3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-氨基酸及其制备、抗血栓活性和应用

3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-氨基酸及其制备、抗血栓活性和应用
技术领域
1.本发明涉及一种3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-氨基酸及其制备方法，还涉及它们在制备抗血栓药物中的应用。本发明属于生物医药领域。


背景技术：

2.在正常情况下，p-选择素存在于内皮细胞的weibel-pallade内或血小板的α-颗粒中不表达，在遇到外界刺激时，可以通过胞吐和膜融合的方式迅速存在于活化的内皮细胞及血小板表面。p-选择素与白细胞的长时间异常相互作用会导致血栓的形成。
3.p-选择素与其受体psgl-1的较长或异常相互作用可导致炎性细胞的募集增加和血栓形成倾向。在许多人类疾病中观察到可溶性p-选择素和血小板-白细胞复合物水平增加。以可溶性p-选择素作为血栓的标志物来判断血栓的发生与否可能是当前存在的最具有前景的生物标志物。
4.在深静脉血栓的治疗过程中，使用华法林治疗时会导致较高的血栓形成后综合征(包括腿痛，沉重，肿胀，毛细血管扩张和色素沉着过多)的发病率；华法林也会导致颅内出血的并发症，且具有较高的发病率和死亡率。并且华法林给药时需要进行监测，根据血液指标调整剂量具有更高的医疗成本，且浪费患者的时间。相比较华法林而言，p-选择素机制的优势在于具有较小的副作用，并且个体差异小，无需监测，可统一剂量给药。
5.发明人假设，在β-咔啉存在的前提下，引入氨基酸，增强其水溶性，有助于口服。202-e,202-y,202-dy和202-ey这类新型的β-咔啉衍生物(202-d)的三环骨架结构可以与p-选择素结合，从而靶向p-选择素，并且同时具有抗动脉血栓和抗静脉血栓的活性。根据这个假设，发明人提出了本发明。


技术实现要素：

6.本发明的第一个内容是提供下面结构的3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-氨基酸，其中通式i代表的aa为glu、tyr,asp-tyr或glu-tyr，分别命名为化合物202-e、202-y、202-dy和202-ey。
[0007][0008]
本发明的第二个内容是提供3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-氨基酸的合成方法，该方法包括：(1)在1m h2so4催化下l-trp和甲醛发生pictet-spengler缩合，制得3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；
[0009]
(2)以甲醇为溶剂，二氯亚砜催化下将三位上的羧基引入甲酯保护，得到3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
[0010]
(3)以无水四氢呋喃为溶剂，四氢铝锂条件下将3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯三位的甲酯还原为醇羟基，得到3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-伯醇，即为202；
[0011]
(4)以四氢呋喃为溶剂，nmm，(boc)2o条件下对3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-伯醇二位的nh引入boc保护，得到boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-伯醇；
[0012]
(5)以无水四氢呋喃为溶剂，dcc，dmap条件下，boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-伯醇与boc-glu(obzl)-oh发生分子间缩合，得到boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-obzl；
[0013]
(6)将得到的boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-obzl产物溶于甲醇，在pd/c，h2条件下脱去obzl保护，得到boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-oh；
[0014]
(7)将boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-oh在4n ea/hcl条件下脱去boc保护，得到目标化合物202-e；
[0015]
(8)以无水四氢呋喃为溶剂，dcc，dmap条件下，boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-伯醇与boc-tyr-oh发生分子间缩合，得到boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)y；
[0016]
(9)将boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)y在4n ea/hcl条件下脱去boc保护，得到目标化合物202-y；
[0017]
(10)以无水四氢呋喃为溶剂，dcc，dmap条件下，boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-伯醇与boc-asp(obzl)-oh发生分子间缩合，得到boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)d-obzl；
[0018]
(11)将boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)d-obzl在4n ea/hcl条件下脱去boc保护，得到目标化合物3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d(obzl)-nh2；
[0019]
(12)以无水四氢呋喃为溶剂，dcc，hobt条件下，3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d(obzl)-nh2与boc-tyr-oh发生分子间缩合，得到3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d(obzl)-boc-y；
[0020]
(13)将得到的3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d(obzl)-boc-y产物溶于甲醇，在pd/c，h2条件下脱去obzl保护，得到3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d-boc-y；(14)将3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d-boc-y在4n ea/hcl条件下脱去boc保护，得到目标化合物202-dy；
[0021]
(15)将boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-obzl在4n ea/hcl条件下脱去boc保护，得到目标化合物3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e(obzl)-nh2；
[0022]
(16)以无水四氢呋喃为溶剂，dcc，hobt条件下，3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e(obzl)-nh2与boc-tyr-oh发生分子间缩合，得到3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e(obzl)-boc-y；
[0023]
(17)将得到的3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e(obzl)-boc-y产物溶于甲醇，在pd/c，h2条件下脱去obzl保护，得到3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e-boc-y；
[0024]
(18)将3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e-boc-y在4n ea/hcl条件下脱去boc保护，得到目标化合物202-ey。
[0025]
本发明的第三个内容是评价所述3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-氨基酸在制备抗动脉血栓药物中的作用。
[0026]
本发明的第四个内容是评价所述3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-氨基酸在制
备抗深静脉血栓药物中的作用。
[0027]
本发明的第五个内容是评价所述3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-氨基酸下调p-选择素的作用。
附图说明
[0028]
图1. 202-e的合成路线。
[0029]
图2. 202-y的合成路线。
[0030]
图3. 202-dy的合成路线。
[0031]
图4. 202-ey的合成路线。
具体实施方式
[0032]
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0033]
实施例1制备3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸
[0034]
在冰浴下向400ml水中缓慢加入0.2ml浓硫酸向得到的稀硫酸溶液中加入5.00g(24.5mmol)l-色氨酸，使其完全溶解后缓慢加入10ml浓度为37-40％的甲醛溶液。反应混合物室温搅拌4-5小时，后用浓氨水调ph至7过滤并用甲醇洗，得到5.15g(产率99％)滤饼即为3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸。esi/ms：217[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ10.95(s,1h),δ7.47(q,j＝8.5hz,2h),7.07(m,2h),5.42(s,1h),4.42(d,j＝15.8hz,1h),4.25(m,1h),3.63(m,1h),3.14(m,1h),2.85(m,1h).
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ169.58,136.31,136.19,129.03,121.40,119.35,117.69,111.09,109.79,56.47,22.85。
[0035]
实施例2制备3s-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯
[0036]
在冰浴下向40ml甲醇中加入3ml socl2，并通过恒压漏斗滴入瓶中，在漏斗上方架上干燥管，活化。活化完成后，撤下恒压漏斗，称取3.00g(15mmol)3s-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸加入瓶中，加干燥管。撤去冰浴，常温搅拌下反应48小时，tlc(二氯甲烷：甲醇20:1)监测反应完成。后用水泵抽干甲醇，并依次用乙酸乙酯，石油醚抽干。用乙酸乙酯复溶，加入适量饱和碳酸氢钠溶液冰浴下搅拌除盐，后置于分液漏斗中静置分层，依次用依次用饱和nahco3,饱和nacl洗涤，酯层用无水na2so4干燥后过滤旋干。用二氯甲烷，甲醇体系进行硅胶柱层析纯化，得到白色固体化合物1.7g，产率54％。esi/ms：231.1[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ10.73(s,1h),7.37(m,1h),7.28(m,1h),6.99(m,2h),3.97(m,2h),3.74(dd,j＝8.8,4.8hz,1h),3.68(s,3h),2.95(m,1h),2.75(m,2h).
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ173.55,135.67,133.38,126.85,120.35,118.20,117.12,110.77,105.42,55.13,51.54,41.33,24.91。
[0037]
实施例3制备3s-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-伯醇
[0038]
在冰浴条件下，将0.7g(17mmol)lialh4缓慢加入无水thf中，称取1.0g(4.3mmol)3s-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯在冰浴下缓慢加入该反应液中，茄瓶上加干燥管，冰浴搅拌5h。薄层层析(二氯甲烷：甲醇＝10：1)监测反应结束后进行淬灭反应:依次逐滴加入h2o、4n naoh溶液、h2o，加入水时溶液中有气体产生。加毕继续搅拌40分钟。减压过滤除去滤渣，旋干滤液得黄色固体。经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷甲醇体系)得0.63g白色固体，即为
3s-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-伯醇，202，产率72％。m.p.:175.7-179.4℃；-67.88；esi/ms：203[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ10.66(s,1h),7.34(m,1h),7.26(m,1h),6.96(m,2h),4.70(s,1h),3.92(s,2h),3.51(m,2h),2.88(m,1h),2.63(dd,j＝14.9,4.1hz,1h),2.29(m 1h).
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ135.75,133.97,127.12,120.07,118.03,117.02,110.70,106.58,65.01,55.41,42.31,24.41。
[0039]
实施例4制备boc-3s-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-伯醇
[0040]
取1g(4.95mmol)3s-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-伯醇，溶于无水thf，加入1.4g(6.44mmol)(boc)2o，调ph至9，茄瓶上置单通室温下反应，开始2小时频繁减压抽气，后监测ph使其维持在9。经tlc(二氯甲烷：甲醇30:1)监测反应完全后，旋干反应液，乙酸乙酯复溶，依次用5％khso4，饱和nacl洗，酯层用无水na2so4干燥，过滤旋干。经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷甲醇体系)得1.34g标题化合物，为白色固体，产率90％。esi/ms：303[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso)δ10.81(s,1h),7.38(d,j＝7.7hz,1h),7.29(d,j＝7.7hz,1h),6.99(m,2h),4.82(m,2h),4.61(s,1h),4.53(s,1h),4.16(m,1h),3.34(m,1h),2.76(s,2h),1.45(s,9h).
13
c nmr(75mhz,dmso)δ155.04,154.35,136.02,129.99,126.84,120.64,118.26,117.43,110.86,104.45,78.95,59.89,51.82,50.29,37.86,28.04,26.27,22.46,21.02,20.62。
[0041]
实施例5制备boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-obzl
[0042]
取0.80g(2.38mmol)boc-glu(obzl)-oh溶于无水thf，加入0.49g(2.38mmol)dcc，24mg(0.20mmol)dmap，冰浴下活化40min，待dcu析出，反应液呈白色混悬液后加入0.60g(1.99mmol)boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲醇，撤去冰浴室温反应过夜，经tlc(二氯甲烷：甲醇30:1)监测反应完全后终止反应。反应液过滤旋干，用适量乙酸乙酯复溶，依次用饱和nahco3,饱和nacl，5％khso4，饱和nacl,饱和nahco3,饱和nacl各洗三遍，分液除去水层。酯层经无水na2so4干燥2h后过滤旋干。经硅胶柱层析纯化(石油醚乙酸乙酯体系)得0.95g标题化合物，产率为77％的白色固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ10.88(s,1h),7.34(m,8h),7.06(m,1h),6.95(m,1h),5.09(s,2h),4.85(d,j＝18.2hz,2h),4.12(m,4h),2.86(m,1h),2.75(d,j＝15.9hz,1h),2.38(m,2h),1.98(m,1h),1.77(m,1h),1.40(s,s,j＝16.1hz,18h)。
[0043]
实施例6制备boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-oh
[0044]
取0.95g(1.52mmol)boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-obzl溶于适量甲醇后迅速加入0.14g pd/c，茄瓶上方加三通，将瓶中空气与氢气袋中的氢气进行置换，并于室温下反应6h，经tlc(二氯甲烷：甲醇20:1)监测原料点消失，终止反应，反应液过滤旋干，过滤出的废弃pd/c置于水中保存。旋干后得淡黄色固体标题化合物0.76g，产率98％。
[0045]
实施例7制备202-e
[0046]
取1.00g(1.88mmol)boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-oh用20ml 4nea/hcl在冰浴下溶解，茄瓶上方加干燥管，在冰浴下反应7h后经tlc监测(乙酸乙酯：水：冰醋酸3:1:1)原料点消失。用水泵将反应液抽干，后依次用10ml乙酸乙酯，乙醚复溶三次，分别抽干。得黄色粉末。用反相c
18
柱进行纯化(甲醇，超纯水体系)，纯化后旋干甲醇，将剩余的水冻干后得到白色固体标题化合物0.58g，产率93％。m.p.:165.5-167.1℃； 13.39(c＝0.10,ch3oh)；esi/ms：332[m h]

；1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ12.28(s,1h),11.16(s,
1h),10.34(s,1h),10.24(s,1h),8.93(s,3h),7.40(d,j＝7.8hz,1h),7.35(s,1h),7.09(ddd,j＝8.1,7.0,1.2hz,1h),7.00(ddd,j＝8.1,7.0,1.0hz,1h),4.71(dd,j＝11.9,3.5hz,1h),4.44(dd,j＝11.9,5.8hz,2h),4.33(d,j＝15.5hz,1h),4.14(m,1h),3.14(s,1h),2.99(m,2h),2.48(m,1h),2.12(m,1h),1.68(d,j＝13.4hz,1h),1.16(m,1h).
13
c nmr(126mhz,dmso-d6)δ173.14,167.78,136.20,126.03,125.80,121.52,118.85,117.63,111.30,104.74,64.12,59.65,52.14,47.40,33.23,24.32,20.52。
[0047]
实施例8制备boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)y
[0048]
取0.67g(2.38mmol)boc-tyr-oh溶于无水thf，加入0.49g(2.39mmol)dcc，24mg(0.19mmol)dmap，冰浴下活化40min，待dcu析出，反应液呈白色混悬液后加入0.60g(1.99mmol)boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲醇，撤去冰浴室温反应过夜，经tlc(二氯甲烷：甲醇30:1)监测反应完全后终止反应。反应液过滤旋干，用适量乙酸乙酯复溶，依次用饱和nahco3,饱和nacl,5％khso4，饱和nacl,饱和nahco3,饱和nacl各洗三遍，分液除去水层。酯层经无水na2so4干燥2h后过滤旋干。经硅胶柱层析纯化(石油醚乙酸乙酯体系)得白色固体标题化合物0.82g，产率为73％。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ10.81(s,j＝10.0hz,1h),7.30(m,4h),7.03(m,3h),4.82(m,2h),4.60(s,1h),4.52(s,1h),4.19(m,1h),4.03(m,1h),3.04(s,1h),2.75(s,3h),1.45(s,s,18h)。
[0049]
实施例9制备202-y
[0050]
取1.50g(2.65mmol)boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)y用30ml 4n ea/hcl溶解，茄瓶上方加干燥管，在冰浴下反应至原料点消失。用水泵将反应液抽干，后依次用乙酸乙酯，乙醚各复溶三次，分别抽干。用反相c
18
柱进行纯化(甲醇，水体系)，纯化后旋干甲醇，将剩余的水冻干后得到白色固体标题化合物0.66g，产率68％。m.p.:173.7-174.5℃； 25.75(c＝0.10,ch3oh)；esi/ms：365[esi]-；1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ10.44(s,1h),10.19(s,1h),7.39(m,3h),7.09(m,2h),6.98(m,1h),6.75(m,1h),4.68(m,0h),4.34(m,1h),4.23(m,1h),3.27(m,1h),3.15(s,1h),3.08(m,1h),2.95(d,j＝13.7hz,1h),2.85(m,1h),1.89(s,1h),1.69(m,1h).
13
c nmr(126mhz,dmso-d6)δ136.19,130.77,130.44,130.38,126.04,125.80,121.52,121.44,121.29,118.87,115.39,111.29,111.25,60.64,53.62,52.03,40.17,39.99,33.24。
[0051]
实施例10制备boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)d-obzl
[0052]
取0.77g(2.38mmol)boc-asp(obzl)-oh溶于无水thf，加入0.49g(2.39mmol)dcc，24mg(0.19mmol)dmap，冰浴下活化40min，待dcu析出，反应液呈白色混悬液后加入0.60g(1.99mmol)boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲醇，撤去冰浴室温反应过夜，经tlc(二氯甲烷：甲醇30:1)监测反应完全后终止反应。反应液过滤旋干，用适量乙酸乙酯复溶，依次用饱和nahco3,饱和nacl,5％khso4，饱和nacl,饱和nahco3,饱和nacl各洗三遍，分液除去水层。酯层经无水na2so4干燥2h后过滤旋干。经硅胶柱层析纯化(石油醚乙酸乙酯体系)得0.86g标题化合物，产率为71％，为白色固体。esi/ms：608[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ10.87(s,1h),7.36(m,4h),7.33(m,4h),7.05(m,1h),6.96(m,1h),5.10(d,j＝2.7hz,2h),4.85(m,3h),4.41(s,1h),4.10(m,2h),2.82(m,1h),2.72(m,3h),1.40(d,j＝13.5hz,18h).
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ170.82,169.63,155.09,136.05,135.78,128.31,127.97,127.84,126.57,120.85,118.39,117.45,110.95,79.50,78.41,65.82,63.26,49.99,35.55,28.04,
27.91。
[0053]
实施例11制备3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d(obzl)-nh2[0054]
取0.55g(0.91mmol)boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)d-obzl用10ml 4nea/hcl溶解，茄瓶上方加干燥管，在冰浴下反应6h，经tlc监测原料点消失。用水泵将反应液抽干，后依次用乙酸乙酯，石油醚各复溶三次，抽干后得到0.39g，产率为90％的标题化合物，为白色粉末。
[0055]
实施例12制备3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d(obzl)-boc-y
[0056]
取0.52g(1.84mmol)boc-tyr-oh溶于无水thf，加入0.45g(2.21mmol)dcc，0.25g(1.84mmol)hobt，冰浴下活化40min，待dcu析出，反应液呈白色混悬液后加入0.75g(2.21mmol)3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d(obzl)-nh2，并用nmm调ph至9，撤去冰浴室温反应过夜，经tlc(二氯甲烷：甲醇30:1)监测反应完全后终止反应。反应液过滤旋干，用适量乙酸乙酯复溶，依次用饱和nahco3,饱和nacl，5％khso4，饱和nacl,饱和nahco3,饱和nacl各洗三遍，分液除去水层。酯层经无水na2so4干燥2h后过滤旋干。经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷甲醇体系)得0.18g，产率为15％的标题化合物，为白色固体。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ9.17(d,j＝6.5hz,1h),7.64
–
7.50(m,0h),7.35(q,j＝8.0,6.2hz,6h),7.04(d,j＝7.6hz,4h),6.87(s,1h),6.74
–
6.58(m,2h),5.76(s,1h),5.15
–
5.04(m,2h),4.74(s,1h),4.10(s,3h),3.95(s,1h),2.82(s,6h),1.48(d,j＝12.4hz,1h),1.40
–
1.17(m,12h)。
[0057]
实施例13制备3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d-boc-y
[0058]
取0.18g(0.27mmol)3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d(obzl)-boc-y溶于适量甲醇后迅速加入40mg pd/c，茄瓶上方加三通，将瓶中空气与氢气袋中的氢气进行置换，并于室温下反应6h，经tlc(二氯甲烷：甲醇10:1)监测原料点消失，终止反应，反应液过滤旋干，过滤出的废弃pd/c置于水中保存。旋干后得淡黄色固体标题化合物0.14g，产率87％。
[0059]
实施例14制备202-dy
[0060]
取0.14g(0.23mmol)3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-d-boc-y用3ml 4n ea/hcl溶解，茄瓶上方加干燥管，在冰浴下反应6h，经tlc监测原料点消失。用水泵将反应液抽干，后依次用乙酸乙酯，石油醚各复溶三次，抽干后得到0.1g，产率为77％的标题化合物，为白色粉末。m.p.:161.9-165.2℃； 31.24；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ9.40(s,1h),8.85(s,1h),8.23(s,2h),8.10(s,1h),7.34(s,1h),7.13(ddd,j＝19.7,12.3,8.0hz,3h),6.96(s,1h),6.84
–
6.59(m,3h),4.69(s,1h),4.03(q,j＝7.2hz,1h),3.04(s,1h),2.75(d,j＝14.3hz,3h),1.99(s,1h),1.91(s,1h),1.17(t,j＝7.1hz,1h)。
[0061]
实施例15制备3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e(obzl)-nh2[0062]
取1.00g(1.61mmol)boc-3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-(boc)e-obzl用25ml 4nea/hcl溶解，茄瓶上方加干燥管，在冰浴下反应6h，经tlc监测原料点消失。用水泵将反应液抽干，后依次用乙酸乙酯，石油醚各复溶三次，抽干后得到0.73g标题化合物，产率为91％的，为白色粉末。
[0063]
实施例16制备3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e(obzl)-boc-y
[0064]
取0.73g(2.58mmol)boc-tyr-oh溶于无水thf，加入0.43g(2.07mmol)dcc，0.23g(1.73mmol)hobt，冰浴下活化40min，待dcu析出，反应液呈白色混悬液后加入0.73g(1.73mmol)3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e(obzl)-nh2，并用nmm调ph至9，撤去冰浴室
温反应过夜，经tlc(二氯甲烷：甲醇30:1)监测反应完全后终止反应。反应液过滤旋干，用适量乙酸乙酯复溶，依次用饱和nahco3,饱和nacl，5％khso4，饱和nacl,饱和nahco3,饱和nacl各洗三遍，分液除去水层。酯层经无水na2so4干燥2h后过滤旋干。经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷甲醇体系)得0.20g标题化合物，产率为17％，为白色固体。esi/ms：684.3[m h]

；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ11.63(s,1h),9.15(s,1h),8.38(d,j＝7.8hz,1h),7.64
–
7.50(m,2h),7.43
–
7.31(m,6h),7.21(t,j＝7.6hz,0h),7.04(d,j＝8.0hz,2h),6.90(d,j＝8.7hz,1h),6.62(d,j＝8.2hz,3h),5.76(s,0h),5.09(s,2h),4.40(s,1h),4.14(dd,j＝21.7,5.7hz,1h),4.14(s,4h),4.00(d,j＝7.3hz,1h),3.26
–
3.02(m,2h),2.88(dd,j＝28.7,11.6hz,2h),2.63(t,j＝11.9hz,1h),2.45(d,j＝7.5hz,1h),2.11(dd,j＝19.4,12.1hz,1h),1.95
–
1.86(m,1h),1.51(s,1h),1.37(s,0h),1.28(s,8h)。
[0065]
实施例17制备3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e-boc-y
[0066]
取0.20g(0.29mmol)3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e(obzl)-boc-y溶于适量甲醇后迅速加入40mg pd/c，茄瓶上方加三通，将瓶中空气与氢气袋中的氢气进行置换，并于室温下反应6h，经tlc(二氯甲烷：甲醇10:1)监测原料点消失，终止反应，反应液过滤旋干，过滤出的废弃pd/c置于水中保存。旋干后得淡黄色固体标题化合物0.16g，产率92％。
[0067]
实施例18制备202-ey
[0068]
取0.16g(0.27mmol)3s-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲基-e-boc-y用4ml 4n ea/hcl溶解，茄瓶上方加干燥管，在冰浴下反应6h，经tlc监测原料点消失。用水泵将反应液抽干，后依次用乙酸乙酯，石油醚各复溶三次，抽干后得到0.1g标题化合物，产率为75％，为白色粉末。m.p.:177.0-180.1℃； 57.58；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ11.64(s,1h),9.38(s,1h),9.06(d,j＝7.7hz,1h),8.16(s,3h),7.65(s,1h),7.54(t,j＝10.1hz,1h),7.39(d,j＝8.4hz,1h),7.22(t,j＝7.7hz,1h),7.13(s,2h),7.10
–
6.98(m,2h),6.95(s,0h),6.69(d,j＝8.5hz,2h),4.43(s,1h),4.28
–
4.10(m,1h),4.10
–
3.96(m,1h),4.01(s,2h),3.18
–
2.74(m,3h),2.36(t,j＝7.6hz,2h),1.99(s,1h),1.94(s,2h),1.91(s,1h),1.27
–
1.08(m,1h)。
[0069]
实施例19抗动脉血栓作用评价
[0070]
实验材料
[0071]
乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
[0072]
实验动物
[0073]
sd品系大鼠，雄性，200
±
20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0074]
旁路插管
[0075]
旁路插管通路由三段组成，长10.0cm，内径1.0mm，外径2.0mm的尖端斜口聚乙烯管分别位于旁路插管的两端；用3.5mm，长8.0cm的聚乙烯管连接两侧管；将丝线打磨至表面毛糙，并定长至6.0cm，使其重4.0
±
0.1mg。
[0076]
三段聚乙烯管均用1％的硅醚溶液硅烷化，将其完全晾干，后将丝线沿颈动脉插管方向置于中部的聚乙烯管中，用para膜将三段聚乙烯管组装固定。
[0077]
大鼠分组及给药剂量
[0078]
本发明的化合物202,202-e,202-y,202-dy和202-ey剂量为5μmol/kg，阳性对照阿
司匹林剂量为167μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
[0079]
试剂配制麻醉剂为生理盐水配制的20％的乌拉坦溶液，抗凝剂为生理盐水配制的42mg/100ml的肝素钠溶液。
[0080]
实验操作
[0081]
按0.3ml/100g的剂量对大鼠进行灌胃给药，灌胃给药采用序贯法。给药30min后腹腔注射20％(0.7ml/100g)的乌拉坦溶液麻醉。剪开大鼠的颈部皮肤，分离左颈外静脉和右颈总动脉，用手术线结扎两侧血管的远心端，用眼科剪在左颈外静脉剪一小口，将上述旁路插管的静脉端插入左颈外静脉开口处并用手术线将其固定，通过旁路插管按0.1ml/100g的剂量打入肝素钠的生理盐水溶液(42mg/100ml)。用动脉夹夹紧右颈总动脉的近心端，在动脉上剪一个小口，将旁路插管的另一侧插入右颈总动脉并用手术线将其固定，松开动脉夹，体外循环旁路开启。
[0082]
体外循环15min后先剪断静脉端的插管观察血液循环是否通畅，从静脉端取血5ml，置于10％的枸橼酸钠生理盐水溶液(3.8％)中，用于血液相关指标的测定。并从旁路插管的动脉端口取出血栓线，用同样的手法在滤纸上蘸去血栓线上的浮血后称重，得到的栓重用来表示抗动脉血栓的活性。数据采用t检验进行统计。
[0083]
实验结果
[0084]
数据列入表1。结果表明，口服5μmol/kg的202-e和202-y能有效地抑制动脉血栓形成，且活性与阿司匹林相当，p＞0.05。该有效剂量比阿司匹林的有效剂量(167μmol/kg)低33倍；口服5μmol/kg的202-dy和202-ey活性要显著优于口服167μmol/kg的阿司匹林，p＜0.01。获得了意想不到的技术效果。
[0085]
表1化合物对大鼠动脉血栓的影响
[0086][0087][0088]
注：n＝8。a：与ns相比，p＜0.01且与asp相比，p＞0.05；b：与asp相比，p＜0.01实施例20抗深静脉血栓作用评价
[0089]
实验材料
[0090]
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，cas：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、华法林钠(cas：129-06-6，百灵威科技有限公司)。
[0091]
实验动物
[0092]
sd品系大鼠，雄性，230
±
20g，购自北京华阜康实验动物技术有限公司。
[0093]
实验方法
[0094]
实验采用大鼠下腔静脉结扎模型。
[0095]
分组及给药剂量：
[0096]
本发明的化合物202,202-e,202-y,202-dy和202-ey剂量为5μmol/kg，阳性对照华法林的剂量为4.87μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
[0097]
试剂配制
[0098]
麻醉剂为生理盐水配制的20％的乌拉坦溶液。
[0099]
实验操作
[0100]
大鼠在手术前静息一天适应环境且需提前一晚禁食，对大鼠进行灌胃给药(0.3ml/100g)，灌胃给药采用序贯法。给药30min后用20％乌拉坦溶液进行腹腔注射给药麻醉(0.7ml/100g)。将大鼠腹部消毒，然后沿腹白线在胸廓下方2cm处打开腹腔，开口上方可看到肝脏一角，开口长度约为2cm。用镊子小心移出腹腔内的小肠，大肠等器官置于生理盐水浸润的纱布上。钝性分离周围结缔组织和血管，暴露出下腔深静脉，在肾静脉下方用镊子小心将腹主动脉和下腔静脉分开，然后用在生理盐水中浸泡1小时以上的缝合线在下腔深静脉与左肾静脉交汇处结扎下腔深静脉，将小肠，大肠等器官移回腹腔后用缝合线缝合腹腔。
[0101]
术后将大鼠置于温暖的环境中循环4小时，先从颈动脉取血5ml，置于10％的枸橼酸钠生理盐水溶液(3.8％)中，用于血液相关指标的测定。后用剪刀剪开腹腔，用两个止血钳分别加紧深静脉上下两端的各血管，从深静脉的下方用镊子将其提起并从下至上剪开直至下腔深静脉的结扎处，以避免血栓回流入血，后将血栓取出，称重。得到的栓重用来表示抗深静脉血栓的活性。数据采用t检验进行统计。
[0102]
实验结果
[0103]
实验数据见表2。结果表明，口服5μmol/kg的202-e和202-y能有效地抑制深静脉血栓形成，且活性与华法林相当，p＞0.05；口服5μmol/kg的202-dy和202-ey活性要显著优于口服4.87μmol/kg的华法林，p＜0.01。获得了意想不到的技术效果。表2化合物对大鼠深静脉血栓的影响。
[0104][0105]
注：n＝8。a：与ns相比，p＜0.01且与warfarin相比，p＞0.05；b：与warfarin相比，p
＜0.01。
[0106]
实施例21评价化合物降低受试动物体内可溶性p-选择素含量的作用
[0107]
实验材料
[0108]
柠檬酸钠(cas：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、ns(石家庄四药有限公司)、蒸馏水。
[0109]
实验样本
[0110]
实施例19，20的大鼠颈动脉血。
[0111]
实验方法
[0112]
采用大鼠可溶性p-选择素酶联免疫分析试剂盒来进行检测。
[0113]
样品采集
[0114]
采集实施例19，20中5μmol/kg 202,202-e,202-y,202-dy和202-ey治疗的大鼠颈动脉取血，用3.8％柠檬酸钠溶液为抗凝剂，30min内于4℃3000rpm离心30min，取上清液作为样品进行检测。
[0115]
实验步骤
[0116]
按sp-selectin试剂盒的标准操作步骤，依次配置标准品，加样，分别设空白孔、标准孔、待测血清孔。在酶标包被板加50μl标准品，待测血清孔中先加40μl样品稀释液，再加10μl待测血清，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，洗板5次。空白孔除外每孔加入50μl酶标试剂，37℃温育30min，洗涤，每孔先加50μl显色剂a，再加50μl显色剂b，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加50μl终止液终止反应，在15min内空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(od值)。根据标准品的od值绘制标准曲线，计算血清样本浓度，数据列入表3和表4。
[0117]
实验结果
[0118]
从表3的数据可以看出，5μmol/kg 202,202-e,202-y,202-dy和202-ey治疗的抗动脉血栓大鼠的可溶性p-选择素含量显著低于生理盐水治疗大鼠的可溶性p-选择素含量(p《0.05)；从表4的数据可以看出，5μmol/kg 202,202-e,202-y,202-dy和202-ey治疗的抗深静脉血栓大鼠的可溶性p-选择素含量显著低于生理盐水治疗大鼠的可溶性p-选择素含量(p《0.05)。即在5μmol/kg的剂量下202,202-e,202-y,202-dy和202-ey可降低大鼠体内可溶性p-选择素含量。获得了意想不到的技术效果。
[0119]
表3化合物对动脉血栓大鼠血清中sp-selectin的影响
[0120][0121]
注：n＝8。a：与ns相比，p＜0.01。
[0122]
表4化合物对深静脉血栓大鼠血清中sp-selectin的影响
[0123][0124][0125]
注：n＝8。a：与ns相比，p＜0.01。