一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法与流程

1.本发明涉及一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法，属于大分子蛋白纯化领域。
技术背景
2.胶原蛋白是一种生物高分子，它广泛存在于动物结缔组织中，约占体内蛋白总量的25-30％，是哺乳动物体内分布最广、质量分数最多的功能性蛋白，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复起着重要作用。胶原蛋白的一级结构与大多数蛋白质有着明显区别，即胶原域中有“甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸”或“甘氨酸-脯氨酸-x”和“甘氨酸-x-y”这样一些重读序列存在。其中甘氨酸几乎占了总氨基酸残基的1/3，即没隔两个其他氨基酸残基即会连接一个甘氨酸，因此可以表示为(gly-x-y)n，x位置常出现脯氨酸(约为20％-30％)，gly-pro-y这样的重复序列约占了三肽总和的1/3，胶原蛋白中缺乏色氨酸，芳香氨基酸和半胱氨酸的含量也比较少，但是含有较多的其他蛋白质中少见的羟脯氨酸和羟赖氨酸残基。胶原蛋白的二级结构为3条左手螺旋链相互缠绕成的右手螺旋结构，即超螺旋结构。胶原蛋白独特的三重螺旋结构使其分子结构非常稳定，并且赋予其的自身低免疫原性和良好的生物相容性。由于起良好的生物活性，生物相容性及生物降解性，它在生物医学、组织工程、食品和化妆品等领域都有着广泛的应用。
3.重组胶原蛋白在食品领域中的应用，主要包括一下几方面：作为功能性食品和保健品，经常食用胶原蛋白丰富的食品可增加皮肤组织细胞的储水能力，增加和维持肌肤良好的弹性，延缓肌体衰老；作为肉制品改良剂，提升肉类的嫩度，改善产品品质，提高蛋白质含量；作为食品包装材料，如人工肠衣等。
4.重组胶原蛋白在化妆品领域中的应用，胶原蛋白中含有大量羧基和羟基的氨基酸。如羟脯氨酸、羟赖氨酸以及甘氨酸等天然保湿因子，对皮肤具有很好的保湿效果。此外，胶原蛋白多肽与皮肤细胞的生长、分裂、增殖、迁移以及分化有关，可提供养分从而延缓皮肤衰老并且还具有促进皮肤的创面修复和抗辐射的作用，因而广泛用于化妆品领域。
5.重组胶原蛋白在生物医学领域中的应用，胶原蛋白具有低抗原性、生物可降解性、生物相容性和促进血小板凝聚等生物学特性，是非常重要的天然生物材料，重组人源ⅰ型胶原蛋白制备成的海绵具有多孔微观结构和低炎症反应的特性，可被运用于细胞组织的再生。重组人源ⅱ型胶原蛋白能刺激细胞外软骨基质的更新合成，被应用于软骨再生。此外，重组胶原蛋白还被应用于混合仿生学或互穿网络支架，如制备人工角膜等。
6.目前各领域所有胶原蛋白主要采用酸、碱水解法或酶解法从、骨等组织中动物皮、骨等组织中提取获得，但这些方法只去的胶原蛋白水溶性差，很难分离到纯的胶原蛋白，且在临床上容易造成致病污染和出现排异反应，使其在作为医药、生物医学材料或药物载体等方面的应用受到很大限制。鉴于其广阔的应用前景，特别是在医用材料、美容、保健品领域，对优质的胶原蛋白需求量很大，寻找新的方法制备胶原蛋白就显得十分重要了，利用基因工程技术重组表达人胶原蛋白陈哥日一个很有意义的研究方向。
7.采用分子生物学技术制备重组人胶原蛋白有代替传统提取方法的趋势，但由于产
量低、纯化分离耗资大，使其价格昂贵。胶原蛋白的国内外市场需求一直很大，尤其是高质量的胶原蛋白产品的市场正处于一个开端期，因此利用生物分离工程和提纯重组胶原蛋白将会是一种更安全更高效的选择。生物分离工程是生物化学工程的一个重要组成部分，是研究生物产品分离和提纯过程原理和方法的一门分支学科，是生物技术转化为生产力不可缺少的重要环节，也可称之为生物技术下游加工过程。
8.生物产品的分离纯化过程是生物工程的下游工程，研究和开发生物分离过程技术的重要性不亚于上有的生物发酵过程及酶反应过程。在生物产业中，下游分离提取的成本占到整个成本的60％以上，尤其是基因工程菌发酵产品的分离和提纯所占费用达到了85％左右。因此，生物分离过程工序繁琐、技术难度大、回收率低、重复性差等缺点成为制约生物产品工业化生产的“瓶颈”，因此研究和改进生物分离技术、降低成本、简化工序、提高回收率对于生物产业的发展具有十分重要的意义。


技术实现要素：

9.本文发明的目的就是提供一种高效便捷的可以工业化进行重组胶原蛋白纯化的方法。所述重组胶原蛋白于毕赤酵母(pichiapastoris)中表达。
10.众所周知，大多数生物产品下游加工过程都需要经过多步分离纯化手段才能得到最终理想纯度的产品，过程中的每一步分离步骤都会带来一定的产品损失。所以为了提高总回收率，进行了两方面的工艺改进及创新，减少了分离步骤的同时提高各步骤的回收率。
11.为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
12.一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法，主要包括以下步骤：
13.(1)此重组胶原蛋白是分泌表达产物，采用离心的方法进行菌体与发酵液的分离，得到离心上清液。
14.(2)将离心上清液过滤，得到过滤液。
15.(3)将过滤液进行中空微滤，中空微滤完成后得到中空微滤透过液。
16.(4)中空微滤透过液进行超滤1，超滤1完成后得到超滤脱盐浓缩液1。
17.(5)超滤脱盐浓缩液1稀释后进行离子交换层析，得到洗脱液。
18.(6)将洗脱液进行超滤2，超滤2完成后得到超滤脱盐浓缩液2。
19.(7)超滤浓缩脱盐液2可直接进行冻干。
20.在步骤(1)中采用碟片式离心机能够按纯化要求进行固液分离，方便进行下游纯化规模放大，提高纯化过程中的离心效率，节约时间成本。
21.优选的，本发明的步骤(2)得到的过滤液中加入酸性氨基酸，加入酸性氨基酸的质量百分比为0.01-0.02％。
22.加入酸性氨基酸，一是可以调节过滤液的ph，二是可以起到保护过滤液中的重组胶原蛋白的作用，防止蛋白质变性。
23.加入的酸性氨基酸最佳选择是谷氨酸。
24.优选的，调节过滤液ph值在4.5-5。胶原蛋白的稳定和ph有很大关系，在本发明的纯化过程中，过滤液ph值在4.5-5之间，最适合保持胶原蛋白的稳定。
25.进一步的，通过加入醋酸来调节过滤液ph。
26.在过滤液中加入的小分子成分，在后面的步骤中都可以通过超滤去除。
27.步骤(3)中的中空微滤能够除去部分分子量大于重组胶原蛋白分子量的杂蛋白。
28.步骤(4)中，超滤1能够除去部分分子量小于重组胶原蛋白分子量的杂蛋白。
29.步骤(5)中，离子交换层析为阳离子交换层析，此步骤基本上可除去剩余杂蛋白，使重组胶原蛋白纯度≧98％。
30.步骤(6)中，超滤2可将离子交换层析后的样品进行脱盐浓缩处理。
31.如所述的纯化方法得到重组胶原蛋白纯度≧98％。
32.本发明的主要创新点在于通过不同的过滤手段来达到提纯的目的，同时，方便进行工业化的大规模提纯。
33.现有技术中，大多数的文献报道，都是基于实验室范围的提纯测试，所有类似的纯化方法，都有2个比较明显的缺点，一个是不适合规模化工业提纯制备，第二个是，提纯后的重组蛋白，活性降低。
34.本发明的突出优点在于，本发明可以从提纯后的重组胶原蛋白与天然胶原活性非常接近。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
35.本发明提供了一种易于实现、制备工艺简单的重组胶原蛋白纯化方法。该方法采用中空微滤，超滤结合阳离子交换法，仅一步离子交换法便可得到高纯度重组胶原蛋白。经该方法制备的重组胶原蛋白与天然胶原活性相似，这对于日益发展的医疗器械、化妆品及食品领域来说，有更多的优秀材料可以选择，非常有益。同时，本方案中流动相采用低浓度无机盐，纯化成本大大降低，且步骤简洁，易于实施操作，适宜进行大规模生产。
附图说明
36.图1：为实施例1-4最终得到的重组胶原蛋白的电泳图。
37.图2：为实施例1-4最终得到的重组胶原蛋白的hplc检测结果图。
38.图3：为实验组和对照组细胞划痕面积恢复对比图。上排三个图从左到右是实验组在0、10、20h的结果图。下排三个图从左到右是对照组在0、10、20h的结果图。
具体实施方式
39.下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
40.实施例1中空微滤处理重组胶原蛋白过滤液
41.将重组胶原蛋白是分泌表达的产物采用离心的方法进行菌体与发酵液的分离，得到离心上清液。将离心上清液过滤，得到过滤液。
42.在过滤液中加入谷氨酸，一是可以调节过滤液的ph，二是可以起到保护过滤液中的重组胶原蛋白的作用，防止蛋白质变性。加入谷氨酸的质量百分比为0.01％。
43.同时调节过滤液ph值在4.5。通过加入醋酸来调节过滤液ph。
44.使用微滤膜系统将胶原蛋白过滤液进行处理，将要处理的料液倒入微滤膜系统储液桶中，设备工作压力≦2bar，设备运行时进料压力为0.8bar，收集透过液，此时储液桶中的物料残渣中仍有部分目标蛋白，使用纯化水冲洗，重复将物料残渣进行微滤冲洗2-3次直至物料残渣中80％目标蛋白被微滤透过。微滤透过液体积比胶原蛋白过滤液体积增大2-3倍。
45.实施例2超滤-1处理重组胶原蛋白中空微滤透过液
46.超滤浓缩：
47.将进液管、回流管放入样品中，透过管放入烧杯中，超滤泵转速为120rpm，转动回流管压力阀门，使入口压力维持在20psi以下，出口压力维持在5-10psi以下，浓缩样品至3-5l。
48.超滤脱盐：
49.向浓缩样品中加入等体积的超纯水，摇匀，超滤泵转速为120rpm，转动回流管压力阀门，使入口压力维持在20psi以下，出口压力维持在5-10psi以下，透过管放入烧杯中，重复稀释至回流液电导＜15ms/cm；
50.将20mm柠檬酸(ph5.5
±
0.25)进行等体积脱盐至回流管、透过管电导率小于15ms/cm，体积3-5l，将回流管压力阀逆时针方向全部打开，进液管放入20mm柠檬酸(ph5.5
±
0.1)将样品打出。为超滤浓缩脱盐液1，以备离子交换层析。
51.实施例3重组胶原蛋白阳离子交换层析
52.(1)缓冲液准备：
53.a液：0.02m柠檬酸缓冲液，ph5.5
±
0.25。
54.b液：0.02m柠檬酸-0.5m氯化钠缓冲液，ph5.5
±
0.25。
55.c液：0.5m氢氧化钠-2m氯化钠溶液。
56.(2)样品准备：
57.将超滤-1工艺制备样品-超滤浓缩脱盐液1，用a液进行稀释，一般稀释至样品浓度为10-15mg/ml，样品ph5.5
±
0.25。
58.(3)阳离子交换层析步骤：
59.序号步骤缓冲液体积(cv)1)平衡a液3-52)上样样品根据载量计算3)冲洗a液34)洗脱c液3
60.实施例4将洗脱液进行超滤2处理
61.超滤浓缩：
62.将进液管、回流管放入样品中，透过管放入烧杯中，超滤泵转速为120rpm，转动回流管压力阀门，使入口压力维持在20psi以下，出口压力维持在5-10psi以下，浓缩样品至3-5l。
63.超滤脱盐：
64.向浓缩样品中加入等体积的超纯水，摇匀，超滤泵转速为120rpm，转动回流管压力阀门，使入口压力维持在20psi以下，出口压力维持在5-10psi以下，透过管放入烧杯中，重复稀释至回流液电导＜0.5ms/cm。
65.对实施例1-4最终得到的重组胶原蛋白进行电泳和hplc检测。结果见图1和图2，图1为实施例1-4最终得到的重组胶原蛋白的电泳图。图2为实施例1-4最终得到的重组胶原蛋白的hplc检测结果图。
66.实施例1-4各阶段重组胶原蛋白分离纯化收率见表1。
67.表1：为实施例1-4各阶段重组胶原蛋白分离纯化收率表
[0068][0069][0070]
实施例5重组人胶原蛋白肽促进细胞增殖活性
[0071]
目前现有技术中，重组人胶原蛋白的提纯手段多种多样，大部分都是在提纯的纯度上获得更好的技术效果，而往往忽视提纯后的活性。
[0072]
本实施例是对实施例4提取到的重组人胶原蛋白进行促进细胞增殖活性测定，具体步骤如下：
[0073]
(1)balb/c 3t3细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃，5％co2细胞培养箱培养20h。
[0074]
(2)用dmem无血清培养基继续培养12h。
[0075]
(3)实验组：在细胞培养板中分别加入20μl重组胶原蛋白溶液实施例4中纯化得到的重组胶原蛋白溶液(溶液中重组胶原蛋白浓度为10μg/ml)，继续培养36～72h。
[0076]
阴性对照组：用pbs溶液代替重组胶原蛋白溶液，继续培养36～72h。
[0077]
对比组：购买市售的胶原蛋白标准品进行对比组测试。
[0078]
(4)每孔加入10μl cck-8试剂，37℃，5％co2细胞培养箱孵育2h后取出。
[0079]
(5)用酶标仪读取96孔板在450nm和630nm的吸光值，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果。相对促细胞增殖率＝(实验组(对比组)450nm吸光值-阴性对照组450nm吸光值)/阴性对照组450nm吸光值
×
100％。
[0080]
结果显示：
[0081]
实验组：重组人胶原蛋白肽对balb/c 3t3细胞有良好的促增殖活性，最高促细胞增值率为41.6％。
[0082]
对比组：购买市售的胶原蛋白标准品对balb/c 3t3细胞也有良好的促增殖活性，最高促细胞增值率为35.3％。
[0083]
实施例6：重组人胶原蛋白肽促进细胞迁移活性测定(细胞划痕实验)
[0084]
6.1实验分组
[0085]
细胞：nih3t3
[0086]
设置实验对比
[0087]
1.实验组：实施例4中纯化得到的重组人胶原蛋白溶液(溶液浓度为10μg/ml)。
[0088]
2.对比组：购买市售的胶原蛋白标准品，配置胶原蛋白浓度为10μg/ml的溶液。
[0089]
时间：0h、10h、20h。
[0090]
6.2细胞复苏
[0091]
(1)将ddh2o预温至37℃。
[0092]
(2)戴上手套和口罩帽子，从液氮罐中取出装有目的细胞的冻存管(内有1ml细胞混合液)，立即投入37℃ddh2o中，轻摇冻存管使之在1分钟内快速溶解。
[0093]
(3)完全溶解后，75％酒精擦拭冻存管外壁消毒后带进超净台。
[0094]
(4)在超净台中，在15ml灭菌离心管中预先加入10ml新鲜配制的培养基，打开冻存管，将所有冻融的细胞悬液加入该离心管中，常温1000rpm离心3分钟，吸除上层的培养液。
[0095]
(5)1ml培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀后加入t25细胞培养瓶中，补足培养基至5ml，置于37℃、5％co2培养箱培养。
[0096]
(6)48小时后换液，细胞融合接近80％时即可传代。
[0097]
6.3细胞培养
[0098]
nih3t3细胞用含10％胎牛血清、1％双抗的dmem培养基，在37℃饱和湿度、含5％co2的孵箱中培养。
[0099]
6.4划痕实验
[0100]
(1)用marker笔在6孔板背后，用直尺对比，均匀地划线。
[0101]
(2)处理细胞前先按照实验要求对培养板进行包被。
[0102]
(3)消化收集处于对数生长期，生长状态良好的各组细胞，制备成细胞悬液，细胞计数；将细胞铺至6孔板中，每孔铺5
×
105个细胞，将6孔板置于37℃，5％co2培养箱中继续培养。
[0103]
(4)第二天，细胞生长密度接近100％，用10μl枪头紧贴直尺，垂直于maker笔标记的横线在孔中划线。
[0104]
(5)用pbs轻轻洗掉划痕附近脱落的细胞，加入无血清培养基，将6孔板至于显微镜下，找到取样点(划痕于孔底横线交叉处)，100
×
拍照，此时图像记录为0h。
[0105]
(6)将6孔板放回37℃，5％co2培养箱中培养，24h取出继续拍照。此后每隔24h采集一次图像。
[0106]
(7)使用gradpad进行数据分析。
[0107]
结果显示，实验组细胞中加入50μl浓度为10μg/ml重组人胶原蛋白肽培养24h后，划痕恢复显著快于对照组。通过计算划痕面积，结果表明，重组人胶原蛋白肽处理组细胞划痕恢复面积为93.16％，对照组为89.16％。
[0108]
具体结果见图3，从图3可以看出，本发明实施例4获得的纯化蛋白，活性比常规市售的重组胶原蛋白活性更好。
[0109]
实施例7：重组人胶原蛋白肽促进细胞粘附活性测定
[0110]
7.1实验分组
[0111]
细胞：nih3t3
[0112]
设置实验对比
[0113]
1.实验组：实施例4中纯化得到的重组人胶原蛋白溶液(溶液浓度为10μg/ml)。
[0114]
2.对比组：购买市售的胶原蛋白标准品，配置胶原蛋白浓度为10μg/ml的溶液。
[0115]
3.阴性对照组：用pbs溶液代替胶原蛋白溶液。
[0116]
时间：72h。
[0117]
7.2细胞复苏
[0118]
(1)将ddh2o预温至37℃。
[0119]
(2)戴上手套和口罩帽子，从液氮罐中取出装有目的细胞的冻存管(内有1ml细胞混合液)，立即投入37℃ddh2o中，轻摇冻存管使之在1分钟内快速溶解。
[0120]
(3)完全溶解后，75％酒精擦拭冻存管外壁消毒后带进超净台。
[0121]
(4)在超净台中，在15ml灭菌离心管中预先加入10ml新鲜配制的培养基，打开冻存管，将所有冻融的细胞悬液加入该离心管中，常温1000rpm离心3分钟，吸除上层的培养液。
[0122]
(5)1ml培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀后加入t25细胞培养瓶中，补足培养基至5ml，置于37℃、5％co2培养箱培养。
[0123]
(6)48小时后换液，细胞融合接近80％时即可传代。
[0124]
7.3细胞培养
[0125]
nih3t3细胞用含10％胎牛血清、1％双抗的dmem培养基，在37℃饱和湿度、含5％co2的培养箱中培养。
[0126]
7.4细胞处理及培养板处理
[0127]
(1)处理细胞前按照实验要求对24孔板进行包被。
[0128]
(2)取处于对数生长期，生长状态良好的细胞用0.25％胰酶消化后，细胞计数；
[0129]
(3)将细胞悬液接种于24孔板中，密度为4
×
104个/皿，根据细胞大小和形状调整接板细胞量；在37℃饱和湿度、含5％co2的培养箱中培养72h后使用移液器对细胞轻轻吹打，吹打前后拍照。
[0130]
(4)每孔加入10μl cck-8试剂，37℃，5％co2细胞培养箱孵育2h后取出。
[0131]
(5)用酶标仪读取96孔板在450nm和630nm的吸光值，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果。
[0132]
细胞粘附率＝(实验组(对比组)450nm吸光值-阴性对照组450nm吸光值)/阴性对照组450nm吸光值
×
100％。
[0133]
实验组细胞粘附率为76.3％，对比组细胞粘附率为62.3％。
[0134]
细胞粘附实验结果表明，实验组重组人胶原蛋白肽有较好的促细胞粘附效果，和市售胶原蛋白相比，本发明提纯后的重组人胶原蛋白肽促细胞粘附率更高。