使用了玉米皮的蛋白质的制造方法与流程

1.本发明涉及使用玉米皮的采用木霉属(trichoderma)丝状菌的蛋白质的制造方法。


背景技术：

2.已知木霉属丝状菌具有高蛋白质制造能力，进行了使用了该丝状菌制造蛋白质的研究。已知木霉属丝状菌以纤维素、乳糖、纤维二糖等作为诱导物质，制造在蛋白质中特别是被分类为糖化酶的纤维素酶的能力高，为了增加蛋白质的制造量，自古以来进行了很多控制纤维素酶制造的基因的改变、培养条件的最佳化等研究。
3.在专利文献1中公开了通过在培养木霉属丝状菌时，在培养基中添加大豆皮、浆粕、玉米皮等，从而蛋白质的生产性提高，特别是纤维素酶的生产性提高。
4.此外，作为使木霉属丝状菌的纤维素酶的制造量提高的方法，在非专利文献1中记载了用添加了葡萄糖、乳糖的培养基来培养木霉属丝状菌的方法。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：国际公开第2018/159573号
8.非专利文献
9.非专利文献1：antonella a，regulation of cellulase and hemicellulase gene expression in fungi，current genomics，volume 14，2013，p230-249


技术实现要素：

10.发明所要解决的课题
11.课题是提供使用木霉属丝状菌，进一步提高蛋白质的生产性的方法。
12.用于解决课题的方法
13.本发明者们特别是着眼于玉米皮作为使木霉属丝状菌的蛋白质生产性提高的物质，进行了深入研究。其结果发现，如果将由玉米皮粉碎而制备出的各种粒径的玉米皮的粉碎物之中的、在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中在粒径70μm以上且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物添加到培养基来培养木霉属丝状菌，则蛋白质的生产性的提高效果高，从而完成了本发明。
14.即，本发明由以下(1)～(9)构成。
15.(1)一种蛋白质的制造方法，包括：使用包含玉米皮粉碎物的培养基来培养木霉属丝状菌的培养工序，上述玉米皮粉碎物在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，在粒径70μm以上且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰。
16.(2)根据(1)所述的蛋白质的制造方法，上述培养基包含葡萄糖和/或乳糖。
17.(3)根据(1)或(2)所述的蛋白质的制造方法，上述培养工序的培养方法为深层培养。
18.(4)根据(1)～(3)中任一项所述的蛋白质的制造方法，包括：将在上述培养工序中获得的培养液保持在25℃以上且55℃以下的保持工序；以及将上述保持工序后的培养液固液分离，从液体部分回收上述蛋白质的回收工序。
19.(5)根据(1)～(4)中任一项所述的蛋白质的制造方法，上述蛋白质为纤维素酶。
20.(6)根据(5)所述的蛋白质的制造方法，上述纤维素酶至少显示将4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷分解的β-葡糖苷酶活性。
21.(7)一种糖的制造方法，包括：通过(5)或(6)所述的蛋白质的制造方法来制造纤维素酶的工序；以及使用在上述工序中获得的纤维素酶将含有纤维素的生物质糖化的工序。
22.(8)一种玉米皮粉碎物，其在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，在粒径70μm以上且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰。
23.(9)一种培养基，包含(8)所述的玉米皮粉碎物。
24.发明的效果
25.本发明通过使用玉米皮粉碎物来培养木霉属丝状菌，从而能够高效率地制造蛋白质，上述玉米皮粉碎物在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，在粒径70μm以上且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰。
附图说明
26.图1为通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的玉米皮粉碎物a～e的粒度分布结果。
27.图2为通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的玉米皮粉碎物f的粒度分布结果。
具体实施方式
28.本发明的特征在于，通过将原来作为蛋白质的制造能力优异的微生物的木霉属丝状菌与玉米皮粉碎物一起培养，从而有效率地制造蛋白质，上述玉米皮粉碎物在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，特别是在粒径70μm以上且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰。
29.在本发明中使用的木霉属丝状菌也被称为肉座菌属(hypocrea)，但在本说明书中记载为木霉属。在本发明中使用的木霉属丝状菌具体而言优选为里氏木霉(trichoderma reesei)、绿色木霉(trichoderma viride)、深绿木霉(trichoderma atroviride)、长枝木霉(trichoderma longibrachiatum)，更优选为里氏木霉(trichoderma reesei)。此外，木霉属丝状菌不限制于野生株，也可以优选使用为了提高蛋白质制造能力而被改良了的木霉属丝状菌的突变株。例如，木霉属丝状菌的突变株中，可以利用通过诱变剂、紫外线照射等而实施诱变处理，从而进行了培养时的培养液的粘度降低、或蛋白质的生产性提高了的突变株。此外，也可以利用使用基因重组技术而将菌株进行了培养时的培养液的粘度降低了的基因重组株、蛋白质的生产性提高了的基因重组株。此外，可以使用将上述采用诱变剂、紫外线照射等的诱变处理与基因重组技术组合而获得的突变株。
30.里氏木霉(trichoderma reesei)的具体例可举出相当于里氏木霉(trichoderma reesei)的祖先的拟里氏木霉(trichoderma parareesei)(atcc mya-4777)、作为来源于里
氏木霉(trichoderma reesei)的公知的突变株的qm6a株(nbrc31326)、qm9123株(atcc24449)、qm9414株(nbrc31329)、pc-3-7株(atcc66589)、qm9123株(nbrc31327)、rutc-30株(atcc56765)、cl-847株(enzyme.microbiol.technol.,10、341-346(1988))、mcg77株(biotechnol.bioeng.symp.,8、89(1978))、mcg80株(biotechnol.bioeng.,12、451-459(1982))和它们的衍生株等。另外，qm6a株、qm9414株、qm9123株可以由nbrc(nite biological resource center)获得，pc-3-7株、rutc-30株可以由atcc(american type culture collection)获得。
31.所谓玉米皮，是覆盖玉米种子的种皮，是玉米种子的一部分。玉米皮也被称为玉米种皮、玉米纤维、玉米饲料等，但在本说明书中记载为玉米皮。在本发明中使用的玉米皮优选为蛋白质、淀粉等除玉米皮以外的杂质少的。玉米皮可以从玉米的种子直接制备而使用，也可以使用作为玉米淀粉的制造过程的副产物而获得的。
32.在本发明中使用的玉米皮粉碎物在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，在粒径70μm以上且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰。以下，有时将具有该特征的相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物在本说明书中记载为本发明的玉米皮粉碎物。
33.本发明的玉米皮粉碎物可以将玉米皮破碎而制备。粉碎条件可以为湿式或干式的任一条件。在玉米皮的粉碎中只要使用周知的粉碎机即可，具体而言，可举出被分类为微粉碎机的辊磨机或喷射磨机、被分类为高速旋转粉碎机的锤磨机或销棒粉碎机、被分类为容器驱动型磨机的旋转磨机、振动磨机或行星磨机、被分类为超微粉碎机的超微磨碎机、珠磨机。用粉碎机进行了粉碎的玉米皮粉碎物使用以下所示的测定方法测定，为了获得具有目标的粒径的粉碎物，只要调整粉碎机的粉碎条件即可。
34.本发明的玉米皮粉碎物的粒径使用基于激光衍射/散射法而测定的值。测定时所使用的试样的分散剂使用乙醇，光源使用680nm的半导体激光。具体的测定方法如以下所述。首先，向作为分散介质而使用的乙醇混合测定试样的玉米皮粉碎物，用超声波处理了3分钟以上使其变得均匀，以所得产物作为测定用样品。然后，使用该样品，用仪器的传感器部分测定各散射角度下的强度分布，使用预先计算的各种标准试样的散射图案，由与实测的散射图案最接近的标准试样的散射图案计算各粒径的颗粒含量，求出粒径分布。
35.在本发明中使用的基于激光衍射/散射法而进行测定的测定仪只要是能够检测0.01μm以上且1mm以下的粒径的测定仪即可，例如，只要使用株式会社岛津制作所制激光衍射式粒度分布测定装置“sald-2000j”等即可。此外，粒径的测定至少进行2次以上，将其平均值设为测定值。
36.本发明的玉米皮粉碎物是在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，在粒径70μm以上且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物，是优选在粒径70μm以上且140μm以下的范围，更优选在粒径70μm以上且130μm以下的范围，进一步优选在粒径70μm以上且120μm以下的范围，特别优选在75μm以上且120μm以下的范围具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物。在本发明中，所谓在上述范围具有相对颗粒量峰，是指在上述范围具有被检测到的峰之中的最高相对颗粒量峰的状态。这里，除上述相对颗粒量峰以外还具有多个表示颗粒大小的指标，但是否相当于本发明的玉米皮粉碎物通过是否在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，在70μm以上
且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰来判断。例如，有时将颗粒大小作为平均粒径(作为与平均粒径含义相同的术语，也有时以平均粒子径的名称表示)而表示，但即使是平均粒径不与相对颗粒量成为峰的粒径一致、平均粒径为70μm以上且150μm以下的玉米皮粉碎物，在该范围不具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物也不相当于本发明的玉米皮粉碎物。
37.使用了添加了本发明的玉米皮粉碎物的培养基的木霉属丝状菌的培养方法没有特别限定，例如，可以通过使用了离心管、烧瓶、摇瓶发酵器、罐等的液体培养、使用了板等的固体培养等进行培养。木霉属丝状菌需要在需氧条件下培养，这些培养方法中，特别优选为在摇瓶发酵器、罐内一边进行通气、搅拌一边培养的深层培养。通气量优选为0.1vvm以上且2.0vvm以下，更优选为0.3vvm以上且1.5vvm以下，特别优选为0.5vvm以上且1.0vvm以下。培养温度优选为25℃以上且35℃以下，更优选为25℃以上且31℃以下。培养中的ph的条件优选为ph3.0以上且ph7.0以下，更优选为ph4.0以上且ph6.0以下。关于培养时间，在制造蛋白质的条件下，进行直到蓄积能够回收的量的蛋白质为止，通常为24小时以上且288小时以下左右，更优选为36小时以上且240小时以下。
38.在本发明中制造的蛋白质没有特别限制，可以有效率地制造被分泌到菌体外的蛋白质，其中优选为酶，更优选为纤维素酶、淀粉酶、转化酶、几丁质酶、果胶酶等糖化酶，进一步优选为纤维素酶。
39.在从在本发明中获得的培养液回收蛋白质的情况下，只要将培养液固液分离而回收液体部分所包含的蛋白质即可。固液分离只要通过过滤、离心分离等任意的方法进行即可，可以使用压滤机、螺旋倾析器、连续离心分离机等。
40.用包含玉米皮的培养基来培养木霉属丝状菌而获得的培养液有时在固液分离时得不到澄清的液体部分，此外，在使用过滤膜或滤布进行固液分离时因为过滤膜或滤布的闭塞而过滤时间变长，但这些课题可以通过作为固液分离的前处理，将在本发明中获得的培养液在一定温度下保持来解决。另外，在本说明书中，作为固液分离的前处理，有时将培养液保持在一定温度的处理记载为保温处理。
41.保温处理的保持温度优选为25℃以上且55℃以下，更优选为30℃以上且55℃以下，特别优选为40℃以上且50℃以下。
42.保温处理的处理时间只要以5小时～30小时左右作为标准进行即可。
43.保温处理可以在静置条件下进行，但在培养液的液量多的情况下，为了使培养液的温度变得均匀，优选一边搅拌一边进行。在搅拌时，优选平稳地搅拌而不使培养液中的溶解氧浓度升高。例如，在使用了5l摇瓶发酵器(株式会社
バイオット
制)的情况下，优选为50rpm以上且700rpm以下，更优选为100rpm以上且600rpm，特别优选为200rpm以上且500rpm以下。优选除了搅拌以外在不使培养液的溶解氧浓度升高的条件下进行保温处理，例如，在培养时进行了通气的情况下，只要阻断通气功能而进行保温处理即可。
44.进行了保温处理的培养液与未进行保温处理的培养液相比能够获得澄清的液体部分。此外，通过减压过滤等高速过滤方法也能够抑制过滤阻力，进行有效率的固液分离。在进行减压过滤时，只要利用聚砜保持件(株式会社
アドバンテック
制)等减压过滤用塑料保持件即可。
45.使用聚砜保持件进行固液分离时使用的滤布可以使用例如聚丙烯制的滤布，只要使用透气度为0.5ml/(min＊cm2)以上且500ml/(min＊cm2)以下左右的滤布即可。此时，可以
在进行将过滤助剂涂覆于滤布的预涂覆后进行固液分离。过滤助剂只要使用硅藻土等即可，可以举出例如
“ラヂオライト”
(昭和化学工业株式会社制)，
“ラヂオライト”
的级别只要使用#100以上且#3000左右即可。过滤助剂可以与保温处理后的培养液预先混合而使用。在过滤助剂与保温处理后的培养液预先混合而使用的情况下，只要将过滤助剂相对于培养液以1重量％以上且20重量％以下左右添加即可。
46.此外，在通过静置而进行了保温处理的情况下、将保温处理后的培养液静置了的情况下，由于在上方分离固体成分，在下方分离液体成分，因此也可以通过采集下方的液体部分而进行固液分离。
47.将在本发明中获得的培养液固液分离而获得的液体部分只要根据用途而进一步使用mf膜进行除菌、或使用uf膜进行浓缩即可。
48.上述液体部分的浊度作为nephelometric turbidity unit(比浊法浊度单位，ntu)而算出。浊度的测定只要使用市售的浊度计即可，可举出例如，便携用浊度计2100p型(hach社制)等。浊度计只要预先使用福尔马肼溶液等制造商承认的第二标准液而进行校正即可。
49.上述液体部分的浊度优选为500ntu以下，更优选为300ntu以下，进一步优选为200ntu以下，特别优选为100ntu以下。
50.在作为在本发明中优选制造的蛋白质的纤维素酶中包含具有对木聚糖、纤维素、半纤维素的分解活性的酶等。作为具体例，可举出通过纤维素链的水解而制造纤维二糖的纤维二糖水解酶(ec 3.2.1.91)、从纤维素链的中央部分进行水解的内切葡聚糖酶(ec 3.2.1.4)、将纤维寡糖和纤维二糖水解的β-葡糖苷酶(ec 3.2.1.21)、以作用于半纤维素、特别是木聚糖作为特征的木聚糖酶(ec 3.2.1.8)、将木寡糖水解的β-木糖苷酶(ec 3.2.1.37)等。在通过本发明而制造纤维素酶的情况下，蛋白质浓度、活性提高，特别是对β-葡糖苷酶显著表现该效果。
51.在本发明中，蛋白质浓度如以下所述进行测定。将通过本发明的方法来培养木霉属丝状菌从而获得的培养液以15,000
×
g进行10分钟离心分离，将上清液作为蛋白质溶液。添加将纤维素酶在quick start bradford蛋白质测定(bio-rad社制)250μl中稀释了的纤维素酶溶液5μl，测定在室温下静置15分钟后的595nm下使用的吸光度。以牛血清白蛋白溶液作为标准液，基于标准曲线而算出糖化酶溶液所包含的蛋白质浓度。此外，在测定纤维素酶的蛋白质浓度的情况下，只要将该蛋白质溶液作为纤维素酶溶液对待即可。
52.β-葡糖苷酶活性通过以下方法测定。首先，在含有1mm的4-硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
株式会社制)的50mm乙酸缓冲液90μl中添加酶稀释液10μl，在30℃下使其反应10分钟。接下来加入2m碳酸钠10μl，充分地混合而停止反应，测定405nm的吸光度的增加。最后将每1分钟游离1μmol的4-硝基苯酚的活性作为1u而算出活性。
53.关于在本发明中使用的培养木霉属丝状菌的培养基的组成，只要除了本发明的玉米皮粉碎物以外，成为木霉属丝状菌可以制造蛋白质那样的培养基组成，就没有特别限制，可以采用木霉属丝状菌的周知的培养基组成。作为氮源，可以使用例如，多聚蛋白胨、肉汁、csl、大豆渣等。此外，在培养基中可以另行添加用于制造蛋白质的诱导物质。
54.添加于上述培养基的本发明的玉米皮粉碎物的浓度只要作为对培养基的终浓度而为1重量％以上且50重量％以下左右即可，优选为5重量％以上且30重量％以下，更优选
为5重量％以上且25重量％以下。
55.此外，在上述培养基中可以包含葡萄糖和/或乳糖，优选包含葡萄糖和乳糖两者。将葡萄糖和/或乳糖对培养基的添加量只要分别为1g/l左右即可。
56.葡萄糖和/或乳糖可以在使用了本发明的玉米皮粉碎物的培养的中途添加。在该情况下，葡萄糖和/或乳糖的状态可以为液体也可以为固体，但优选使其溶解于水等制备糖液而使用。在从使用了本发明的玉米皮粉碎物的培养的中途追加葡萄糖和/或乳糖的情况下，优选每培养24小时，对培养液1l，添加葡萄糖10g以上和/或乳糖1g以上，更优选添加葡萄糖25g以上和/或乳糖2.5g以上，特别优选添加葡萄糖50g以上和/或乳糖5g以上。
57.此外，从使用了本发明的玉米皮粉碎物的培养的中途添加的混合糖的葡萄糖与乳糖的比率优选为等量或与乳糖量相比更多地添加葡萄糖量。此外，开始液糖的添加的时机优选为从培养开始到144小时，更优选为从培养开始到72小时，特别优选为从培养开始到48小时。糖的添加可以为一次，也可以为多次，也可以连续地添加。
58.在通过本发明制造纤维素酶的情况下，可以在上述培养基中进一步添加纤维素、木聚糖等诱导纤维素酶的制造的诱导物质。此外，纤维素、木聚糖可以添加包含纤维素、木聚糖的生物质作为诱导物质。作为含有纤维素、木聚糖的生物质的具体例，也可以使用种子植物、蕨类植物、藓类植物、藻类、水草等植物、以及废建材等。种子植物被分类为裸子植物和被子植物，二者都可以优选使用。被子植物进一步被分类为单子叶植物和双子叶植物，作为单子叶植物的具体例，可举出蔗渣、柳枝稷、象草、斑茅、玉米秸秆、玉米穗轴、稻秸、麦秸等，作为双子叶植物的具体例，优选使用甜菜浆、桉树、橡树、白桦等。
59.此外，包含纤维素、木聚糖的生物质可以使用进行了前处理的物质。前处理方法没有特别限定，可以使用例如，酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的方法。作为进行了这样的前处理的包含纤维素、木聚糖的生物质，可以使用浆粕。
60.此外，也可以不从将本发明的玉米皮粉碎物和木霉属丝状菌进行了培养的培养液除去菌体，将包含菌体的培养液直接作为酶液而使用，但在作为蛋白质的溶解液而利用的情况下，优选进行处理使得木霉属丝状菌在培养液中不能生长发育。作为进行处理使得菌体不能生长发育的方法，可举出热处理、药剂处理、酸/碱处理、uv处理等。
61.此外，在作为制造对象的蛋白质为纤维素酶的情况下，可以使用该纤维素酶将含有纤维素的生物质糖化来制造糖。此外，培养上述突变株而获得的纤维素酶由于与培养上述突变导入前的亲株而获得的纤维素酶相比β-葡糖苷酶的活性特别高，因此可以有效率地将含有纤维素的生物质分解而获得葡萄糖浓度高的糖液，可以获得更多的糖。
62.此外，可以使用与作为上述诱导剂而记载的包含纤维素的生物质同样的生物质、进行了前处理的生物质作为糖化对象。
63.糖化反应的条件没有特别限定，但糖化反应的温度优选为25℃以上且60℃以下的范围，特别是更优选为30℃以上且55℃以下的范围。糖化反应的时间优选为2小时以上且200小时以下的范围。糖化反应的ph优选为ph3.0以上且ph7.0以下的范围，进一步优选为ph4.0以上且ph6.0以下的范围。在来源于木霉属丝状菌的纤维素酶的情况下，该反应最佳ph为5.0。进一步，由于在水解的过程中发生ph的变化，因此优选在反应液中添加缓冲液、或一边使用酸、碱而保持一定ph一边实施。
64.在从糖化液分离回收酶的情况下，可以将糖化液用超滤膜等过滤，在非透过侧回收，根据需要作为过滤的前工序，可以预先从糖化液除去固体成分。回收了的酶可以再次用于糖化反应。
65.实施例
66.以下举出实施例而具体地说明本发明。
67.＜参考例1＞蛋白质浓度测定条件
68.蛋白质浓度测定试剂：quick start bradford蛋白质测定(bio-rad社制)
69.测定条件
70.测定温度：室温
71.蛋白质浓度测定试剂：250μl
72.丝状菌的培养液：5μl
73.反应时间：5分钟
74.吸光度：595nm
75.标准品：bsa。
76.＜参考例2＞纤维素酶的活性的测定条件
77.(β-葡糖苷酶活性的测定条件)
78.基质：4-硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷(
シグマアルドリッチジャパン
株式会社制)
79.反应液：含有1mm的4-硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷的50mm乙酸缓冲液90μl
80.酶稀释液：10μl
81.反应温度：30℃
82.反应时间：10分钟
83.反应终止剂：2m碳酸钠10μl
84.吸收度：405nm。
85.＜参考例3＞粒度分布的测定条件
86.(前处理)
87.分散介质：1级乙醇
88.分散介质使用量：10ml
89.单元：间歇单元
90.超声波处理条件：发送频率40khz，3分钟。
91.(粒度分布测定)
92.装置：激光衍射式粒度分布测定装置sald-2000j(株式会社岛津制作所制)
93.光源：半导体激光(波长：680nm)
94.传感器：76元件衍射/散射光传感器
95.测定温度：22～25℃
96.颗粒的复折射率：2.00～0.20i(装置手册中的标准折射率的值)
97.颗粒计测范围：0.03～700μm
98.测定n数：2(更换测定液而测定2次，使用了平均值)。
99.＜试验例1＞玉米皮粉碎物a～f的采用激光衍射/散射法的体积基准的粒度分布测定
100.将玉米皮(泰皇岛流涌农产品加工有限公司制)委托给
マテリス
株式会社进行破碎，制备出玉米皮粉碎物。将5种玉米皮粉碎物通过参考例3的方法而测定粒径，确认了在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，在粒径34.3μm、粒径41.9μm、粒径114.5μm、粒径171.2μm、粒径256.0μm具有相对颗粒量峰。
101.以下，将在粒径34.3μm具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物称为玉米皮粉碎物a，将在粒径41.9μm具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物称为玉米皮粉碎物b，将在粒径114.5μm具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物称为玉米皮粉碎物c，将在粒径171.2μm具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物称为玉米皮粉碎物d，将在粒径256.0μm具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物称为玉米皮粉碎物e，将在粒径76.6μm具有相对颗粒量峰的玉米皮粉碎物称为玉米皮粉碎物f。将玉米皮粉碎物a～e的粒度分布示于图1中，将玉米皮粉碎物f的粒度分布示于图2中。
102.另外，玉米皮粉碎物d为与在国际公开第2018/159573号的比较例1中公开的平均粒径100μm的玉米皮粉碎物相同的粉碎物。
103.《实施例1》使用了玉米皮粉碎物c的分批培养
104.(预培养)
105.将里氏木霉(trichoderma reesei)pc-3-7株(atcc#66589)的孢予以成为1.0
×
107/ml的方式用生理盐水稀释，使该稀释孢子溶液1ml向表1所示的加入到500ml带挡板的烧瓶的100ml的预培养培养基进行接种，利用振荡培养机在28℃、120rpm的条件下进行了72小时培养。
106.表1
[0107][0108]
*5
×マンデルス
溶液为以下组成
[0109]
7g/l(nh4)2so4[0110]
10g/l kh2po4[0111]
2g/l cacl2·
2h2o
[0112]
1.5g/l mgso4·
7h2o
[0113]
**10
×
酒石酸铵溶液包含92g/l酒石酸铵
[0114]
***微量元素溶液为以下组成
[0115]
0.3g/l h3bo3[0116]
1.3g/l(nh4)6mo7o
24
·
4h2o
[0117]
5g/l fecl3·
6h2o
[0118]
2g/l cuso4·
5h2o
[0119]
0.4g/l mncl2·
4h2o
[0120]
10g/l zncl2[0121]
(正式培养)
[0122]
将在试验例1中制备的玉米皮粉碎物c以成为100g/l的方式，制备表2所示的组成的正式培养培养基，使用微摇瓶发酵器(bio-jr.8，株式会社
バイオット
制)，分别进行了深层培养研究。
[0123]
正式培养将里氏木霉(trichoderma reesei)pc-3-7株的预培养液10ml接种于正式培养培养基100ml而进行。
[0124]
培养条件是，在正式培养培养基中接种预培养液后，在28℃、900rpm、通气量100ml/min的培养条件下，一边控制为ph5一边进行了96小时深层培养。
[0125]
表2
[0126][0127]
﹡与表1相同。
[0128]
﹡﹡﹡与表1相同。
[0129]
(培养液的采集)
[0130]
在培养开始96小时后采集了1ml培养液。将培养液在15,000
×
g、4℃的条件下进行10分钟离心分离，获得了上清液。将该上清液用0.22μm的过滤器过滤，将所得的滤液作为蛋白质溶液和纤维素酶溶液，用于以下实验。
[0131]
(蛋白质浓度的测定)
[0132]
使用在参考例1中记载的方法，测定了培养开始第96小时的培养液中的纤维素酶的蛋白质浓度。其结果，培养液所包含的蛋白质浓度为9.6g/l。
[0133]
(β-葡糖苷酶活性的测定)
[0134]
在参考例2的条件下，作为在培养中途采集的培养液中的纤维素酶的活性，分别测定了β-葡糖苷酶的活性。关于活性，测定405nm的吸光度的增加，将每1分钟游离1μmol的基质的活性作为1u而算出。其结果，通过使用了玉米皮粉碎物c的培养而获得的培养液的活性为2.5u/ml。将结果示于表3中。
[0135]
＜比较例1＞使用了玉米皮粉碎物a、b、d、e的分批培养
[0136]
(蛋白质浓度的测定)
[0137]
使用了在试验例1中制备的玉米皮粉碎物a、b、e，除此以外，通过与实施例1同样的条件操作，进行了分批培养试验。对于使用了玉米皮粉碎物a或b的培养，培养时间为96小时，对于使用了玉米皮粉碎物d或e的培养试验，由于培养液中的蛋白质浓度低，因此将培养延长直到120小时。然后，使用在参考例1中记载的方法，在使用了玉米皮粉碎物a、b的培养中测定了培养开始第96小时的培养液中的纤维素酶的蛋白质浓度，在使用了玉米皮粉碎物
d、e的培养中，测定了培养开始第120小时的培养液中的纤维素酶的蛋白质浓度。其结果，使用包含玉米皮粉碎物a的培养基进行培养而获得的培养液所包含的蛋白质浓度为9.0g/l，使用包含玉米皮粉碎物b的培养基进行培养而获得的培养液所包含的蛋白质浓度为9.1g/l，使用包含玉米皮粉碎物d的培养基进行培养而获得的培养液所包含的蛋白质浓度为8.0g/l，使用包含玉米皮粉碎物e的培养基进行培养而获得的培养液所包含的蛋白质浓度为7.2g/l。将结果示于表3中。
[0138]
(β-葡糖苷酶活性的测定)
[0139]
在参考例2的条件下，作为在培养中途采集的培养液中的纤维素酶的活性，分别测定了β-葡糖苷酶的活性。关于活性，测定405nm的吸光度的增加，将每1分钟游离1μmol的基质的活性作为1u而算出。其结果，玉米皮粉碎物a的培养液中的活性为2.1u/ml，玉米皮粉碎物b的培养液中的活性为2.0u/ml，玉米皮粉碎物d的培养液中的活性为1.7u/ml，玉米皮粉碎物e中的活性为1.2u/ml。将结果示于表3中。
[0140]
表3
[0141][0142]
＜实施例2＞使用了玉米皮粉碎物c的分批培养与葡萄糖和乳糖的添加培养
[0143]
(预培养)
[0144]
将里氏木霉(trichoderma reesei)pc-3-7株(atcc#66589)的孢子以成为1.0
×
107/ml的方式用生理盐水稀释，使该稀释孢子溶液2.5ml向表1所示的加入了1l带有挡板的
烧瓶的250ml的预培养培养基进行接种，
[0145]
利用振荡培养机在28℃、120rpm的条件下进行了72小时培养。
[0146]
(正式培养)
[0147]
将在试验例1中制备的玉米皮粉碎物c以成为100g/l的方式使用，制备表2所示的组成的正式培养培养基，使用5l摇瓶发酵器(株式会社
バイオット
制)，进行了深层培养。
[0148]
将里氏木霉(trichoderma reesei)pc-3-7株的预培养液200ml接种于分别添加了玉米皮粉碎物c的正式培养培养基2l。预培养与试验例1同样地进行。正式培养的培养条件是，在正式培养培养基中接种预培养培养基后，在28℃、700rpm、通气量2l/min的培养条件下，一边控制为ph5.0一边进行了240小时的深层培养。
[0149]
(正式培养中途的葡萄糖和乳糖的添加)
[0150]
在正式培养开始第10小时，将表4所示的葡萄糖和乳糖的液糖培养基每1天向正式培养液继续添加各250ml直到培养开始第240小时。
[0151]
表4
[0152][0153]
(培养液的采集)
[0154]
从培养开始经时地在各时刻采集了20ml的培养液。采集的培养液的一部分在15,000
×
g、4℃的条件下进行10分钟离心分离，获得了上清液。将该上清液用0.22μm的过滤器过滤，将所得的滤液作为纤维素酶溶液，用于以下实验。
[0155]
(蛋白质浓度的测定)
[0156]
在参考例1的条件下测定从使用玉米皮粉碎物c进行了培养的培养液经时地采集的蛋白质浓度，求出本实施例2的最大蛋白质浓度相对于实施例1的分批培养中的蛋白质浓度的相对值，结果，蛋白质浓度提高了3.3倍。将结果示于表5中。
[0157]
＜实施例3＞使用了玉米皮粉碎物f的分批培养与葡萄糖和乳糖的添加培养
[0158]
使用了玉米皮粉碎物f，除此以外，通过与实施例1同样的条件操作而进行了分批培养试验。在培养试验后，通过与实施例1同样的方法而制备样品，在参考例1和2的条件下测定。其结果，对于使用了玉米皮粉碎物f的分批培养，培养开始第96小时的培养液中的纤维素酶的蛋白质浓度为9.4g/l，β-葡糖苷酶的活性为2.5u/ml。将结果示于表3中。
[0159]
使用了玉米皮粉碎物f，除此以外，通过与实施例2同样的条件操作而进行了葡萄糖和乳糖的添加培养试验。在培养试验后，通过与实施例2同样的方法而制备样品，在参考例1的条件下测定。求出葡萄糖和乳糖的添加培养的最大蛋白质浓度相对于分批培养中的蛋白质浓度的相对值，结果可知，蛋白质浓度提高了3.4倍。将结果示于表5中。
[0160]
＜比较例2＞使用了玉米皮粉碎物a、b、d的分批培养与葡萄糖和乳糖的添加培养
[0161]
使用了玉米皮粉碎物a、b、d，除此以外，通过与实施例2同样的条件操作而进行了培养试验。在培养试验后，通过与实施例2同样的方法而制备样品，在参考例1的条件下测
定，求出液糖添加培养时的最大蛋白质浓度相对于比较例1的分批培养中的蛋白质浓度的相对值。其结果，在使用了玉米皮粉碎物a或b的情况下都为2.6，使用了玉米皮粉碎物d的情况下为1.8。将结果示于表5中。
[0162]
表5
[0163][0164]
＜实施例4＞使用了保温处理培养液的固液分离
[0165]
(保温处理)
[0166]
在实施例2的条件下进行培养，在培养开始后第96小时去掉作为5l摇瓶发酵器的培养控制的ph控制和通气。从培养槽采集培养液的一部分，进行了固液分离处理。此外，剩下的培养液将培养槽的搅拌数设定为400rpm，将温度设定为40℃或50℃，进行了12小时的保温处理。
[0167]
(固液分离处理)
[0168]
在聚砜保持件kp-47s(株式会社
アドバンテック
制)放置由聚丙烯制形成的滤布(日立造船株式会社制)，在其中添加以成为10％(w/v)的方式添加了
“ラヂオライト”
#700(昭和化学工业株式会社制)的ro水后，进行减压而形成了预涂层。进而，在保温处理培养液20ml中添加添加
“ラヂオライト”
#7001g而充分混合了的溶液，减压而进行固液分离。
[0169]
(浊度测定)
[0170]
将固液分离而获得的滤液20ml使用便携用浊度计2100p型(hach社制)测定了浊度。其结果，在不进行保温处理的情况下，ntu为804，与此相对，在保温处理为40℃的条件下，ntu为303，在50℃的条件下ntu为90，通过保温处理而滤液的浊度显著变低，获得了更澄清的液体部分。
[0171]
＜总结＞
[0172]
由表3和表5所示的实施例和比较例的结果，在添加在通过采用激光衍射/散射法的测定方法而获得的体积基准的粒度分布中，在粒径70μm以上且150μm以下的范围具有相对颗粒量峰的本发明的玉米皮粉碎物而培养了木霉属丝状菌的情况下，与使用了其以外的粒径的玉米皮粉碎物的培养相比，培养液中的β-葡糖苷酶的活性、蛋白质浓度变高，蛋白质的生产性提高了。此外，对于在培养的中途添加了葡萄糖和乳糖的培养试验，在由添加葡萄糖、乳糖进行培养得到的培养液中的蛋白质浓度的提高效果也在使用了本发明的玉米皮粉碎物的情况下特别高地显示。