一种基于稳定同位素的克氏原鳌虾养殖模式溯源方法

1.本发明涉及克氏原鳌虾鉴伪技术领域，更具体的说是涉及一种基于c、n、 h和o稳定同位素的克氏原鳌虾养殖模式溯源模型构建及鉴别方法。


背景技术：

2.克氏原鳌虾(procambarus clarkia)，又名小龙虾，具有很高的营养价值，凭借鲜美口感、丰富口味和相对平价的价格成为百姓餐桌上的“网红”食物。随着人们对克氏原鳌虾及其产品营养价值关注度越来越高，其消费需求量迅速增加。我国是小龙虾最大生产出口消费国，2021年，我国小龙虾养殖面积2600 万亩、产量263.36万吨，小龙虾产业总产值为4221.95亿元。小龙虾养殖主要包括稻虾种养、池塘养殖(包括精养、蟹池混养)、藕田养殖、大水面增养殖等方式，以稻虾种养为主。其中，稻虾种养又以环沟模式为主，但近年来不挖沟、少挖沟模式逐渐兴起，成为各地新发展稻虾种养的重要模式。2021年，稻虾种养面积2100万亩，小龙虾产量220万吨，面积和产量同比分别增长10.99％、6.68％，占小龙虾养殖面积和产量的80.77％、83.54％。稻虾模式亩产平均利润 3000元，极大提升了农业综合效益。稻虾模式是一种生态化的种养模式，受到市场的喜爱。不同养殖模式的小龙虾营养品质存在很大差异，导致市场欢迎度和价格相差很大。因此建立小龙虾养殖模式识别和溯源技术成为有效规范市场秩序、确保公平竞争、保护地区养殖特色产品的重要保障。
3.目前，可用于水产品溯源分析的指标包括化学组分、感官特性、遗传谱图、矿物元素和同位素比等，应用的主要仪器手段包括，光谱法、核磁共振法、酶联免疫、基因检测、色谱和质谱等。其中，稳定同位素分析技术在溯源和掺假鉴别方面有着较好的优势，目前已应被用于农产品和水产品领域。农产品和水产品中稳定同位素信息涵盖了其生长环境、地理位置和营养级等多种信息，物品体内的稳定同位素比的差异可作为其“指纹图谱”，以精准区分物品的不同。稳定同位素分析通过对生态系统中相关物种的分析，可以充分了解不同环境模式下生物的摄食特点及其稳定同位素组成。因而，这一技术被广泛的应用于植物性和动物性食品的产地以及饲养方式的研究。
4.目前基于稳定同位素结合多元素的小龙虾养殖模式溯源研究尚未见报道。因此，如何提供一种小龙虾养殖模式溯源以鉴别真伪产地及养殖模式的方法是本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种鉴别不同养殖模式小龙虾的方法，采用稳定同位素质谱仪分析测定不同产区小龙虾的稳定同位素，探明小龙虾中稳定同位素的组成特征并分析其与养殖模式的关联，结合化学计量学方法对多因素指标进行筛选，分别建立不同产区的小龙虾的模型，实现各区域小龙虾养殖模式的鉴别，以期为小龙虾养殖模式的溯源提供有价值的策略。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种基于稳定同位素的克氏原鳌虾养殖模式溯源方法，包括以下步骤：
8.(1)采集不同区域不同养殖模式下的克氏原鳌虾样品，用清水洗净，剥离虾尾肉粉碎成肉糜，真空冷冻干燥后研磨成粉，过100目筛，-18℃冷冻保存；
9.(2)取制好的粉末样品置于离心管中加入溶剂2500r/min涡旋5-10min 后4000r/min离心10-15min去除上清液，重复操作2-3次，真空干燥箱内40℃恒温干燥12h；
10.(3)对上述样品分别进行c、n、h、o同位素测定得到稳定同位素丰度比，计算得到同位素比率δ
13c‰
、δ
15n‰
、δ2h
‰
、δ
18o‰
；
11.(4)采用不同养殖模式对应的稳定同位素比率数据建立模型，得到养殖模式判别模型；
12.(5)将未知样品的稳定同位素比率数据带入步骤(4)的模型中进行判别溯源。
13.优选的，步骤(1)中每个养殖模式下的样品采集≥20份，且采集区域≥5 处，每份样品重量≥2kg，每份样品数量15～20只。
14.优选的，步骤(2)中所述溶剂为体积比甲醇：氯仿＝2：1的混合液，样品与溶剂的质量体积比为0.1g/ml。
15.优选的，步骤(3)中的具体操作如下：
16.(3.1)取0.2mg待测样品到锡箔杯中，称取等量的标准物质，将各样品经过元素分析仪转化为co2气体和n2，然后利用conflo iii型稀释仪稀释后，再利用同位素比率质谱仪检测每个待检测样品，得到各样品的稳定碳同位素丰度比和稳定氮同位素丰度比；
17.(3.2)取0.25mg待测样品装入银杯中，称取等量的标准物质，将各样品经过元素分析仪1380℃下燃烧裂解转化为co和h2，生成气体在65℃条件下通过色谱柱分离后经confloⅳ型稀释仪稀释后，再利用同位素比率质谱仪检测每个待检测样品，得到各样品的稳定氢同位素丰度比和稳定氧同位素丰度比。
18.优选的，步骤(3.1)中所述的标准物质为usgs40、usgs41a和usgs42；步骤(3.2)中所述的标准物质为usgs42。
19.优选的，步骤(3.1)中元素分析仪进样器氦气吹扫流量为220ml/min，氧化炉温度为960℃，还原炉温度为650℃，载气氦气流量为90ml/min；
20.confloiii条件为：he稀释压力为0.6bar，co2参考气压力为0.6bar，n2参考气压力为1.0bar；
21.同位素比率质谱仪参数：ei离子源，离子源电压：3.06kv，真空度：1.2
ꢀ×
10-6
mbar，电流：1.5ma；测试仪器δ
13
c、δ
15
n、δ2h及δ
18
o的连续测定精度《0.06
‰
(n＝10)、δ2h的连续测定精度《0.4
‰
(n＝10)；
22.分析过程中各样品进行平行测试取平均值，每10个样品穿插一个标准样品。
23.优选的，步骤(3)中，稳定同位素比率计算公式为：δ
‰
＝(r
样品
/r
标准
－ 1)
×
1000，式中，r代表标准物质和样品中轻重同位素与轻同位素的丰度比，即分别为
13
c/
12
c，
15
n/
14
n，2h/1h，
18
o/
16
o。
24.优选的，不同养殖模式下的克氏原鳌虾样品为稻虾、塘虾、河虾。
25.优选的，步骤(4)中利用相关性分析、主成分分析和线性判别分析不同养殖模式下克氏原鳌虾的稳定同位素测定养殖模式判别准确率；
26.其中，稻虾、塘虾、河虾的稳定同位素比数据间的相关性分析系数分别为：δ
13
c、δ
15
n相关性系数为0.1；δ
13
c、δ2h相关性系数为0.29；δ
13
c、δ
18
o相关性系数为0.11；δ2h、δ
18
o相关性系数为0.05；
27.稻虾、塘虾、河虾，对应的主成分分析的前第一主成分的方差贡献率为 37.8％，第二主成分方差贡献率为26.4％，前两项主成分得分的方差贡献率和为64.2％。
28.优选的，以稳定同位素比率数据的前两项主成分得分作为输入，建立的对应的线性判别模型分别为：
29.y稻虾＝b
稻虾
×
a；
30.y塘虾＝b
稻虾
×
a；
31.y河虾＝b
稻虾
×
a；
32.其中a表示稳定同位素比率数据；b表示不同养殖下的转换系数。
33.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于稳定同位素的克氏原鳌虾养殖模式溯源方法，具有如下有益效果：
34.提供了一种不同养殖模式下小龙虾的鉴别方法，利用稳定同位素技术采集不同养殖模式小龙虾样品数据，再结合化学计量法挖掘得到的数据信息，进一步建立中小龙虾的鉴别模型，本方法建立的不同养殖模式下小龙虾的真实判别模型具有较高的准确率，能够准确分辨出不同养殖模式的样品。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
36.图1为实施例1中不同养殖方式的小龙虾δ
13
c和δ
15
n平均值散点图；
37.图2为实施例1中不同养殖方式的小龙虾δ
18
o和δ2h平均值散点图；
38.图3为实施例1中稳定同位素相关性分析图；
39.图4为实施例1中不同生产模式小龙虾稳定同位素主成分得分图；
40.图5为实施例1中不同生产模式小龙虾稳定同位素线性判别分析图。
具体实施方式
41.下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.实施例1
43.稻虾、塘虾和河虾三种养殖模式下小龙虾稳定元素模型的建立：
44.(1)采集不同养殖模式(稻虾、塘虾、河虾)小龙虾样品，每种模式下的样品不少于20份，20份样品采集区域不少于5处，每份样品不少于2kg，每份样品小龙虾数量不少于15～20只之间；
45.(2)将小龙虾用清水洗净，剥虾尾肉，用料理机打成肉糜，冷冻真空干燥，研磨成粉
过100目筛，-18℃冷冻保存待测；
46.(3)取上述样品1g于塑料离心管内，加入溶剂(甲醇：氯仿＝2：1) 10ml，在全自动涡旋机上以2500r/min的速度涡旋5min，然后以4000r/min 离心15min，去除上清液丢弃，重复提取两次，然后再真空干燥箱中恒温40℃恒温干燥12小时净干；
47.(4)c、n同位素的测定：在十万分之一的电子天平称取样品约0.2mg 到锡箔杯中，选取usgs40、usgs41a和usgs42作为标准物质，同样重量称量后，将所有的待分析样品经元素分析仪的自动进样器后依次进样测定，样品中的碳元素和氮元素在960℃下燃烧生成co2和no
x
，然后no
x
在铜导线上还原生成n2，而后co2和n2经confloⅲ型稀释仪稀释后进入delta plus
ꢀꢀ
thermo质谱仪进行检测；
48.其中，元素分析仪进样器氦气吹扫流量为220ml/min，氧化炉温度为960 ℃，还原炉温度为650℃，载气氦气流量为90ml/min；
49.confloiii条件为：he稀释压力为0.6bar，co2参考气压力为0.6bar，n2参考气压力为1.0bar；
50.delta plus thermo质谱仪参数：ei离子源，离子源电压：3.06kv，真空度：1.2
×
10-6
mbar，电流：1.5ma；测试仪器δ
13
c、δ
15
n、δ2h及δ
18
o的连续测定精度《0.06
‰
(n＝10)、δ2h的连续测定精度《0.4
‰
(n＝10)；
51.分析过程中各样品进行平行测试取平均值，每10个样品穿插一个标准样品；
52.(6)h、o稳定同位素的测定：依次将做好前处理实验后的虾肉样品用十万分之一电子天平准确称取0.25mg(精确到0.10mg)到银杯中，选取 usgs42作为标准物质，同样重量的称量后，将所有的待分析样品经元素分析仪的自动进样器后依次进样测定，样品中的氢和氧元素在约1380℃高温下燃烧裂解，转化为co和h2，生成气体在65℃条件下通过色谱柱分离后经conflo
ꢀⅳ
稀释仪到同位素比质谱仪中进行δ2h、δ
18
o的测试分析；
53.稳定同位素比率计算公式为：δ
‰
＝(r
样品
/r
标准
－1)
×
1000，式中，r代表标准物质和样品中轻重同位素与轻同位素的丰度比，即分别为
13
c/
12
c，
15
n/
14
n，2h/1h，
18
o/
16
o。
54.通过稳定同位素分析，小龙虾的同位素δ
13
c在-17.77到-14.02
‰
之间，小龙虾的δ
14
n在4.11到5.94
‰
之间，小龙虾的δ2h在-48.50到-30.35
‰
之间，δ
18
o 在小龙虾的范围分别为-12.39到-10.58
‰
。小龙虾的c、n、h和o的稳定同位素比组成的平均值见表1。
55.表1不同养殖方式的稳定同位素特征
[0056][0057]
表1所示，表明塘虾的碳稳定同位素比δ
13
c最高分别为-15.42
±
0.76
‰
，稻虾和河流虾的δ
13
c较低，分别为-15.58
±
0.64
‰
和-16.57
±
0.6
‰
。根据方差分析，河流虾组δ
13
c与其他两组有极显著性差异(p《0.01)。由于小龙虾中的碳稳定同位素与饲料密切相关，因此
小龙虾的主要饮食被认为是c的主要来源。小龙虾的主要饮食包括商品饲料、水生植物和豆类，对其平均值δ
13
c进行分析，结果分别为-27.78
±
0.44
‰
、-28.63
±
0.45
‰
和-27.83
±
0.25
‰
。与小龙虾的δ
13
c相比，小龙虾的饮食δ
13
c更大。小龙虾平均氮稳定同位素比值δ
15
n 从高到低分别为5.59
±
0.18
‰
、5.33
±
0.32
‰
和4.69
±
0.35
‰
。根据方差分析，三组小龙虾的δ
15
n有极显著差异(p《0.01)。塘虾的δ
15
n最大最高，河虾的δ
15
n的值高于稻虾。通常，氮稳定同位素比值与动物的养殖方式有关。水稻小龙虾是在稻田浅水养殖的，水稻的根系从环境中吸收氮素来生长。由于水稻直接吸收环境氮，导致稻虾的δ
15
n值低于其他两组。
[0058]
图1为不同养殖方式的小龙虾δ
13
c和δ
15
n平均值散点图，为了考察不同养殖方式的小龙虾之间的差异从图中可以看出在δ
15
n可以较好的区分稻虾和塘虾，在δ
13
c值上不同养殖方式的龙虾偏差重叠的部分较多，不能实现养殖方式的区分。
[0059]
水生生物的稳定同位素h和o与养殖水有关，但受饮食影响较小。水稻、池塘和河蟹的δ2h值分别为-38.29
±
3.28
‰
、-42.74
±
2.08
‰
和-40.39
±
4.22
‰
。平均δ2h在稻虾、塘虾和河虾中均有显著性差异(p《0.05)，稻虾和塘虾两组间差异极显著(p《0.01)。报告显示，小龙虾的δ2h值与聚集的水有关，水的氢同位素比受气候和光合作用等生理过程的影响。由于稻田、池塘和河流的光合作用不同，在不同的养殖方式下观察到显著差异。小龙虾δ
18
o值在不同组间差异不显著(p》0.05)。因此，小龙虾中δ
18
o在不同的养殖方法中是稳定的。
[0060]
图2为不同养殖方式的小龙虾δ
18
o和δ2h平均值散点图，为了考察不同养殖方式的小龙虾之间的差异从图中可以看出δ
18
o和δ2h值上不同养殖方式的龙虾偏差重叠的部分较多，不能实现养殖方式的区分。
[0061]
对不同养殖模式小龙虾的稳定同位素相关性分析：通过相关性考察发现稳定同位素c、n、h、o间的相关性差，相关性系数热图间图3，不同养殖模式的小龙虾稳定同位素间是独立的。
[0062]
主成分分析：通过主成分分析(pca)来分别考察小龙虾生产模式之间的聚类情况。通过主成分分析的得分图，可以判断不同小龙虾的聚类效果。以稳定同位素比率数据的前两项主成分得分作为输入，建立的对应的线性判别模型分别为：y稻虾＝b
稻虾
×
a；y塘虾＝b
稻虾
×
a；y河虾＝b
稻虾
×
a；其中a表示稳定同位素比率数据；b表示不同养殖下的转换系数。图4为以小龙虾的c、n、h和o为输入数据进行pca分析后的第一(pc1)和第二(pc2) 主成分得分图。从图中可以看出红色圈代表塘虾样本，绿色菱形代表稻虾样本，黑色方框代表河虾样本，三类样本呈现出一定的聚类效果，其中稻虾与塘虾的聚类效果较好，稻虾与河虾有个别重叠样品，河虾和塘虾间重叠样品较多。pc1 和pc2的主成分的方差贡献率占比64.2％，第三和第四主成分的方差贡献率分别为21.5％和14.34％，由于前两个主成分方差贡献率占比较大，能够反映小龙虾不同模式下的大部分的同位素特征。
[0063]
线性判别分析(lda)：为了提高分类效果，选择lda方法进行分类。将原始数据进行pca后的得分矩阵进行lda的输入所得到的lda的得分图如图5。图5为考察小龙虾的生产模式进行lda分析的得分图。图5为c、n、 h和o稳定同位素数据的lda得分图，从图中可以看出塘虾、稻虾和河虾三类生产模式的分类效果较好，塘虾和稻虾可以很好的分开，河虾和塘虾，河虾和稻虾有部分样本重叠。且与pca的分类效果比较，lda的分类效果优于pca。
[0064]
综上，通过稳定同位素分析获得了不同养殖模式小龙虾的同位素特征其中湖北省小龙虾的平均值分别为小龙虾的同位素δ
13
c在-17.77到-14.02
‰
之间，小龙虾的δ
14
n在
4.11到5.94
‰
之间，小龙虾的δ2h在-48.50到-30.35
‰
之间，δ
18
o在小龙虾的范围分别为-12.39到-10.58
‰
。分别采用pca和lda等方法进行聚类分析，发现不同养殖模式的小龙虾可以实现分类，通过两种方法的比较发现lda在小龙虾生产模式的分类效果优于pca方法。本专利描述了小龙虾稳定同位素的基础特征，同时提供了一种小龙虾生产方式分类鉴别的新方法。
[0065]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0066]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。