一种尿鸟苷蛋白类似物盐及片剂的制备方法与流程

1.本发明涉及多肽领域，更具体地，本发明涉及提供一种尿鸟苷蛋白类似物盐及片剂的制备方法。


背景技术：

2.普卡那肽(plecanatide)是尿鸟苷蛋白 (uroguanylin，ugn)的类似物，含有双二硫键连接的16个氨基酸的环状多肽。该药最初由美国callisto制药公司研制，转让给synergy制药公司开发，于2017年1月19日获得美国食品药品管理局(fda)批准上市，商品名为trulance
®
。普卡那肽是含16个氨基酸的环状多肽，是促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶c(guanylate cyclase-c,gc-c)受体激动药，能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道，增加胃肠道的蠕动，适用于治疗成人慢性特发性便秘(chronicidiopathic constipation，cic)。
3.目前市场上仅存在普卡那肽原研制剂，采用普通口服片剂，参照普卡那肽fda说明书，普卡那肽原研制剂的存放温度为20-25℃。在普卡那肽的研究中，我们发现普卡那肽原料药在存放温度25℃的条件下，会有不同杂质的增长。
4.本发明将针对易于产生杂质的药物在存放过程中稳定杂质，采用制备普卡那肽钠盐精肽，增加药物存放稳定性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供普卡那肽的一种新的制药学上可接受的盐，该盐具有改良的热稳定性，以解决普卡那肽存放过程稳定性差的问题。
6.本发明普卡那肽的合成和环化方法参考专利cn110981939a实施例5、8和实施例11，纯化方法参考专利cn110981939a实施例14，纯化洗脱，收集目标峰的洗脱液，旋转蒸发浓缩，冻干得到普利卡那肽精肽，检测纯度为99.7%，最大单杂0.11%。本发明将上述收集目标峰的普卡那肽洗脱液通过转盐方法（转盐方法详见实施例1，流动相a为50mm不同盐的水溶液）成相对应的不同盐（包括醋酸盐、无盐、铵盐、钾盐、钠盐、钙盐、镁盐等）的普卡那肽精肽溶液，研究发现不同盐的普卡那肽精肽溶液稳定性不同。其中，当醋酸盐和三氟乙酸盐普卡那肽精肽溶液时，发现拓扑异构体杂质在室温中随着时间的延长增长最快，而普卡那肽的钠盐精肽溶液时，发现拓扑异构体杂质相对较稳定。
7.进一步，将上述不同盐普卡那肽精肽溶液，旋转蒸发浓缩，冻干得到对应不同盐的普利卡那肽精肽，研究发现不同盐形式的普卡那肽精肽及其制剂，在25℃温度的存放过程中，稳定性存在明显差异。本发明意外的发现了普卡那肽钠盐精肽，能很好的提高稳定性，特别适合于用作原料药。
8.本发明技术方案包括如下步骤：（1）将纯化后的普卡那肽溶液加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上，先以含所需盐的流动相体系进行第一次冲洗，再以含水的流动相体系进行第二次冲洗，最
后以含水的流动相体系进行第三次冲洗，收集洗脱液；（2）将步骤（1）中所得的洗脱液减压蒸馏浓缩后，经冷冻干燥后，即得普卡那肽。
9.进一步，步骤（1）中，所述第一次冲洗流动相由流动相a和流动相b组成，第二次冲洗和第三次冲洗流动相由流动相b和流动相c组成，其中流动相a为所需盐的水溶液，如乙酸钠溶液、氯化钠溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、硫酸钠溶液等一种或多种，流动相b为甲醇或乙腈，流动相c为纯化水。
10.其中，三次冲洗中，第一次冲洗所用流动相的总体积为1-20个柱体积，优选2-5个柱体积，流动相a的体积占流动相总体积的80-99%。第二次冲洗所用流动相的总体积为1-20个柱体积，优选1-3个柱体积，流动相c的体积占流动相总体积的80-99%。第三次冲洗所用流动相的总体积为1-20个柱体积，优选1-3个柱体积，流动相c的体积占流动相总体积的10-40%。
11.优选的，洗脱梯度如下：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820249820250298410298420802011208020
12.步骤（1）中，所述流动相体系中流动相a的盐浓度为10-100mm，优选40-60mm。
13.步骤（1）中，所述的普卡那肽溶液为经制备级反相高效液相色谱系统纯化后的普卡那肽溶液，其hplc纯度大于或等于95%。
14.步骤（1）中，所述的制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱的填料为c4、c8和c18键合硅胶或高分子聚合物中的一种或多种。
15.步骤（1）中，两次冲洗时候所用的检测器为紫外检测器，检测波长为200-300nm。
16.本发明技术方案包括所述制备的普卡那肽钠盐精肽的片剂制备方法，其特征在于它包括如下步骤：普卡那肽钠盐精肽、微晶纤维素和硬脂酸镁直接混合，采用6.35mm冲模制成片剂。进一步，普卡那肽钠盐精肽3mg、微晶纤维素（ph-112）96.75mg和硬脂酸镁0.25mg直接混合，采用6.35mm冲模制成片剂。
17.本发明技术效果：1、获得稳定的普卡那肽钠盐精肽溶液，拓扑异构体杂质稳定，易于大生产旋蒸及冻干操作；2、本法制备所得普卡那肽钠盐收率高、纯度高、性质稳定；3、纯化后的普卡那肽溶液杂质含量低；4、工艺简单，易于大生产生产操作；5、普卡那肽钠盐精肽能很好的提高稳定性，特别适合于用作原料药。
具体实施方式
18.本发明提供了普卡那肽的一种新的制药学上可接受的盐。
19.根据下述实施例，可以更好地理解本发明的方法及其核心思想。实施例所描述的具体工艺条件及其结果仅用于说明本说明，而不应当也不会限制权利求书中所详细描述的本发明。
20.本发明普卡那肽的合成和环化方法参考专利cn110981939a实施例5、8和实施例11，纯化方法参考专利cn110981939a实施例14。
21.采集数据所用的仪器：hplc：戴安u3000高效液相色谱仪。
22.制备hplc：北京澳诺lc2000制备液相色谱仪。
23.对比实施例1 普卡那肽无盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50*250mm。将普卡那肽溶液0.46l(普卡那肽1.40g，浓度3.02mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm醋酸溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820249820250298410298420802011208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.24g，收率84.1%，纯度99.68%，测得成品中醋酸含量0.12%，铵盐含量0.05%。
24.对比实施例2普卡那肽铵盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50*250mm。将普卡那肽溶液0.46l (普卡那肽1.40g，浓度3.02mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm乙酸铵溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820249820250298410298420802011208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.38g，收率95.1%，纯度99.69%，测得成品中铵含量1.30%。
25.对比实施例3普卡那肽钾盐的制备
以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50*250mm。将普卡那肽溶液0.46l (普卡那肽1.40g，浓度3.02mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm碳酸氢钾溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820249820250298410298420802011208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.33g，收率91.7%，纯度99.70%，测得成品中钾含量3.70%。
26.对比实施例4普卡那肽钙盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50*250mm。将普卡那肽溶液0.46l (普卡那肽1.40g，浓度3.02mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm碳酸氢钙溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820249820250298410298420802011208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.35g，收率93.2%，纯度99.70%，测得成品中钙含量3.98%。
27.对比实施例5普卡那肽镁盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50*250mm。将普卡那肽溶液0.46l (普卡那肽1.40g，浓度3.02mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm碳酸氢镁溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820249820250298410298
420802011208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.26g，收率86.8%，纯度99.72%，测得成品中镁含量4.14%。
28.对比实施例6普卡那肽醋酸盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50*250mm。将普卡那肽溶液0.43l(普卡那肽1.22g，浓度2.82mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm乙酸铵溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以50mm醋酸为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820249820250298410298420802011208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.16g，收率91.9%，纯度99.68%，测得成品中醋酸含量3.66%。
29.对比实施例7普卡那肽tfa盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50*250mm。将普卡那肽溶液0.43l (普卡那肽1.22g，浓度2.82mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm tfa溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）0982249822508085080收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.10g，收率87.3%，纯度99.70%，测得成品中tfa含量4.55%。
30.实施例1普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液1.892l(普卡那肽5.95g，浓度3.14mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为450ml/min。以50mm乙酸钠溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）
09820309820310298510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽5.82g，收率94.5%，纯度99.75%，测得成品中钠含量4.43%。
31.实施例2普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液1.993l(普卡那肽6.06g，浓度3.04mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为450ml/min。以40mm乙酸钠溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820309820310298510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽5.90g，收率94.4%，纯度99.70%，测得成品中钠含量4.16%。
32.实施例3普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液2.052l(普卡那肽5.50g，浓度2.68mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为450ml/min。以60mm乙酸钠溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820309820310298510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽5.43g，收率94.2%，纯度99.73%，测得成品中钠含量4.01%。
33.实施例4普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液0.460l(普卡那肽1.56g，浓度3.26mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm氯化钠溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820309820310298510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.46g，收率90.4%，纯度99.68%，测得成品中钠含量4.26%。
34.实施例5普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液0.460l(普卡那肽1.56g，浓度3.26mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm碳酸氢钠溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820309820310298510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.50g，收率92.1%，纯度99.70%，测得成品中钠含量4.21%。
35.实施例6普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液0.460l(普卡那肽1.56g，浓度3.26mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm碳酸钠溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820309820310298
510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.51g，收率93.4%，纯度99.71%，测得成品中钠含量4.16%。
36.实施例7普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液0.460l(普卡那肽1.56g，浓度3.26mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm磷酸二氢钠溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820309820310298510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.48g，收率91.5%，纯度99.77%，测得成品中钠含量4.00%。
37.实施例8普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液0.460l(普卡那肽1.56g，浓度3.26mg/ml)加载到制备级反相高效液相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm磷酸氢二钠溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820309820310298510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.55g，收率95.2%，纯度99.71%，测得成品中钠含量4.09%。
38.实施例9普卡那肽钠盐的制备以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150*250mm。将普卡那肽溶液0.460l(普卡那肽1.56g，浓度3.26mg/ml)加载到制备级反相高效液
相色谱系统的色谱柱上。检测波长为220nm，流速为60ml/min。以50mm硫酸钠溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，以纯化水为流动相c，以下表洗脱梯度进行洗脱：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）流动相c（%）09820309820310298510298520802012208020收集馏分，用旋转蒸发仪水浴温度在25-30℃，真空度在-0.09mpa以下除去甲醇和部分水，得到普卡那肽浓缩液。普卡那肽浓缩液经冷冻干燥得到普卡那肽1.54g，收率93.6%，纯度99.78%，测得成品中钠含量4.14%。
39.实施例10普卡那肽片剂制备将普卡那肽3mg、微晶纤维素（ph-112）96.75mg和硬脂酸镁0.25mg直接混合，采用6.35mm冲模制成片剂。
40.实施例11 普卡那肽钠盐的稳定性试验含量检测方法如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相a相：50mm磷酸铵缓冲液（磷酸调ph至6.8），流动相b相：乙腈；梯度：5-45%（40min），45-70%（10min）；流速：1ml/min；波长：220nm；柱温：40℃。
41.1.加速稳定性试验将参比制剂(trulance)、本发明所述原料药和本发明所述制 剂置于40℃，75％rh的稳定性箱中，考察3个月稳定性，在加速10 天、1个月和3个月分别取样检测，加速稳定性试验结果如下表：
2.长期稳定性试验将参比制剂、本发明所述原料药和本发明所述制剂置于25℃， 40％rh的稳定性箱中，考察12个月稳定性，在长期1个月、3个月 和6个月分别取样检测，长期稳定性试验结果如下表：
从上述表格数据对比可见，本发明钠盐及其制剂长期稳定性考察 结果较优。
42.实施例12不同盐普卡那肽盐溶液的稳定性试验将上述收集目标峰的普卡那肽洗脱液通过转盐方法（转盐方法详见实施例1，流动相a为50mm不同盐的水溶液）成相对应的不同盐（包括醋酸盐、无盐、铵盐、钾盐、钠盐、钙盐、镁盐等）的普卡那肽精肽溶液，研究发现不同盐的普卡那肽精肽溶液稳定性不同。其中，当醋酸盐和三氟乙酸盐普卡那肽精肽溶液时，发现拓扑异构体杂质在室温中随着时间的延长增长最快，而普卡那肽的钠盐精肽溶液时，发现拓扑异构体杂质相对较稳定。25℃不同盐的普卡那肽精肽溶液中拓扑异构体杂质含量的具体对比数据如下：
不同盐普卡那肽盐溶液0小时8小时16小时24小时48小时醋酸盐0.051.055.2515.2332.56三氟乙酸盐(cn110981939a实施例14收集目标峰的洗脱液)0.060.974.6813.5926.43铵盐0.040.260.711.872.56钾盐0.050.210.741.683.02钠盐0.040.160.611.051.67
钙盐0.060.310.822.163.68镁盐0.050.340.962.985.45
将上述不同盐普卡那肽精肽溶液，旋转蒸发浓缩，冻干得到对应不同盐的普利卡那肽精肽，研究发现不同盐形式的普卡那肽精肽及其制剂，在25℃温度的存放过程中，稳定性存在明显差异。本发明意外的发现了普卡那肽钠盐精肽，能很好的提高稳定性，特别适合于用作原料药。