过表达牛TUSC5a和TUSC5b基因重组慢病毒的构建方法及其应用

过表达牛tusc5a和tusc5b基因重组慢病毒的构建方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及过表达牛tusc5a和tusc5b基因重组慢病毒的构建方法及其应用。


背景技术：

2.脂肪沉积能力是决定肉牛经济价值的重要因素。不同部位的牛脂肪组织售价差异很大。皮下和腹腔的脂肪沉积(牛油)价格在6元/公斤左右；如果脂肪沉积在肌肉内部，则可形成“雪花牛肉”，显著改善牛肉品质，其价格在1500元/公斤左右。因此，如何控制不同部位脂肪沉积的能力，成为目前科学研究和提高肉牛经济价值生产的关键。tusc5在人、小鼠和牛上被证明是调控脂肪沉积的重要基因。值得注意的是该基因特异性的在脂肪组织内高表达，此特征可以保障其在人工调控的前提下，不会影响其它组织的生长发育，并且在制备相关生物工程调控工具时，不需要考虑组织特异性启动表达，操作更为简便。以上说明tusc5在实现人工调控脂肪沉积方面具有非常大的潜力。
3.研究发现tusc5存在两种不同的可变剪接异构体tusc5a和tusc5b，但两者是否都对脂肪沉积具有调控作用，两者对脂肪沉积的调控作用程度是否一致，目前还不清楚。之前的研究证明可变剪接会导致同一基因产生的不同转录产物会具有不同甚至相反的功能。因此解析tusc5两种不同剪接异构体对脂肪沉积的调控作用对于其在牛脂肪沉积人为调控上的应用非常必要。
4.慢病毒可以通过侵染细胞或组织，将自身的基因组序列整合到宿主细胞中，从而实现目标基因在靶组织中持续表达的作用，从而进一步调控细胞或组织的发育，实现人工调控的目的，是一种有效基因工程手段，目前已经有较为广泛的应用。通过构建和包装超表达tusc5a和tusc5b的慢病毒，一方面可以在脂肪细胞系中研究两者对脂肪沉积的调控能力；另一方面，可以在明确两种不同剪接异构体对脂肪沉积能力调控的基础上，开发具有人工调控脂肪沉积能力的潜在有效工具。
5.因此，本研究通过摸索合适条件，构建包装超表达tusc5a和tusc5b慢病毒，并在此基础上解析两者对脂肪沉积的能力差异，为今后进一步开发人工调控肉牛脂肪沉积能力的有效生物工具打下基础，为快速提升肉牛经济价值提供必要的材料。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供牛tusc5a和tusc5b基因在肉牛脂肪沉积调控中的应用，tusc5a和tusc5b基因为牛tusc5基因的两种剪接异构体。
7.本发明的第二目的在于提供过表达牛tusc5a和tusc5b基因重组慢病毒在肉牛脂肪沉积调控中的应用，tusc5a和tusc5b基因为牛tusc5基因的两种剪接异构体。
8.本发明的第三目的在于提供一种调控肉牛脂肪沉积的人工制剂。
9.本发明的第四目的在于提供过表达牛tusc5a/tusc5b基因重组慢病毒的构建方
法，tusc5a和tusc5b基因为牛tusc5基因的两种剪接异构体。
10.为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
11.牛tusc5a和tusc5b基因在肉牛脂肪沉积调控中的应用，tusc5a的表达显著促进脂肪合成与积累，tusc5b的表达显著抑制脂肪合成与积累，tusc5a序列如seq id no.1所示，tusc5b序列如seq id no.2所示。具体地，可以将编辑tusc5a和tusc5b基因的分子工具构建到靶向侵染牛细胞的病毒中，通过静脉注射或口服等方式进入牛体内整合到牛基因组内表达从而达到调控脂肪沉积能力、调控牛肉品质的目的。
12.过表达牛tusc5a和tusc5b基因重组慢病毒在肉牛脂肪沉积调控中的应用，慢病毒将tusc5a和tusc5b整合到基因组内基因表达进而调控脂肪沉积，tusc5a的表达显著促进脂肪合成与积累，tusc5b的表达显著抑制脂肪合成与积累，tusc5a序列如seq id no.1所示，tusc5b序列如seq id no.2所示。具体地，可以将过表达牛tusc5a和tusc5b基因重组慢病毒作为一种分子工具通过静脉注射或口服等方式进入牛体内整合到牛基因组内表达。
13.一种调控肉牛脂肪沉积的人工制剂，包括过表达牛tusc5a/tusc5b基因过表达慢病毒载体。该人工制剂具有用于人工调控脂肪沉积能力或部位的潜力，进而调控牛肉品质，可以用于人工调控肉牛脂肪沉积和高档牛肉的生产。
14.过表达牛tusc5a/tusc5b基因重组慢病毒的构建方法，包括使用内切酶将携带his标签的tusc5a/tusc5b序列分别与慢病毒载体双酶切，胶回收后产物经连接酶连接，得到过表达牛tusc5a/tusc5b基因重组慢病毒的步骤；
15.所述慢病毒载体为pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro，经连接酶连接后的所述慢病毒载体上添加的序列为：
16.5'-ccg(保护碱基) gaattc(ecor1) atg tusc5a/tusc5b序列 catcatcaccatcaccat(his标签序列) cctagg(bamh1) cgc(保护碱基)-3'，
17.其中，tusc5a序列如seq id no.1所示，tusc5b序列如seq id no.2所示，连接tusc5a序列后慢病毒载体上添加的序列如seq id no.3所示，连接tusc5b序列后慢病毒载体上添加的序列如seq id no.4所示。
18.更进一步地，还包括tusc5a/tusc5b序列克隆的步骤，具体为：
19.从牛脂肪组织中得到的cdna，以tusc5a-f和tusc5a-overlap-r作为引物对tusc5a的第一个片段进行扩增，以tusc5a-overlap-f和tusc5a-red1-r2为引物对tusc5a的第二个片段进行扩增；将pcr产物胶回收后，作为模板，以tusc5a-f、tusc5a-red1-r2为引物，进行扩增得到tusc5a序列；以tusc5a-f、tusc5a-red1-r1为引物，进行扩增得到tusc5b序列，通过hind i、kpni双酶切后，胶回收产物经t4连接酶构建tusc5a-red1、tusc5b-red1；
20.其中，各引物的序列如下表：
21.[0022][0023]
更进一步地，还包括tusc5a/tusc5b序列添加his标签的步骤，具体为：
[0024]
以tusc5a-red1为模板，使用引物tusc5a-f、tusc5a-r扩增出携带his标签的tusc5a序列；
[0025]
以tusc5b-red1为模板，使用引物tusc5b-f、tusc5b-r扩增出携带his标签的tusc5b序列；
[0026]
其中，各引物的序列如下表：
[0027][0028]
tusc5a-red1的pcr扩增体系(20μl)如下表：
[0029][0030]
tusc5b-red1的pcr扩增体系(20μl)如下表：
[0031][0032]
更进一步地，还包括将过表达牛tusc5a/tusc5b基因重组慢病毒整合到宿主染色体上，构建tusc5a/tusc5b稳转细胞株的步骤。
[0033]
更进一步地，还包括过表达牛tusc5a/tusc5b基因重组慢病毒包装的步骤，通过过表达牛tusc5a/tusc5b基因重组慢病毒和pspax2、pmd2.g三质粒慢病毒包装体系，利用293t细胞作为包装细胞，包装慢病毒。
[0034]
更进一步地，pspax2：pmd2.g：过表达牛tusc5a/tusc5b基因重组慢病毒按照体积比2：3：4的比例混合。
[0035]
本发明的有益效果在于：本技术以pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(lv34)慢病毒为载体构建tusc5a和tusc5b两种过表达重组慢病毒，这两种过表达重组慢病毒作为具有侵染性的工具或作为人工制剂可调控脂肪沉积，tusc5a的表达显著促进脂肪合成与积累，tusc5b的表达显著抑制脂肪合成与积累。本发明对正确认识tusc5对脂肪沉积的调控网络深入到剪接异构体水平，并发现tusc5a和tusc5b对脂肪沉积具有相反的调控作用，包装好的两种tusc5剪接异构体慢病毒可作为人工调控肉牛脂肪沉积能力的工具，实现对脂肪沉积能力的剂量调控，对于快速人工促进我国肉牛经济价值提升具有重要意义。
附图说明
[0036]
图1是tusc5a、tusc5b凝胶电泳结果显示图；
[0037]
图2是过表达牛tusc5a、tusc5b基因重组慢病毒构建示意图；
[0038]
图3是tusc5a、tusc5b载体酶切凝胶电泳结果图；
[0039]
图4是tusc5a、tusc5b载体测序验证结果；
[0040]
图5是tusc5a、tusc5b慢病毒感染293t细胞荧光图；
[0041]
图6是tusc5a、tusc5b慢病毒感染293t表达验证结果图；
[0042]
图7是过表达tusc5a、tusc5b组的c3h10 t1/2诱导分化结果图；
[0043]
图8是过表达tusc5a、tusc5b组的c3h10 t1/2诱导分化油红o染色结果图；
[0044]
图9是过表达tusc5a、tusc5b组的c3h10t1/2细胞诱导分化过程中基因表达变化图。
具体实施方式
[0045]
以下实施例用于进一步说明此发明，但是不应理解为是对本发明的限制，在不违背本发明的实质和精神的前提下，任何对本发明所做的优化和替换，均属于本发明的范畴。
[0046]
若未特别声明，下列实施例中涉及的技术手段均为本科学领域技术人员普遍使用的常规技术。
[0047]
一、载体的构建
[0048]
1、tusc5a、tusc5b序列的克隆
[0049]
从牛脂肪组织中得到的cdna，以tusc5a-f和tusc5a-overlap-r作为引物对tusc5a的第一个片段进行扩增，以tusc5a-overlap-f和tusc5a-red1-r2为引物对tusc5a的第二个片段进行扩增；将pcr产物胶回收后，作为模板，以tusc5a-f、tusc5a-red1-r2为引物，进行扩增得到tusc5a序列；以tusc5a-f、tusc5a-red1-r1为引物，进行扩增得到tusc5b序列，并进行凝胶电泳验证大小。如图1所示为tusc5a、tusc5b凝胶电泳结果显示图。扩增的产物凝胶电泳结果显示与tusc5a和tusc5b序列条带大小一致。tusc5a序列如seq id no.1所示，tusc5b序列如seq id no.1所示。各引物序列如下表1所示。
[0050]
表1 tusc5a、tusc5b序列克隆过程各引物序列
[0051][0052]
重叠扩增第一步策略(35个循环)：
[0053][0054]
重叠扩增第二步策列(35个循环)：
[0055][0056]
通过hind i、kpni双酶切后，胶回收产物经t4连接酶构建tusc5a-red1、tusc5b-red1进行保存。
[0057]
2、过表达tusc5a、tusc5b重组慢病毒的构建
[0058]
以tusc5a-red1为模板，使用引物tusc5a-f、tusc5a-r扩增出携带his标签的tusc5a序列。以tusc5b-red1为模板，使用引物tusc5b-f、tusc5b-r扩增出携带his标签的tusc5b序列。
[0059]
其中，tusc5a、tusc5b序列添加his标签的引物序列如表2所示。tusc5a-red1的pcr扩增体系(20μl)如表3所示。tusc5b-red1的pcr扩增体系(20μl)如表4所示。
[0060]
表2 tusc5a、tusc5b序列添加his标签的引物序列
[0061][0062]
表3 tusc5a-red1的pcr扩增体系(20μl)
[0063][0064]
扩增策略：
[0065][0066]
表4 tusc5b-red1的pcr扩增体系(20μl)
[0067][0068]
扩增策略：
[0069][0070]
使用ecor1、bamh1内切酶将携带his标签的tusc5a和tusc5b序列分别与pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(lv34)慢病毒载体双酶切，胶回收后产物经t4 dna ligase连接酶分别连接，得到过表达牛tusc5a、tusc5b基因重组慢病毒。如图2所示为过表达牛tusc5a、tusc5b基因重组慢病毒构建示意图。
[0071]
其中，使用t4 dna ligase连接酶，37℃孵育2h，连接体系(20μl)如表5所示。
[0072]
表5使用t4 dna ligase连接酶的连接体系(20μl)
[0073][0074]
慢病毒载体上添加序列情况：5'-ccg(保护碱基) gaattc(ecor1) atg tusc5a/tusc5b序列 catcatcaccatcaccat(his序列) cctagg(bamh1) cgc(保护碱基)-3'。慢病毒载体上重组tusc5a添加的序列如seq id no.3所示，慢病毒载体上重组tusc5b添加的序列如seq id no.4所示。
[0075]
3、过表达tusc5a、tusc5b重组慢病毒验证
[0076]
利用慢病毒具有的感染整合特性，分别将过表达牛tusc5a、tusc5b基因重组慢病毒整合到宿主染色体上，达到持久性表达，构建tusc5a和tusc5b稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。
[0077]
具体步骤为：
[0078]
(1)取50μl感受态细胞，加入1μl连接产物(过表达牛tusc5a、tusc5b基因重组慢病毒)，轻轻混匀，冰浴30min；
[0079]
(2)转至42℃热90s，迅速取出放冰上2min，该过程不能摇动离心管；
[0080]
(3)加入500μl不含抗生素的lb液体培养基，混匀后置于37℃，200r/min，振动培养1h，使细菌复苏；
[0081]
(4)轻轻混匀后取20μl，使用涂布器均匀涂于含氨苄青霉素的lb固体培养基上，将平板置于37℃恒温培养箱，30min后倒置平板继续培养12h-14h；
[0082]
(5)于超净工作台上，挑取单菌落，接种于3ml含100μg/ml氨苄青霉素lb液体培养基中，37℃下220r/min振荡培养10h；
[0083]
(6)于超净工作台上，按1/1000的比例，接种上述培养物于200ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃下220r/min振荡培养过夜；
[0084]
(7)4℃下8000r/min离心收集菌体，提取过表达重组慢病毒；
[0085]
(8)过表达重组慢病毒提取好后进行双酶切验证序列，每管反应体系如下：
[0086][0087]
37℃酶切，取得产物后，进行凝胶电泳，找到酶切得到的条带和目的条带大小相对应区域，确定阳性克隆，如图3所示为tusc5a、tusc5b载体酶切凝胶电泳结果图，凝胶电泳结果显示，酶切产物中检测到tusc5a和tusc5b序列，过表达重组慢病毒构建成功。
[0088]
为进一步验证过表达牛tusc5a和tusc5b基因重组慢病毒构建，将提取的过表达重组慢病毒测序，得到序列结果与tusc5a和tusc5b序列进行比对，如图4所示为过表达牛tusc5a和tusc5b基因重组慢病毒测序验证结果，结果显示过表达重组慢病毒序列与tusc5a和tusc5b序列一致，过表达重组慢病毒构建完成。
[0089]
(9)用对应阳性菌液再次大量培养过表达重组慢病毒后抽提，得到过表达重组慢病毒保存备用。
[0090]
二、过表达牛tusc5a、tusc5b基因重组慢病毒的包装
[0091]
1、tusc5a、tusc5b过表达重组慢病毒的包装
[0092]
通过慢病毒核心质粒(即上述步骤中阳性菌液大量培养后抽提得到的过表达重组慢病毒)、pspax2、pmd2.g三质粒慢病毒包装体系，利用293t细胞作为包装细胞，包装慢病毒。因为核心质粒中带有独立cmv的启动子copgfp的标签，慢病毒包装时，293t细胞会表达绿色荧光蛋白，可以在显微镜下观察到。
[0093]
293t细胞接种：使用复苏后已进行传代的细胞进行培养，观察其生长状况。选择形态正常、无污染情况，正处于对数生长期的细胞。将其接种于六孔板中(细胞数约为5
×
105个每孔)置于37℃，5％co2培养箱内培养留用。
[0094]
质粒和转染试剂的准备：三种质粒dna溶液，按照pmd2.g：pspax2：核心质粒为2：3：4的比例混合，并加入pbs定容至200μl，室温放置30min。
[0095]
质粒转染：使用in vitro dna转染试剂盒(polyplus-transfection公司)将慢病毒表达系统导入293t细胞，具体步骤参照说明书进行：
[0096]
(1)当293t细胞汇合度达到70％-90％时进行转染；
[0097]
(2)转染前1h-2h更换新鲜培养液，刺激293t细胞形态变化；
[0098]
(3)每孔转染复合物的配制：分别向3支1.5ml无菌ep管中各加入200μl jet prime buffer，分别向每管中加入9μg的预先孵育的慢病毒表达系统混合质粒，轻轻吹打混匀，加入9μl jetprime转染试剂，轻轻吹打混匀，形成转染复合物；
[0099]
(4)室温孵育15min；
[0100]
(5)加入dna-脂质体复合物至细胞培养液中，摇晃使其均匀；
[0101]
(6)37℃培养细胞8h，更换培养液。
[0102]
(7)分别收集24h、48h、72h的培养液上清，混合后将收集的上清液离心(4℃，4000，10min)，收集离心后的上清液；于超净工作台将上清液用0.45μm的过滤筛过滤。
[0103]
如图5所示为tusc5a、tusc5b慢病毒感染293t细胞荧光图，tusc5a、tusc5b、control组在使用慢病毒核心质粒、pspax2、pmd2.g三质粒慢病毒包装体系转染293t细胞24h后，在荧光显微镜下可以观察到明显绿色荧光表达。
[0104]
2、过表达牛tusc5a、tusc5b基因重组慢病毒的检测
[0105]
使用tusc5a、tusc5b、control慢病毒核心质粒、pspax2、pmd2.g三质粒慢病毒包装体系转染293t细胞24h后，提取细胞rna和蛋白进行检测，如图6所示为tusc5a、tusc5b慢病毒感染293t表达验证结果图，结果显示，慢病毒侵染后tusc5a、tusc5b、control组293t细胞在mrna水平及蛋白水平均呈显著提高。
[0106]
rna提取：
[0107]
(1)去除待处理细胞板中的培养基，用pbs轻缓地清洗细胞两次，吸净废液，每孔中加入1ml trizol试剂，轻轻晃动细胞培养板，使trizol均匀覆盖细胞表面，室温孵育5min；
[0108]
(2)用rnase-free枪头吹打细胞至完全裂解，将液体转移至1.5ml ep管中；
[0109]
(3)每管中加入200μl预冷的氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温静置10min；
[0110]
(4)标记、封口，4℃离心机12000r/min离心15min，室温静置5min，样品分层(上层水相，中层为蛋白层，下层酚相，rna存在于上层水相中)；
[0111]
(5)吸取上层水相(约400μl)于新1.5ml ep管中，加入等量-20℃预冷的异丙醇，充分混匀，室温静置10min；
[0112]
(6)标记、封口，4℃离心机12000r/min离心10min，此时可看到管底的白色rna沉淀(rna量较少时观察不到明显沉淀)；
[0113]
(7)弃上清，向沉淀中加入1ml 75％无水冷乙醇漂洗2次(注意：75％无水乙醇用depc水配制，现配现用)，4℃离心机8000r/min离心5min，最后一遍使用洁净棉巾将管内多余水分控干；
[0114]
(8)置于室温下干燥5min-10min，沉淀呈半透明状，加入适量depc水于冰上溶解30min；
[0115]
(9)分装出2μl测浓度，3μl跑胶检测是否有降解，其余保存于-80℃备用。
[0116]
蛋白提取：
[0117]
(1)配制裂解液(1ml体系)：准备1000μl高强度ripa裂解液，其中加入20μl 50
×
cocktail蛋白酶抑制剂，添加磷酸化蛋白酶抑制剂a、b液各10μl，以及10μl pmsf试剂；
[0118]
(2)收细胞蛋白样：用预冷的pbs清洗细胞3次，最后一次要彻底吸干残留液。每孔细胞中加入120μl-150μl蛋白裂解液，将细胞培养板置于冰上放置5min，期间反复晃动培养板使裂解液与细胞充分接触。用干净的细胞刮刀将细胞及裂解液收集到1.5ml ep管中；冰浴30min，期间每隔10min，用200μl移液枪反复吹打数次，确保细胞完全裂解。4℃12000r/min离心5min，将上清收集至新的ep管中，得到细胞蛋白。
[0119]
三、过表达tusc5a、tusc5b对c3h10 t1/2诱导分化的影响
[0120]
1、tusc5a、tusc5b过表达c3h10t1/2细胞诱导分化
[0121]
使用试剂a(1.0μmol/l罗格列酮，1.0μmol/l地塞米松，10mg/l胰岛素，0.5mmol/l的ibmx)，48h后更换成试剂b(1.0μmol/l罗格列酮，10mg/l胰岛素)进行维持。以试剂a和试剂b交替的方式对tusc5a、tusc5b、control组c3h10 t1/2细胞进行成脂诱导。
[0122]
在4d时，对细胞进行油红o染色，如图7所示为过表达tusc5a、tusc5bc3h10 t1/2诱导分化结果图，如图8所示为过表达tusc5a、tusc5b组的c3h10t1/2诱导分化油红o染色结果图，tusc5a组脂滴沉积数量及大小均高于tusc5b、control组，而control组高于tusc5b组，可得，tusc5a的过表达相比于control组可以提高c3h10 t1/2诱导分化沉积脂肪的能力，而tusc5b组的过表达相比于control组则降低了c3h10 t1/2诱导分化沉积脂肪的能力。除此之外，在诱导分化4d时发现过表达tusc5b的c3h10 t1/2出现凋亡的情况。
[0123]
2、tusc5a、tusc5b过表达c3h10t1/2细胞诱导分化过程中基因表达变化
[0124]
pparγ、fasn、fabp4、scd1是脂肪沉积过程的重要标志基因，在细胞分化过程中我们对其表达进行定量检测分析。如图9所示为过表达tusc5a、tusc5b c3h10 t1/2诱导分化油红o染色结果图，pparγ、fasn、fabp4、scd1表达量在0-6天逐渐升高，且tusc5a组显著高于control，tusc5b组则呈现表达相对于control被显著抑制。pparγ、fasn、fabp4、scd1表达量在6-10天缓慢下降。这反映了tusc5a的表达显著促进了脂肪合成与积累，tusc5b的表达显著抑制了脂肪合成与积累。
[0125]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。