检测J-virus的特异引物对及其应用

检测j-virus的特异引物对及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及检测j-virus的特异引物对及其应用。


背景技术：

2.20世纪70年代，从澳大利亚昆士兰州捕获的野鼠中分离出来一种新的病毒，命名为j病毒(jun jeilongvirus，j-virus)。j-virus隶属单股反链病毒目副粘病毒科杰龙病毒属，为负链rna病毒，基因组大小约18954nt，基因组结构为3'-n-p/v/c-m-f-sh-tm-g-l-5'。在澳大利亚哺乳动物进行的血清学研究显示，野鼠、猪、牛和人都存在j-virus抗体。j-virus在哺乳动物的感染提示着其存在潜在人畜共患的潜力，尚不能排除其造成人际传播的可能性。现有技术中无法实现对j-virus的快速检测。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何快速检测j-virus，本发明研究设计针对j-virus的特异性引物对，开发基于j-virus核酸序列测定的特异性检测方法，为应对j-virus提供技术储备，可广泛应用于j-virus检测。
4.本发明首先提供一种检测或辅助检测j-virus的特异引物对，所述引物对是由f1和r1组成的引物对；
5.所述f1为如下a1)至a3)中的任一种单链dna：
6.a1)序列表中seq id no.1所示的单链dna；
7.a2)在a1)的5
′
端和/或3
′
端添加一个或几个核苷酸得到的单链dna；
8.a3)与a1)或a2)限定的单链dna具有85％以上的同一性的单链dna；
9.所述r1为如下b1)至b3)中的任一种单链dna：
10.b1)序列表中seq id no.2所示的单链dna；
11.b2)在b1)的5
′
端和/或3
′
端添加一个或几个核苷酸得到的单链dna；
12.b3)与b1)或b2)限定的单链dna具有85％以上的同一性的单链dna。
13.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
14.上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
15.上述引物对在制备检测或辅助检测j-virus产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。
16.本发明的第二个目的是提供一种用于检测或辅助检测j-virus的pcr试剂。
17.本发明提供的用于检测或辅助检测j-virus的pcr试剂包括上述引物对。
18.所述pcr试剂还包括进行pcr扩增所需的非引物试剂。
19.所述非引物试剂可为pcr反应缓冲液，和/或，dna聚合酶或含有dna聚合酶的溶液。
20.上述pcr试剂在制备检测或辅助检测j-virus产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。
21.本发明的第三个目的是提供用于检测或辅助检测j-virus的试剂盒。
22.所述试剂盒能用于检测或辅助检测j-virus。
23.本发明提供的用于检测或辅助检测j-virus的试剂盒包括上述引物对或上述pcr试剂。
24.上述试剂盒在制备检测或辅助检测j-virus产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。
25.本发明的第四个目的是提供上述引物对或上述pcr试剂或上述试剂盒的新用途。
26.本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测j-virus的方法。
27.本发明提供的检测或辅助检测j-virus的方法，包括如下步骤：用上述引物对对待测样本进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；检测所述pcr扩增产物，根据所述pcr扩增产物确定待测样本是否为j-virus阳性：pcr扩增产物是大小为199bp片段的待测样本或者pcr扩增产物序列如序列表序列3所示的待测样本为j-virus阳性。
28.本发明提供的高特异性的引物对和基于该引物对的j-virus检测方法，可实现j-virus的准确检测，操作简单，通量高，可同时进行批量样本检测，灵敏度高，特异性强的优点避免了误检漏检情况的发生，同时借助pcr和测序技术，也避免了传统病毒分离方法检测周期长，操作步骤繁琐，技术水平要求高和血清学方法检测灵敏度低，窗口期较长等状况。本发明旨在为j-virus的检测提供技术储备以应对未来感染人类甚至暴发或流行的可能。
附图说明
29.图1为检测j-virus的pcr方法灵敏度实验电泳结果图，其中m表示dl2000 dna marker(宝生物工程(大连)有限公司产品)；n为阴性对照；泳道1-6质粒浓度依次分别为1
×
106copies/μl、1
×
105copies/μl、1
×
104copies/μl、1
×
103copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
101copies/μl扩增结果。
30.图2为检测j-virus的pcr方法特异性实验电泳结果图，其中m表示dl2000 dna marker(宝生物工程(大连)有限公司产品)；n为阴性对照；泳道1-4分别为甲型流感病毒、肠道病毒ev71、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒扩增结果；泳道6-7分别为j-virus扩增结果。
31.图3为j-virus的特异性引物对及检测方法在j-virus阳性核酸样本中的应用实验电泳结果图，其中m表示dl2000 dna marker(宝生物工程(大连)有限公司产品)；n为阴性对照；泳道1-20均为j-virus扩增结果。
具体实施方式
32.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
33.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所
描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
35.下述实施例中甲型流感病毒(feng l,li z,zhao s,nair h,lai s,xu w,li m,wu j,ren l,liu w,yuan z,chen y,wang x,zhao z,zhang h,li f,ye x,li s,feikin d,yu h,yang w.viral etiologies of hospitalized acute lower respiratory infection patients in china,2009-2013.plos one.2014jun 19；9(6):e99419.doi:10.1371/journal.pone.0099419.ecollection 2014.)、肠道病毒ev71(zhang x,wang h,ding s,wang x,chen x,wo y,wang l,huang d,liu w,cao w.prevalence of enteroviruses in children with and without hand,foot,and mouth disease in china.bmc infect dis.2013dec 27；13:606.doi:10.1186/1471-2334-13-606.)、汉坦病毒(zuo sq,li xj,wang zq,jiang jf,fang lq,zhang wh,zhang js,zhao qm,cao wc.
‘
genetic diversity and the spatio-temporal analyses of hantaviruses in shandong province,china.front microbiol.2018nov 20；9:2771.doi:10.3389/fmicb.2018.02771.ecollection 2018.)、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(liu w,lu qb,cui n,li h,wang ly,liu k,yang zd,wang bj,wang hy,zhang yy,zhuang l,hu cy,yuan c,fan xj,wang z,zhang l,zhang xa,walker dh,cao wc.case-fatality ratio and effectiveness of ribavirin therapy among hospitalized patients in china who had severe fever with thrombocytopenia syndrome.clin infect dis.2013nov；57(9):1292-9.doi:10.1093/cid/cit530.epub 2013aug 20.)和j-virus阳性核酸样本，上述均来自军事医学科学院微生物流行病研究所。
36.实施例1、j-virus检测方法
37.根据j-virus的基因序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，并将拟定的特异性引物对在genbank数据库中进行blast比对，确定引物的特异性。最后选定的引物如序列表中序列1和序列2所示，引物对应的目的片段的dna序列为序列表中序列3：
38.正向引物f1：5
′‑
aaaacttaggagtgaatgagcgtc-3
′
(序列表中序列1)；
39.反向引物r1：5
′‑
tggtaaataagctcaacagtccag-3
′
(序列表中序列2)。
40.待检样品为j-virus阳性核酸样本，来自军事医学科学院微生物流行病研究所。
41.提取待检样品的rna，即模板rna，可以利用现有技术中已知的方法或试剂盒提取。
42.进行pcr扩增，反应体系如下：12.5μl pcr反应缓冲液，1μl酶混合液，7.5μl纯水，1μl上游引物(序列如序列表中序列1所示)，1μl下游引物(序列如序列表中序列2所示)，2μl rna模板；
43.扩增程序为：50℃反转录30分钟；94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，每个循环降低0.5℃，共13个循环；然后按照下列参数进行37次循环：94℃变性30秒，51℃复性30秒，72℃延伸1分钟；循环反应结束后在72℃保持5分钟。回收扩增产物判断是否为j-virus阳性，判断标准为：能扩增出大小199bp左右的条带并且扩增产物的序列如序列表的序列3
44.(aaaacttaggagtgaatgagcgtctccttcgcttgatgaactctactccacatagactgaatgaatc
ccgttgccatgtcgaatttctacgggatcaaccaggccgatcacctccgagagaagggagaccaaccagagaagggcccatccgtcctgacatacgtctctttgattactggactgttgagcttatttacca)所示的待测样本为j-virus阳性，否则为阴性。
45.序列3：
46.实施例2、方法敏感性测试
47.1、材料
48.采用实施例1的j-virus检测方法检出的j-virus的阳性rna样本，将阳性扩增产物插入peasy_t1载体(北京全式金生物技术有限公司)的多克隆位点，得到peasy_t-j-virus质粒。
49.2、方法
50.使用分光光度计测定peasy_t-j-virus质粒浓度后对其进行倍比稀释，设置6个梯度(1
×
106copies/μl～1
×
101copies/μl)，并以本发明提供的特异性引物对(以序列表中序列1所示的核苷酸片段和序列表中序列2所示的核苷酸片段组成)进行pcr扩增。检测pcr扩增最低检测浓度，以验证方法的灵敏度。
51.3、结果
52.结果如图1所示，显示pcr扩增最低检测浓度为1
×
103copies/μl，说明该方法具有高灵敏性。
53.实施例3、方法特异性测试
54.1、材料
55.采用实施例1提供的j-virus检测方法检测常见病毒样本包括甲型流感病毒、肠道病毒ev71、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒和j-virus的rna。样本均来自军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所。
56.2、方法
57.采用本发明实施例1的j-virus检测方法对常见病毒的核酸阳性样本进行检测，以验证方法的特异性。
58.3、结果
59.结果见图2，显示甲型流感病毒、肠道病毒ev71、汉坦病毒、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒四种常见病毒核酸样本检测结果均为阴性，说明该方法对上述病毒无交叉反应，检测体系具有良好的特异性。
60.实施例4、j-virus的特异性引物对及检测方法在j-virus阳性核酸样本中的应用
61.1、材料
62.采用实施例1提供的j-virus特异性引物对及检测方法分别对6份经实验室确认为j-virus阳性的核酸样本进行检测，样本来自军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所。
63.2、方法
64.采用本发明所述的j-virus特异性引物对及检测方法对6份经实验室确认为j-virus阳性的核酸样本进行pcr扩增，并利用基因测序技术对扩增样本进行序列分析比对，以实现j-virus的检测。
65.4、结果
66.结果见图3，6份j-virus阳性的核酸样本中，本发明所述的j-virus特异性引物对及检测方法可检出阳性样本6份，检出率达到100％。
67.综上所述，本发明提供的高特异性的引物对和基于该引物对的j-virus检测方法，可实现j-virus的准确检测，操作简单，通量高，可同时进行批量样本检测，灵敏度高，特异性强的优点避免了误检漏检情况的发生，同时借助pcr和测序技术，也避免了传统病毒分离方法检测周期长，操作步骤繁琐，技术水平要求高和血清学方法检测灵敏度低，窗口期较长等状况。
68.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。