧化钠对过滤获得的上层膜进行处理，用于去除上层膜中的菌体及其它杂质，获得食品胶基细菌纤维素，其产量为3.119g/l。
68.在过滤后剩余的发酵液中加入与其体积比为3：1的无水乙醇，4℃放置一小时后，离心得到结冷胶，其产量为3.350g/l。与相同条件下单独接入木糖驹形氏杆菌发酵相比，糖利用率提高10.9％。
69.对比例1细菌纤维素的制备
70.在实施例1与实施例2中，在hs培养基中单独以15％的接种量接入木糖驹形氏杆菌制备细菌纤维素，细菌纤维素的产量为4.286g/l。
71.对比例2细菌纤维素的制备
72.在实施例3与实施例4中，在稻壳水解液培养基中单独以15％的接种量接入木糖驹形氏杆菌制备细菌纤维素，细菌纤维素的产量为1.123g/l。
73.对比例3细菌纤维素的制备
74.在实施例5与实施例6中，在hs培养基中单独以15％的接种量接入木糖驹形氏杆菌制备细菌纤维素，细菌纤维素的产量为2.461g/l。
75.对比例4细菌纤维素的制备
76.在实施例7中，在hs培养基中单独以15％的接种量接入木糖驹形氏杆菌制备细菌纤维素，细菌纤维素的产量为2.632g/l。
77.结合以上实施例1～7与对比例1～4的结果进行比较，实验结果表明，在制备细菌纤维素时采用混菌原位发酵，在细菌纤维素发酵时，接入生产食品胶的菌株，能够促进发酵，通过接入生产不同食品胶的菌株能联产制备不同的食品胶，在提高细菌纤维素产量的前提下，还能联产食品胶，可制备降低成本，实现增产增值。
78.在联产黄原胶的制备中：在相同条件下，实施例2中接入生产食品胶的菌株的量高于实施例1，其生产的黄原胶产量为3.020g/l是高于实施例1黄原胶产量的1.650g/l，其糖利用率也从提高5.7％到提高21.1％，但其接种生产细菌纤维素的菌的接种量相同，而实施例2中的细菌纤维素产量为3.259g/l，低于实施例1中的产量4.460g/l；在相同条件下，实施例6中接入生产食品胶的菌株的量高于实施例5，其生产的黄原胶产量为2.940g/l高于实施例5黄原胶产量的1.160g/l，其糖利用率也从16.8％到提高27.9％，其接种生产细菌纤维素的菌的接种量相同，而实施例6中的细菌纤维素产量为1.212g/l，低于实施例5中的产量2.524g/l；结果表明混菌原位发酵时接入的菌株会影响细菌纤维素的产量，合理的控制发酵时菌种的接入量，可以很好地调控细菌纤维素和食品胶的产量。
79.而对比例1中单独进行细菌纤维素的菌株发酵，其产量为4.286g/l，反而高于实施例2混菌原位发酵制备得到的食品胶基细菌纤维素的产量3.259g/l；对比例3中单独进行细菌纤维素的菌株发酵，其产量为2.461g/l，高于实施例6混菌原位发酵制备得到的食品胶基细菌纤维素的产量1.212g/l；结果表明混菌原位发酵中接入生产食品胶的菌株的量过高反而会影响细菌纤维素的产量。
80.在实施例3～4中与实施例2的区别在于，采用的发酵培养基不同和生产食品胶的菌株接种量不同，实施例3～4中采用的稻壳酸水解液配制发酵培养基，实施例2中采用的是hs培养基，结果表明采用的发酵培养基不同制备得到的食品胶基细菌纤维素和食品胶的产量是有所区别的；在实施例3与实施例2仅有发酵培养基不同，其他条件相同，实施例3中黄原胶的产量为2.188g/l远低于实施例2中黄原胶的产量3.020g/l，实施例3中食品胶基细菌纤维素的产量1.362g/l也低于实施例2中获得的食品胶基细菌纤维素产量3.259g/l。在采用不同的发酵培养基中，实施例4中提高发酵时生产食品胶的菌株接种量，生产黄原胶的野油菜黄单胞菌接种量提高至0.1％，可以使黄原胶的产量提高到2.463g/l的，但还是低于实施例2中野油菜黄单胞菌接种量为0.05％的黄原胶产量3.020g/l。由此说明，在混菌原位发酵中，发酵培养基的不同直接影响到制备食品胶基细菌纤维素和食品胶的产量。
81.在实施例5～6中与实施例1的区别在于，在完成混菌动态发酵后继续发酵的状态不同和生产食品胶的菌株接种量不同；实施例5～6中在完成混菌动态发酵后继续采用动态发酵制备食品胶基细菌纤维素和食品胶，实施例1中在完成混菌动态发酵后采用静态发酵制备食品胶基细菌纤维素和食品胶，在实施例5与实施例1其他条件完全相同时，在完成混菌动态发酵后继续采用动态发酵制备得到的食品胶基细菌纤维素和食品胶的产量与静态发酵不同，实施例1中采用静态发酵获得食品胶基细菌纤维素的产量为4.460g/l，黄原胶的产量为1.650g/l，在实施例5中采用继续动态发酵获得食品胶基细菌纤维素的产量为2.524g/l，黄原胶的产量为1.160g/l。由此可知，静态发酵的产量明显高于动态发酵；而从食品胶基细菌纤维素的形态上看来，静态发酵下的细菌纤维素成完整膜状，动态发酵下的食品胶基细菌纤维素成絮状或小块状膜；而采用动态发酵可使糖利用率从提高5.7％到提高16.8％。
82.而在实施例7中采用的是生产结冷胶的少动鞘氨醇单胞菌，其接入量为0.2％(v/v)明显高于实施1和实施例2中生产黄原胶的野油菜黄单胞菌的量0.017％和0.05％，其他条件相同，实施例7中制备得到的食品胶基细菌纤维素和食品胶与实施1和实施例2中生产的食品胶基细菌纤维素和食品胶产量不同，糖利用率也不同，且实施例7混菌原位发酵后获得的食品胶基细菌纤维素产量高于单独发酵生产的细菌纤维素产量；结果表明，混菌原位发酵时接入不同的生产食品胶的菌，会导致生产食品胶基细菌纤维素和食品胶的产量不同，糖利用率也有所差异。
83.综上所述，混菌原位发酵能提高食品胶基细菌纤维素的产量及糖利用率，接入生产食品胶菌株的接种量控制合理的范围内，在提高食品胶基细菌纤维素的产量的前提下，联产食品胶；而在混菌原位发酵时发酵条件的不同(发酵培养基、发酵状态以及接入的生产菌株)是会直接影响到发酵后制备的产品的产量。与单菌发酵相比，混菌原位发酵有效提高了发酵糖利用率，既能高效合成食品胶基细菌纤维素产品，又联产高值食品胶，提高了发酵效率和经济效益。
84.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。