用于递送药物活性剂的组合物和方法与流程

用于递送药物活性剂的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 usc 119(e)要求2020年4月29日提交的美国临时专利申请号63/017,281的优先权的权益，将其通过引用以其全文并入本文。
技术领域
3.本说明书涉及改性赖氨酸、包含这些改性赖氨酸的多肽以及这些多肽用于将药物活性剂、特别是遗传物质递送到细胞中的用途。本说明书进一步涉及这些多肽在疗法中的用途。


背景技术：

4.基因疗法是聚焦于将(外来)遗传物质(例如dna和rna)治疗性递送到患者细胞中以治疗疾病的医学领域。迄今为止，包括(rpe65突变诱导的失明)和(嵌合抗原受体t细胞疗法)在内的几种基因疗法已经获得了针对多种不同医学病症的监管批准。
5.基因递送是指用于将遗传物质引入细胞的过程。为了获得成功，遗传物质在运输期间必须保持稳定，并最终被内化到靶细胞中。当遗传物质是dna时，则其必须内化到靶细胞中并被传递到细胞核中。基因递送需要载体，而合适的载体通常分为两类：病毒载体和非病毒载体。
6.病毒介导的基因递送利用病毒将其dna注入到宿主细胞内的能力。遗传物质被包装成复制缺陷型病毒颗粒，以形成病毒载体。病毒方法是高效的，但可能诱导免疫应答。此外，这些方法只能将非常小块的遗传物质递送入细胞，生产病毒载体是劳动密集型的，并且存在随机插入位点、细胞病变效应和诱变的风险。
7.在结构通用性和可扩展性方面，在基因递送应用方面，合成载体与病毒载体相比具有多个优势；且合成载体可单独且特定设计以实现所希望的目的。可以设计这些物质以将遗传物质包装成纳米颗粒或囊泡，这些纳米颗粒或囊泡被工程化来克服与细胞摄取、运输到细胞溶质以及(如果需要)递送到细胞核相关的生物屏障。一种常见的方法是用材料(例如聚合物、肽或脂质，包含与阴离子核酸缔合的正电荷)将遗传物质包装成多分子组件。正负电荷之间的静电相互作用促使自组装成纳米结构或微粒结构，这些粒子的大小和形状可以由材料类型和冷凝条件控制(park等人，adv drug del rev[先进药物输送评论]，2006，58(4)：467-86)。
[0008]
例如，将dna配制成合适的载体(如纳米颗粒)显著提高对dna的细胞摄取(与对未配制的dna的摄取相比)。dna具有净负电荷，并且通常不会自己内化到细胞(其也具有净负电荷)中。未配制的dna也易引发导致其降解的免疫应答。将dna配制成合适载体可以中和其负电荷，并且保护其免受在细胞外空间的降解。
[0009]
为了使载体被有效的内化，必须使其经由称为内吞作用的过程运输到细胞中。在这个过程期间，载体被细胞膜的区域包围，然后其在细胞内出芽形成内体。必须设计载体以
允许该过程发生，但随后要降低被溶酶体截留(即隔离到酸性膜结合的溶酶体室中)的可能性。实现这一点的一种方法是确保在溶酶体运输发生前内体破裂。这可以通过载体缓冲内体ph(细胞摄取后内体变得愈发呈酸性)来实现，直到产生的渗透梯度导致内体破裂并将遗传物质释放到可以将其用于进行转录/翻译的细胞质中。在内体缓冲范围(ph 7.4-ph5.0)上具有有效的缓冲能力的合适的载体材料可以通过接受质子来减缓对内体的酸化，其导致更多的质子和反荷离子从细胞溶质中流入。
[0010]
目前的合成基因递送系统在体内受到遗传物质的低稳定性、高毒性和低效的细胞质进入的限制。将适用于基因递送的多功能材料工程化(在保持高递送效率的同时，实现配制品特性(大小、电荷等)、稳定性、缓冲能力和毒性之间的最佳平衡)已被证明是困难且复杂的，但这样将显著简化最终配制品。
[0011]
聚赖氨酸(pl)是携带游离胺侧臂的线性多肽，这些侧臂能与带负电荷的核酸相互作用，并经由静电相互作用形成复合物。因此，pl及其共聚物已在实验室中广泛用作非病毒基因递送中的载体。例如，当与氯喹等转染辅助剂偶联时(yamauchi等人，biomaterials[生物材料]，200324(24)：4495-4506)以及在作为嵌段共聚物或混杂系统的重要组分时(incani等人，acs appl.mater.interfaces[美国化学会应用材料与界面]，2009，1(4)：841-848)，pl基dna纳米颗粒已在多种细胞系中被证明为高效转染。pl也是可生物降解的，这有利于体内应用。然而，尽管可促进对dna的相似细胞摄取水平，但pl转染效率远低于其他阳离子聚合物转染剂(例如聚乙烯亚胺(pei))。这种低效率的转染与所产生的dna纳米颗粒无法从内体中逃逸(可能是因为其无法缓冲内体ph)有关(hwang等人，biomacro[生物大分子]，2014，15(10)：2577-86)。
[0012]
并入可质子化基团(pka＜6.5)如咪唑或组氨酸已显示出增强pl纳米颗粒的转染(roufai等人，bioconjug.chem[生物缀合化学]，200112(1)：92-99，以及hwang等人，biomacro[生物大分子]，2014，15(10)：2577-86)；然而，为了确保中性ph时的纳米颗粒稳定性，必须在pka高于和低于7.4的可质子化基团之间保持重要平衡。例如，之前的研究(benns等人，bioconjug.chem[生物缀合化学]，2000，11(5)：637-45)已经探索了氨基酸组氨酸(pka＝6)作为功能基团以改善pl缓冲。将组氨酸接枝到聚赖氨酸上已显示将缓冲能力提高到相对于pl的高达3.5倍。benns还将聚组氨酸接枝到其他聚合物上，并报告了更大的缓冲增强(约4.5倍(hwang等人，biomacro[生物大分子]，2014，15(10)：2577-86)以及转染的显著改善。
[0013]
本技术描述了某些可用于形成改性pl的改性赖氨酸，当与未改性pl相比时，改性pl对遗传物质的递送效率提高。这些改性pl是独特的，在于它们具有多功能性，不同于组氨酸改性，只促进了内体缓冲。这些改性pl：i)具有增强的缓冲特性，调整至可在细胞内化和溶酶体运输期间出现的ph转变期间实现质子化，ii)由于通过静电和非静电(例如pi-pi堆叠)相互作用增加核酸结合而更加稳定和/或iii)当使用基于代谢物的核心单元时，具有增加的生物相容性，这些核心单元是天然存在的，并且具有毒性或免疫原性的可能性较低。这些改性pl与质粒dna形成纳米颗粒(类似于与未改性pl形成的纳米颗粒(约100nm，球体、棒体和超环状体))，并显示在小鼠静脉注射后血清稳定性较高且血液循环延长，无相关毒性。它们通过不易解离来保护被包裹的遗传物质并保持较长循环时间。
[0014]
本文所述的改性赖氨酸是多功能单元，其可并入载体中并改善合成基因递送系统
的转染，同时维持高生物相容性。


技术实现要素：

[0015]
此说明书部分地描述了一种具有式(i)的改性赖氨酸：
[0016][0017]
其中：
[0018]
a是键、c
1-6
亚烷基、碳环基或杂环基；其中所述碳环基或杂环基可任选地在碳上被一个或多个r2取代；并且其中如果所述杂环基含有-nh-部分，则氮可任选地被选自ra的基团取代；
[0019]
q是键、碳环基或杂环基；其中所述碳环基或杂环基可任选地在碳上被一个或多个r3取代；并且其中如果所述杂环基含有-nh-部分，则氮可任选地被选自rb的基团取代；
[0020]
环b是吗啉基或硫代吗啉基；其中如果所述吗啉基或硫代吗啉基含有-nh-部分，则氮可任选地被选自rc的基团取代；
[0021]
r1、r2和r3各自独立地选自卤代、硝基、氰基、羟基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、羧基、氨甲酰基、巯基、氨磺酰基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、n-甲基-n-乙基氨基、乙酰基氨基、n-甲基氨甲酰基、n-乙基氨甲酰基、n，n-二甲基氨甲酰基、n，n-二乙基氨甲酰基、n-甲基-n-乙基氨甲酰基、甲基硫代、乙基硫代、甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、甲磺酰基、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、n-甲基氨磺酰基、n-乙基氨磺酰基、n，n-二甲基氨磺酰基、n，n-二乙基氨磺酰基以及n-甲基-n-乙基氨磺酰基；
[0022]
n是0-4；
[0023]
ra、rb和rc独立地选自甲基、乙基、丙基、异丙基、乙酰基、甲磺酰基、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、氨甲酰基、n-甲基氨甲酰基、n-乙基氨甲酰基、n，n-二甲基氨甲酰基、n，n-二乙基氨甲酰基和n-甲基-n-乙基氨甲酰基。
[0024]
本说明书还部分地描述了包含如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0025]
本说明书还部分地描述了如本文所述的多肽，该多肽用于作为药物递送系统使用。
[0026]
本说明书还部分地描述了一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的多肽，和药物活性剂。
[0027]
本说明书还部分地描述了一种在温血动物(例如人)中的疗法方法，该方法包括向所述动物施用有效量的如本文所述的药物组合物。
具体实施方式
[0028]
本发明的许多实施例在整个说明书中详细描述，并且对于本领域有技术的读者而
言将是明显的。本发明不应被解释为限于任何所述的实施例。
[0029]“一个/种(a)”意指“至少一个/种”。在任何实施例中，在使用“一个/种(a)”表示给定材料或元素时，“一个/种(a)”可以意指一个/种。
[0030]“包含”意指给定的材料或元素可含有其他材料或元素。在任何实施例中，在提及“包含”时，给定材料或元素可由该材料或元素的至少10％w/w、至少20％w/w、至少30％w/w或至少40％w/w组成。在任何实施例中，在提及“包含”时，“包含”还可以意指“由给定材料或元素组成”(“consisting of”或“consists of”)或“基本上由给定材料或元素组成”(“consisting essentially of”或“consists essentiallyof”)。
[0031]“由
……
组成”意指给定的材料或元素完全由该材料或元素组成。在任何实施例中，在提及“由
……
组成”时，给定材料或元素可以由该材料或元素的100％w/w组成。
[0032]“基本上由
……
组成”意指给定的材料或元素几乎完全由该材料或元素组成。在任何实施例中，在提及“基本上由
……
组成”时，给定材料或元素可以由该材料或元素的至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w、至少90％w/w、至少95％w/w或至少99％w/w组成。
[0033]
在任何实施例中，在用“是”或“可为”来定义材料或元素时，“是”或“可为”可以意指该材料或元素“由该材料或元素组成”或“基本上由该材料或元素组成”。
[0034]
在本说明书的任何实施例中，在提及“约”时，“约”可以意指所引用数字的 /-0％(即无差异)、 /-0.01％、 /-0.05％、 /-0.1％、 /-0.5％、 /-1％、 /-2％、 /-5％、 /-10％或 /-20％。当一个数字被引用时，在另一实施例中这进一步是指大约为所引用的数字。
[0035]
权利要求是实施例。
[0036]
本文披露了一种具有式(i)的改性赖氨酸：
[0037][0038]
其中a、q、b、r1和n如本文所述。
[0039]
在一个实施例中，a是键。
[0040]
在一个实施例中，a是c
1-6
亚烷基。
[0041]
在一个实施例中，a是亚甲基。
[0042]
在一个实施例中，a是碳环基；其中所述碳环基可任选地在碳上被一个或多个r2取代。
[0043]
在一个实施例中，a是杂环基；其中所述杂环基可任选地在碳上被一个或多个r2取代；并且其中如果所述杂环基含有-nh-部分，则氮可任选地被选自ra的基团取代。
[0044]
在一个实施例中，a是杂环基。
[0045]
在一个实施例中，a是吡啶基。
[0046]
在一个实施例中，a是键、c
1-6
亚烷基或杂环基。
[0047]
在一个实施例中，a是键、亚甲基或吡啶基。
[0048]
在一个实施例中，q是键。
[0049]
在一个实施例中，q是碳环基；其中所述碳环基可任选地在碳上被一个或多个r3取代。
[0050]
在一个实施例中，q是杂环基；其中所述杂环基可任选地在碳上被一个或多个r3取代；并且其中如果所述杂环基含有-nh-部分，则氮可任选地被选自rb的基团取代。
[0051]
在一个实施例中，环b是吗啉基。
[0052]
在一个实施例中，环b是吗啉基；其中如果所述吗啉基含有-nh-部分，则氮可任选地被选自rc的基团取代。
[0053]
在一个实施例中，环b是硫代吗啉基。
[0054]
在一个实施例中，环b是硫代吗啉基；其中如果所述硫代吗啉基含有-nh-部分，则氮可任选地被选自rc的基团取代。
[0055]
在一个实施例中，r1是卤代。
[0056]
在一个实施例中，n是0。
[0057]
在一个实施例中，n是1。
[0058]
在一个实施例中，n是2。
[0059]
在一个实施例中，n是3。
[0060]
在一个实施例中，n是4。
[0061]
在一个实施例中，提供了一种具有式(i)的改性赖氨酸，其中
[0062]
a是键、c
1-6
亚烷基或杂环基；
[0063]
q是键；
[0064]
环b是吗啉基或硫代吗啉基；并且
[0065]
n是0。
[0066]
在一个实施例中，提供了一种具有式(i)的改性赖氨酸，其中
[0067]
a是键、亚甲基或吡啶基；
[0068]
q是键；
[0069]
环b是吗啉基或硫代吗啉基；并且
[0070]
n是0。
[0071]
在本发明的一个方面，具有式(i)的改性赖氨酸是具有式(ia)的改性赖氨酸：
[0072][0073]
其中a、q、b、r1和n如本文所述。具有式(ia)的改性赖氨酸也可称为改性d-赖氨酸。
[0074]
在本发明的一个方面，具有式(i)的改性赖氨酸是具有式(ib)的改性赖氨酸：
[0075][0076]
其中a、q、b、r1和n如本文所述。具有式(ib)的改性赖氨酸也可称为改性l-赖氨酸。
[0077]
在本发明的一个方面，具有式(i)的改性赖氨酸选自：
[0078]
2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
[0079]
2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；和
[0080]
2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰氨基]己酸。
[0081]
在本发明的一个方面，具有式(i)的改性赖氨酸选自：
[0082]
(r)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
[0083]
(r)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；和
[0084]
(r)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰氨基]己酸。
[0085]
在本发明的一个方面，具有式(i)的改性赖氨酸选自：
[0086]
(s)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
[0087]
(s)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；和
[0088]
(s)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰氨基]己酸。
[0089]
在本发明的一个方面，具有式(i)的改性赖氨酸选自：
[0090]
2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
[0091]
2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；和
[0092]
2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰氨基]己酸，
[0093]
其呈盐的形式。
[0094]
在本发明的一个方面，具有式(i)的改性赖氨酸选自：
[0095]
(r)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
[0096]
(r)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；和
[0097]
(r)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰氨基]己酸，
[0098]
其呈盐的形式。
[0099]
在本发明的一个方面，具有式(i)的改性赖氨酸选自：
[0100]
(s)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸；
[0101]
(s)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸；和
[0102]
(s)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰氨基]己酸，
[0103]
其呈盐的形式。
[0104]
如本文所用，术语“被取代”当指化学基团时，意指该化学基团具有一个或多个氢原子，该一个或多个氢原子被去除并被取代基替代。如本文所用，术语“取代基”具有本领域已知的普通含义，并且是指共价附接到亲本基团的化学部分。如本文所用，术语“任选地经取代的”意指化学基团可不具有取代基(即未取代的)或可具有一个或多个取代基(即经取代的)。应理解的是，给定原子处的取代受化合价限制。在任选的取代基选自基团的列表的
情况下，应理解的是，该定义包括选自指定基团之一的所有取代基或选自两个或更多个指定基团的取代基。在可能存在不止一个相同取代基的情况下，例如r2，应理解的是，该定义还包括选自指定基团之一的所有此类取代基或选自两个或更多个指定基团的取代基。
[0105]
如本文所用，术语“c
i-j”表示碳原子数的范围，其中i和j是整数，并且碳原子数的范围包括端点(即i和j)和介于两者之间的每个整数点，并且其中j大于i。例如，c
1-6
表示一到六个碳原子的范围，包括一个碳原子、两个碳原子、三个碳原子、四个碳原子、五个碳原子和六个碳原子。在一些实施例中，术语“c
1-6”表示1到6、1到5、1到4、1到3或1到2个碳原子。
[0106]
如本文所用，术语“烷基”(无论是作为另一个术语的一部分还是独立地使用)是指饱和烃链。上述烃链可以是直链或支链。术语“c
i-j
烷基”是指具有i到j个碳原子的烷基。c
1-6
烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；更高级的同系物，例如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1，2，2-三甲基丙基等。对“丁基”等基团的提及(未作进一步限制)是指所有形式的丁基，例如正丁基和叔丁基等。
[0107]
如本文所用，术语“亚烷基”(无论是作为另一个术语的一部分还是独立地使用)是指饱和烃链。上述烃链可以是直链或支链。术语“c
i-j
亚烷基”是指具有i到j个碳原子的烷基。c
1-6
亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(-ch
2-)、亚乙基(-ch
2-ch
2-)、亚丙基(-ch
2-ch
2-ch
2-)和亚丁基(-ch
2-ch
2-ch
2-ch
2-和-ch
2-ch(ch3)-ch
2-等)等。
[0108]
如本文所用，术语“卤代”是指氟、氯、溴和碘。
[0109]“杂环基”是含有4-12个原子的饱和的、部分饱和的或不饱和的单环或双环，该4-12个原子中的至少有一个原子选自氮、硫或氧，除非另有规定，否则该杂环基可以是碳或氮连接的，其中，-ch2-基团可任选地被-c(o)-替代，并且环硫原子可任选地氧化形成s-氧化物。术语“杂环基”的实例和合适的值是吗啉代、哌啶基、吡啶基、吡喃基、吡咯基、吡唑基、异噻唑基、吲哚基、喹啉基、噻吩基、1，3-苯并二氧杂环戊烯基、噻二唑基、哌嗪基、噻唑烷基、吡咯烷基、硫代吗啉代、吡咯啉基、高哌嗪基、3，5-二氧杂哌啶基、四氢吡喃基、咪唑基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、异噁唑基、n-甲基吡咯基、4-吡啶酮、1-异喹啉酮、2-吡咯烷酮和4-噻唑烷酮。术语“杂环基”的具体实例是吡啶基。在本发明的一个方面，“杂环基”是含有5或6个原子的饱和的、部分饱和的或不饱和的单环，该5或6个原子中的至少一个原子选自氮、硫或氧，除非另有规定，否则该杂环基可以是碳或氮连接的，-ch
2-基团可任选地被-c(o)-替代，并且环硫原子可任选地氧化形成s-氧化物。
[0110]“碳环基”是含有3-12个原子的饱和的、部分饱和的或不饱和的单环或双环碳环；其中-ch
2-基团可任选地被-c(o)-替代。在一个实施例中，“碳环基”是含有5或6个原子的单环或含有9或10个原子的双环。“碳环基”的合适的值包括环丙基、环丁基、1-氧代环戊基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、苯基、萘基、萘满基、茚满基或1-氧代茚满基。“碳环基”的具体实例是苯基。
[0111]
本披露的“化合物”涵盖化合物中的原子的所有同位素。原子的同位素包括原子数相同但质量数不同的原子。例如，除非另有规定，本披露“化合物”中的氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴或碘还旨在包括其同位素，例如但不限于：1h、2h、3h、
11
c、
12
c、
13
c、
14
c、
14
n、
15
n、
16
o、
17
o、
18
o、
31
p、
32
p、
32
s、
33
s、
34
s、
36
s、
17
f、
19
f、
35
cl、
37
cl、
79
br、
81
br、
127
i和
131
i。在一些实施例中，氢包括氕、氘和氚。在一些实施例中，氢是指氕。在一些实施例中，氢是指氘。在一些实施例中，氢是指氚。在一些实施例中，术语“被氘取代”或“氘取代的”用氘替代化学基团中的氢的其
他异构体(例如氕)。在一些实施例中，碳包括
12
c和
13
c。
[0112]
残基
[0113]
本文所述多肽中的氨基酸经由α-氨基基团和羧基基团之间的肽键连接在一起形成链。一旦在链中连接，单独的氨基酸被称为“残基”。
[0114]
改性赖氨酸
[0115]
在任何实施例中，在提及改性赖氨酸或改性赖氨酸残基时，这些是指根据式(i)改性的赖氨酸及其实施例。
[0116]
在任何实施例中，在提及改性赖氨酸或改性赖氨酸残基时，这可以指改性d-赖氨酸。
[0117]
在任何实施例中，在提及改性赖氨酸或改性赖氨酸残基时，这可以指改性l-赖氨酸。
[0118]
在任何实施例中，在提及改性赖氨酸或改性赖氨酸残基时，这可以指呈盐形式的改性赖氨酸或改性赖氨酸残基。
[0119]
如本文所用，“盐形式”是指本文所述的改性赖氨酸、改性赖氨酸残基或多肽的衍生物，其中通过将一个或多个现有的酸性部分(例如羧基等)和/或碱性部分(例如胺、碱等)转化为其盐形式来改性亲本化合物。在许多情况下，由于氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在，本披露的化合物能够形成酸盐和/或碱盐。特定的盐形式是药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是安全且有效地用于在哺乳动物，特别是人类中使用的盐。
[0120]
本文所述的改性赖氨酸、改性赖氨酸残基或多肽的合适的盐形式包括例如酸加成盐，该酸加成盐可衍生自例如无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)或有机酸(例如，甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、均苯三甲酸、柠檬酸、乳酸、苯乙酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、萘二磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、水杨酸、磺基水杨酸等)。特定的酸加成盐是指盐酸盐。
[0121]
本文所述的改性赖氨酸、改性赖氨酸残基或多肽的合适的盐形式包括例如碱加成盐，该碱加成盐可衍生自例如无机碱(例如，钠、钾、铵盐和来自周期表第i至xii列的金属(例如钙、镁、铁、银、锌、铜等)的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐)或有机碱(例如伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代胺)、环胺、碱性离子交换树脂等)。某些有机胺包括但不限于异丙基胺、苄星青霉素(benzathine)、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。另外的合适盐的列表可以例如见于以下中：“remington
′
s pharmaceutical sciences[雷明顿药物科学]”，第20版，mack publishing company[麦克出版公司]，宾夕法尼亚州伊斯顿，(1985)；也见于stahl和wermuth的“handbook of pharmaceutical salts：properties，selection，and use[药用盐手册：特性、选择和使用]”(wiley-vch[wiley-vch出版社]，德国魏因海姆，2002)中。
[0122]
多肽
[0123]
在本发明的另一个特征中，提供了包含如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。在本文中提及多肽时，这是指氨基酸残基链。
[0124]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指经由允许精确控制其组合物和纯度的技术合成的多肽。合适的技术包括固相肽合成。
[0125]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指经由聚合反应合成的多肽。合适的技术包括加聚或缩聚。
[0126]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指氨基酸残基的连续的、且未分支的链。
[0127]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含2-1000个氨基酸残基的多肽。
[0128]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含2-50个氨基酸残基的多肽。
[0129]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含10-500个氨基酸残基的多肽。
[0130]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含15-40个氨基酸残基的多肽。
[0131]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含20-100个氨基酸残基的多肽。
[0132]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含20-50个氨基酸残基的多肽。
[0133]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含25-1000个氨基酸残基的多肽。
[0134]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含25-500个氨基酸残基的多肽。
[0135]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含25-100个氨基酸残基的多肽。
[0136]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含25-40个氨基酸残基的多肽。
[0137]
在任何实施例中，在提及多肽时，这可以指包含30-40个氨基酸残基的多肽。
[0138]
在任何实施例中，在提及多肽时，多肽可呈盐形式。
[0139]
聚赖氨酸
[0140]
聚赖氨酸是包含两个或更多个改性赖氨酸残基或赖氨酸和改性赖氨酸残基的混合物的多肽，其中链中的肽键在赖氨酸残基和/或改性赖氨酸残基的α-羧基基团和α-氨基基团之间形成，并且其中所有氨基酸残基均选自改性赖氨酸残基或赖氨酸和改性赖氨酸残基的混合物。
[0141]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指其中所有改性赖氨酸残基相同的聚赖氨酸。
[0142]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含两个或更多个不同改性赖氨酸残基的聚赖氨酸。
[0143]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指聚-d-赖氨酸。
[0144]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指聚-l-赖氨酸。
[0145]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指外消旋聚赖氨酸。
[0146]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指聚-l/d-赖氨酸。
[0147]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含2-1000个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0148]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含2-50个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0149]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含10-500个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0150]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含15-40个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0151]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含20-100个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0152]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含20-50个氨基酸残基的聚赖氨
酸。
[0153]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含25-1000个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0154]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含25-500个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0155]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含25-100个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0156]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含25-40个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0157]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含30-40个氨基酸残基的聚赖氨酸。
[0158]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，该聚赖氨酸可呈盐形式。
[0159]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过10％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0160]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过20％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0161]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过30％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0162]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过40％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0163]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过50％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0164]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过60％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0165]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过70％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0166]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过80％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0167]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中超过90％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0168]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于10％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0169]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于20％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0170]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于30％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0171]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于40％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0172]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于50％的赖氨酸残基可为改
性赖氨酸残基。
[0173]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于60％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0174]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于70％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0175]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于80％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0176]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中少于90％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0177]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中10％-90％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0178]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中10％-80％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0179]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中10％-70％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0180]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中20％-60％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0181]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中25％-50％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0182]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，聚赖氨酸中25％-40％的赖氨酸残基可为改性赖氨酸残基。
[0183]
末端氨基基团可任选地为改性氨基基团
[0184]
在一个实施例中，多肽的末端氨基基团可为未改性的。未改性末端氨基基团意指该基团是-nh2基团。
[0185]
在一个实施例中，多肽的末端氨基基团可为未改性氨基基团。
[0186]
改性通常是化学改性，其包括但不限于添加化学基团、产生新键和去除化学基团。改性氨基基团为本领域技术人员所熟知，并且包括但不限于乙酰化、脱氨基、n-低级烷基、n-二低级烷基、受限烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和n-酰基改性。改性氨基基团还可包括但不限于内部酰胺键，该内部酰胺键涉及n-末端(例如焦谷氨酸(pyroglu))保护的氨基基团或者附接放射性标记、荧光标签或亲和标签(例如生物素)或靶向细胞的配体。
[0187]
靶向细胞的配体是指与细胞结合和/或促进细胞内化的靶向部分。靶向细胞的配体可包括但不限于基于多肽的材料，例如环rgd、转铁蛋白受体结合肽、抗体或细胞穿透肽、糖类或小分子(如叶酸)。
[0188]
氨基基团的合适保护基团是，例如酰基基团，例如烷酰基基团，例如乙酰基；烷氧基羰基基团，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基基团；芳基甲氧基羰基基团，例如苯甲氧基羰基；或芳酰基基团，例如苯甲酰基。特定的改性氨基基团是酰氨基。特定的改性氨基基团是乙酰氨基。
[0189]
低级烷基为c
1-4
烷基，包括叔丁基、丁基、丙基、异丙基、乙基和甲基。
[0190]
在一个实施例中，多肽的末端氨基基团可通过添加另一个聚合物(任选地经由连
接基团)来改性。
[0191]
在一个实施例中，可通过添加聚乙二醇聚合物，任选地经由连接基团，来使多肽的末端氨基基团改性以形成聚乙二醇聚赖氨酸。
[0192]
末端羧基基团可任选地为改性羧基基团
[0193]
在一个实施例中，多肽的末端羧基基团为未改性的。未改性末端羧基基团意指该基团是-c(o)oh基团。
[0194]
在一个实施例中，多肽的一个末端羧基基团为改性羧基基团。
[0195]
改性通常是化学改性，其包括但不限于添加化学基团、产生新键和去除化学基团。改性羧基基团为本领域技术人员所熟知，并且包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、受限烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)、二烷基酰胺和低级烷基酯改性。改性羧基基团还可包括但不限于受保护的羧基基团或者附接放射性标记、荧光标签或亲和标签(例如生物素)或靶向细胞的配体。羧基基团的合适保护基团是，例如酯化基团，例如甲基乙基基团、叔丁基基团或苄基基团。特定的改性羧基基团是-co2nh2。特定的改性羧基基团是c-末端酰胺化。特定的改性羧基基团是甲酰胺基团。特定的改性羧基基团是n-(c
1-4
烷基)氨甲酰基基团。
[0196]
在一个实施例中，多肽的末端羧基基团可通过添加另外的聚合物(任选地经由连接基团)来改性。
[0197]
在一个实施例中，可通过添加聚乙二醇聚合物，任选地经由连接基团，来使多肽的末端羧基基团改性以形成聚乙二醇聚赖氨酸。
[0198]
聚乙二醇聚赖氨酸
[0199]
聚乙二醇(peg)是由n》3的-(och2ch2)
n-重复亚基组成的聚合物。通常使用环氧乙烷的开环聚合合成。
[0200]
在任何实施例中，在提及聚乙二醇聚赖氨酸时，这是指包含聚乙二醇聚合物和聚赖氨酸多肽的多肽。
[0201]
在任何实施例中，在提及聚乙二醇聚赖氨酸时，这可以是包含具有式(ic)结构的聚乙二醇聚赖氨酸：
[0202][0203]
具有式(ic)的特定的聚乙二醇聚赖氨酸是例如
[0204][0205]
在任何实施例中，在提及聚乙二醇聚赖氨酸时，这可以是包含具有式(id)结构的聚乙二醇聚赖氨酸：
[0206][0207]
具有式(id)的特定的聚乙二醇聚赖氨酸是例如
[0208][0209]
在任何实施例中，在提及聚乙二醇聚赖氨酸时，这可以是包含具有式(ie)结构的聚乙二醇聚赖氨酸：
[0210][0211]
具有式(ie)的特定的聚乙二醇聚赖氨酸是例如
[0212][0213]
在任何实施例中，在提及聚乙二醇聚赖氨酸时，这可以是包含具有式(if)结构的聚乙二醇聚赖氨酸：
[0214]
[0215]
具有式(if)的特定的聚乙二醇聚赖氨酸是例如
[0216][0217]
在任何实施例中，在提及聚乙二醇聚赖氨酸时，在末端之一处可以存在改性，或末端可为氢。聚乙二醇末端合适的改性是例如c
1-4
烷基，例如甲基；或c
1-4
烷氧基，例如甲氧基。
[0218]
在任何实施例中，在提及peg时，peg可在未附接到聚赖氨酸的末端上具有反应基团。合适的反应基团包括马来酰亚胺、叠氮化物、炔烃(例如c
2-6
炔烃)和环戊二烯。在peg缀合到多肽之前或之后，该反应基团可用于附接放射性标记、染料和靶向细胞的配体等种类。
[0219]
在任何实施例中，在提及聚乙二醇聚赖氨酸时，在两个末端处均可以存在改性。
[0220]
在任何实施例中，在提及聚乙二醇聚赖氨酸时，在聚乙二醇和聚赖氨酸聚合物之间可存在连接基团。合适的连接基团为c
1-4
烷基氨基，例如-ch
2-ch
2-nh-(形成例如peg-ch
2-ch
2-nh-pl多肽或peg-nh-ch
2-ch
2-pl多肽)；或c
1-4
亚烷基，例如-ch
2-ch
2-(形成例如peg-ch
2-ch
2-pl多肽)。
[0221]
在任何实施例中，在提及peg时，这可以指分子量范围在0.5-30kda之间的聚合物。
[0222]
在任何实施例中，在提及peg时，这可以指分子量范围在2-20kda之间的聚合物。
[0223]
在任何实施例中，在提及peg时，这可以指分子量范围在4-11kda之间的聚合物。
[0224]
在任何实施例中，在提及peg时，这可以指分子量范围在1-6kda之间的聚合物。
[0225]
在任何实施例中，在提及peg时，这可以指分子量范围为约2kda的聚合物。
[0226]
在任何实施例中，在提及peg时，这可以指分子量范围为约5kda的聚合物。
[0227]
在任何实施例中，在提及peg时，这可以指分子量范围为约10kda的聚合物。
[0228]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指聚乙二醇聚-d-赖氨酸。
[0229]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指聚乙二醇聚-l-赖氨酸。
[0230]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指聚乙二醇聚-l/d-赖氨酸。
[0231]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含2-1000个赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0232]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含2-1000个改性赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0233]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含10-500个赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0234]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含10-500个改性赖氨酸残基的
聚乙二醇聚赖氨酸。
[0235]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含20-100个赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0236]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含20-100个改性赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0237]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含20-50个赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0238]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含20-50个改性赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0239]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含25-40个赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0240]
在任何实施例中，在提及聚赖氨酸时，这可以指包含25-40个改性赖氨酸残基的聚乙二醇聚赖氨酸。
[0241]
药物活性剂
[0242]
本文所述的组合物和方法适用于递送药物活性剂。药物活性剂是能够对人体或动物体发挥药理作用，从而导致治疗结果的任何物质。
[0243]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自遗传物质、化学改性核酸、治疗性肽、化疗剂、蛋白质、蛋白质缀合物、显像剂、与crispr技术相关的蛋白质核酸、以及天然病毒组分，如衣壳或酶。
[0244]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自遗传物质。
[0245]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自遗传物质(例如dna或rna)。
[0246]
在任何实施例中，在提及dna时，这可以是质粒、线性dna、单链dna、微环和微串等最小化载体、折叠dna(包括发夹结构和十字形dna)、以及病毒衍生dna。
[0247]
在任何实施例中，在提及rna时，这可以是mrna或sirna。
[0248]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自dna。
[0249]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自rna。
[0250]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自化学改性核酸。
[0251]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自治疗性肽。
[0252]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自化疗剂。
[0253]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自蛋白质。
[0254]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自蛋白质缀合物。
[0255]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自显像剂。
[0256]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自与crispr技术相关的蛋白质核酸。
[0257]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自天然病毒组分，如衣壳或酶。
[0258]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码治疗性蛋白质(例如单克隆抗体)的核酸(即质粒和mrna)，例如，阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗
(adalimumab)、阿法塞特(alefacept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、卡那单抗(canakinumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(inflectra)、伊匹单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、苏金单抗(secukinumab)、以及优特克单抗(ustekinumab)；酶，例如，阿加糖酶β(agalsidase beta)、伊米苷酶(imiglucerase)、维拉苷酶α(velaglucerase alfa)、他利苷酶(taliglucerase)、阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa)、阿葡糖苷酶α、拉罗尼酶(laronidase)、静脉注射艾杜硫酶(idursulfase intravenous)、以及加硫酶(galsulfase)；生长因子；和细胞因子，例如il-2和ifn-α。
[0259]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码治疗性蛋白质(例如单克隆抗体)的核酸(即质粒和mrna)；酶；生长因子；和细胞因子。
[0260]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码单克隆抗体的核酸(即质粒和mrna)。
[0261]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码单克隆抗体的核酸(即质粒和mrna)，该单克隆抗体可选自阿昔单抗、阿达木单抗、阿法塞特、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝洛托舒单抗、卡那单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、达克珠单抗、地诺单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、伊匹单抗、依奇珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、奥拉单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、苏金单抗、以及优特克单抗。
[0262]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码酶的核酸(即质粒和mrna)。
[0263]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码酶的核酸(即质粒和mrna)，该酶可选自阿加糖酶β、伊米苷酶、维拉苷酶α、他利苷酶、阿葡糖苷酶α、阿葡糖苷酶α、拉罗尼酶、静脉注射艾杜硫酶、以及加硫酶。
[0264]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码生长因子的核酸(即质粒和mrna)。
[0265]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码细胞因子的核酸(即质粒和mrna)。
[0266]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自编码选自il-2和ifn-α的细胞因子的核酸(即质粒和mrna)。
[0267]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自sirna。
[0268]
在任何实施例中，在提及药物活性剂时，该药物活性剂可选自sirna，该sirna用于降低包括调节致癌基因、生长因子和细胞因子表达的应用中的蛋白质表达。
[0269]
配制品
[0270]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多
肽的药物递送系统。药物递送系统是可用于将药物活性剂递送到人体或动物体内的递送系统。
[0271]
在一个实施例中，提供了如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基在药物递送系统中的用途。
[0272]
在一个实施例中，提供了如本文所述的多肽在药物递送系统中的用途。
[0273]
在一个实施例中，提供了如本文所述的多肽，该多肽用于作为药物递送系统使用。
[0274]
在一个实施例中，提供了用于药物活性剂的递送系统，该系统包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0275]
包含如本文所述的改性赖氨酸残基的多肽与药物活性剂可以组合，同时在生理等渗缓冲液(例如5％海藻糖或蔗糖、20mm hepes或磷酸盐缓冲盐水(pbs))中轻轻混合以形成纳米颗粒。这些配制品可立即递送、储存在4℃或冻干用于长期储存。
[0276]
包含如本文所述的改性赖氨酸残基的多肽可以如下形式制备：适用于口服施用的形式，例如，作为片剂或胶囊；适用于肠胃外注射(包括静脉内、皮下、皮内、肌内、血管内注射或输注)的形式；适用于局部施用的形式，如软膏或乳膏；或适用于直肠施用的形式，如栓剂。特别地，包含如本文所述的改性赖氨酸残基的多肽可以以适用于注射(例如，通过静脉内、皮下、皮内或肌内注射)的形式制备。
[0277]
用途
[0278]
包含如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽可以用于递送适合治疗广泛疾病的药物活性剂，这些疾病包括代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、吸收不良障碍。治疗性应用可包括：蛋白质(即用于病毒治疗的抗体)的系统表达或靶向递送(即转移性肿瘤，体内car-t)。
[0279]
在一个实施例中，提供了用于在疗法中使用的药物递送系统，该系统包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0280]
在一个实施例中，提供了用于在疗法中使用的用于药物活性剂的递送系统，该系统包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0281]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽的药物递送系统，该系统用于在治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍中使用。
[0282]
在一个实施例中，提供了用于药物活性剂的递送系统(包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽)，该系统用于在治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍中使用。
[0283]
在一个实施例中，提供了用于在基因疗法中使用的用于药物活性剂的递送系统，该系统包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0284]
如本文所用，如本文所述的术语“治疗(treatment和treat)”是指逆转、缓解、延迟疾病或障碍或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或障碍或其一种或多种症状的进展。在一些实施例中，治疗可在一个或多个症状已经出现之后进行。在其他实施例中，可以在没有
症状的情况下进行治疗。例如，可在症状发作之前(例如，以症状的病史为根据和/或以遗传或其他易感因素为根据)对易感个体进行治疗。症状消退后也可继续治疗，例如以防止或延迟它们复发。
[0285]
药物组合物
[0286]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽的药物组合物。
[0287]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽、和药物活性剂的药物组合物。
[0288]
在一个实施例中，提供了用于在疗法中使用的药物组合物，其包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0289]
在一个实施例中，提供了用于在疗法中使用的药物组合物，其包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽、和药物活性剂。
[0290]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽的药物组合物，该药物组合物用于在治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍中使用。
[0291]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽、和药物活性剂的药物组合物，该药物组合物用于在治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍中使用。
[0292]
在一个实施例中，提供了用于在基因疗法中使用的药物组合物，其包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽、和药物活性剂。
[0293]
在一个实施例中，提供了用于在基因疗法中使用的药物组合物，其包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0294]
治疗方法
[0295]
在一个实施例中，提供了在温血动物(例如人)中治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍的方法，该方法包括向所述动物施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0296]
在一个实施例中，提供了在温血动物(例如人)中治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍的方法，该方法包括向所述动物施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽、和药物活性剂。
[0297]
在一个实施例中，提供了一种基因疗法方法，该方法包括施用包含如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽。
[0298]
在一个实施例中，提供了一种基因疗法方法，该方法包括施用包含如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽、和药物活性剂。
[0299]
药物组合物的用途
[0300]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽的药物组合物在制造用于治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍的药物中的用途。
[0301]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽、和药物活性剂的药物组合物在制造用于治疗代谢障碍、免疫学障碍、激素障碍、癌症、血液障碍、遗传障碍、传染性疾病、心脏疾病、骨障碍、呼吸障碍、神经障碍、辅助疗法、眼部障碍、或吸收不良障碍的药物中的用途。
[0302]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽的药物组合物在基因疗法中的用途。
[0303]
在一个实施例中，提供了包含含有如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽、和药物活性剂的药物组合物在基因疗法中的用途。
[0304]
试剂盒
[0305]
在一个实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包含：
[0306]
a)第一单元中的包含如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽；
[0307]
b)第二单元中的药物活性剂；以及
[0308]
c)含有所述第一和第二单元的容器装置。
[0309]
在一个实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包含：
[0310]
a)第一单元中的包含如本文所述的一个或多个改性赖氨酸残基的多肽；
[0311]
b)第二单元中的药物活性剂；以及
[0312]
c)含有所述第一和第二单元的容器装置。
[0313]
d)使用说明书。
附图说明
[0314]
图1a：显示了来自缓冲实验1a)的结果：酸碱滴定。在4.5-6.5的ph范围内，溶液中所指示的聚合物的缓冲特性描绘于图中。
[0315]
图1b：显示了来自缓冲实验1b)的结果：溶酶体缓冲。所鉴定的聚合物在活细胞中的缓冲特性表示为mander重叠系数(mander’s overlap coefficient)(0-1)：绿色信号(中性ph)与红色信号(酸性ph)一起存在/整体绿色信号。mander系数是从0至1的量度，其可粗略地定义为酸化的复合物相对于总复合物的比率。如果缓冲发生，细胞保持绿色，如果没有发生，细胞则变得愈发红。
[0316]
图2a.显示了来自纳米颗粒稳定性实验2a)阴离子解离的结果。对纳米颗粒的通过硫酸葡聚糖(ds)阴离子置换pdna的稳定性评价通过暴露于不同浓度ds的纳米颗粒的dna条带强度进行定量，并经由凝胶电泳进行分析。
[0317]
图2b.显示了来自纳米颗粒稳定性实验2b)血流中纳米颗粒稳定性的结果。在后尾静脉注射cy5-pdna纳米粒后不同时间点获得的代表性的活体耳垂pk图像，其中血管结构中的信号表明np仍在循环中。比例尺代表100αm。
[0318]
图3a.显示了来自纳米颗粒转染实验3)的结果。h1299细胞的转染。在opti-mem中用编码荧光素酶的聚-l-赖氨酸(pll)纳米颗粒处理细胞后的归一化发光。
[0319]
图3b.显示了来自纳米颗粒转染实验3)的结果。血清中h1299细胞的转染。在补充有10％fbs和100nm氯喹的培养基中，用编码荧光素酶的pll纳米颗粒处理细胞后的归一化发光。
[0320]
图4显示了来自纳米颗粒转染实验3)的结果。c2c12肌管转染。在以下条件下用编码荧光素酶的pll纳米颗粒处理细胞后的归一化发光：(a)opti-mem，(b)opti-mem，补充有100μm氯喹，(c)补充有fbs的培养基和(d)补充有100μm氯喹和10％fbs的培养基。
[0321]
图5显示了来自肌内转染实验5)的结果。小鼠肌内荧光素酶的表达。经由ivis和ivis珀金埃尔默公司(perkin elmer)软件评估肌内注射5μg复合pdna后小鼠后肢的发光(n＝8)。
[0322]
实例
[0323]
本文所使用的缩写
[0324]
本文使用以下简写表示特定聚合物或纳米颗粒：
[0325]“p”或“n”：“pll”或“peg-pll”(改性)改性％例如“p：pll(m)33”和“n：peg-pll(tm)30”。
[0326]
图解：
[0327]
·
p：聚合物；
[0328]
·
n：纳米颗粒；
[0329]
·
pll：聚-l-赖氨酸是多肽；
[0330]
·
peg-pll：多肽包含聚乙二醇聚合物和聚-l-赖氨酸多肽；
[0331]
·
改性：是根据以下图解“m”、“mn”或“tm”在赖氨酸的ε-氮(如式(i)中所描绘)处的改性：
[0332][0333]
以及
[0334]
·
改性％：是指：
[0335][0336]
方法1
[0337]
1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮的合成
[0338][0339]
将(吗啉-4-基)乙酸(1g，6.89mmol)溶解于二氯甲烷(dcm)(25ml)中，且添加n-羟基丁二酰亚胺(nhs)(872mg，7.58mmol)和n-乙基-n
′‑
(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)(1.60g，8.35mmol)。将该反应在室温下搅拌1h，然后通过2”x3”硅胶垫过滤。用dcm(3x25ml)洗涤该垫，并合并滤液和洗涤液并浓缩以给出呈白色固体的1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮(1.3g，78％)。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ3.75(d，j＝3.6hz，4h)，3.57(s，2h)，2.85(s，4h)，2.67(d，j＝4.2hz，4h)；ms(esi)计算值：242.09，观察值：243.3(m 1)。
[0340]
方法2
[0341]
1-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮的合成
[0342][0343]
将6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羧酸(350mg，1.68mmol)在室温下伴随搅拌溶解于dcm(25ml)中。添加nhs(213mg，1.85mmol)，随后添加edc
·
hcl(418mg，2.18mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌1h，并且然后通过2”x3”硅胶垫过滤。用dcm(3x25ml)和乙酸乙酯(25ml)洗涤该垫。合并滤液和洗涤液并浓缩以给出呈白色固体的1-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮(325mg，63％)。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.8)(s，1h)，8.07(dd，j＝9.3hz，1.5hz，1h)，6.60(d，j＝9.3hz，1h)，3.80(d，j＝4.2hz，4h)3.72(d，j＝4.2hz，4h)，2.89(s，4h)。ms(esi)计算值：305.1，观察值：306.3(m 1)。
[0344]
方法3
[0345]
叔丁基3-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}硫代吗啉-4-甲酸酯的合成
[0346][0347]
将4-(叔丁氧基羰基)硫代吗啉-3-羧酸(1g，4.04mmol)在室温下伴随搅拌溶解于dcm(25ml)中。添加nhs(511mg，4.44mmol)，随后添加edc
·
hcl(1.01g，5.25mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌1h，并且然后通过2”x3”硅胶垫过滤。用dcm(3x25ml)洗涤该垫，并合并滤液和洗涤液并浓缩以给出呈白色固体的叔丁基3-{[(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}硫代吗啉-4-甲酸酯(1.3g，93.4％)。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ5.38(br s，1h)，4.43-4.22(m，1h)，3.46-3.21(m，1h)，3.19-3.10(m，1h)，3.06-2.97(m，1h)，2.85(s，4h)，2.81-2.62(m，1h)，2.61-2.42(m，1h)，1.47(s，9h)。ms(esi)计算值：345.4(m 1)。
[0348]
方法4
[0349]
n2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-n6-(6-吗啉代烟酰基)-l-赖氨酸的合成
[0350][0351]
将芴甲氧羰基氯l-赖氨酸(fmoc-lys-oh)(15.3g，41.53mmol，1.2当量)在室温下在机械搅拌下溶解于thf-水(1∶1，800ml)中。一次性添加上述制备的酯(方法2)在dcm中的溶液，随后添加dipea(10.73g，82.99mmol，2.4当量)。将反应在室温下进一步搅拌直至起始材料(tlc，2h)耗尽，然后添加乙酸乙酯(etoac)(250ml)。将混合物用hcl(1m，200ml)酸化，倒入分液漏斗，并分离各层。将水层用etoac(2x250ml)萃取。将有机层合并，用盐水(200ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并在真空下浓缩。获得呈浅棕色油状残余物的粗产物，将其溶解于thf中，吸附在硅胶上，并经硅胶柱(7”x3”)通过快速色谱法纯化。将柱用在己烷中的50％乙酸乙酯和100％乙酸乙酯洗涤，以在真空抽吸下洗脱产物。将含有所需产物的级分合并并在真空下浓缩以提供呈灰白色固体的n2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-n6-(6-吗啉代烟酰基)-l-赖氨酸(12.6g，65％)。1h nmr(500mhz，cdcl3)δ9.26(br s，1h)，8.62(d，j＝1.5hz，1h)，7.93(dd，j＝2.5，9hz，1h)，7.71(d，j＝7.5hz，2h)，7.53(dd，j＝4.5，7.5hz，2h)，7.35(t，j＝7.5hz，2h)，7.23(q，j＝6.5hz，2h)，6.59(t，j＝5hz，1h)，6.48(d，j＝9hz，1h)，5.99(d，j＝8hz，1h)，4.41(dd，j＝7.5，12.5hz，1h)，4.31(dd，j＝12，18hz，2h)，4.15(d，j＝7hz，1h)，3.71(t，＝4.5hz，4h)，3.56-3.32(m，6h)，1.98-1.87(m，1h)，1.86-1.75(m，1h)，1.71-1.57(m，2h)，1.56-1.39(m，2h)ppm；13c nmir(125mhz，cdcl3)δ175.2，166.6，159.9，156.6，146.9，144.1，143.9，141.4，137.7，127.9，127.3，125.3，120.1，119.5，106.3，67.2，66.6，53.8，47.3，45.3，39.5，32.0，28.9，22.4ppm；c31h34n4o6[m h] 的ms(esi)准确质量计算值：559.26，实测值：559.35。
[0352]
实例1
[0353]
(2s)-2-氨基-6-{[6-(吗啉-4-基)吡啶-3-羰基]氨基}己酸(n6-(6-吗啉代烟酰基)-l-赖氨酸)的合成
[0354]
方法1：
[0355][0356]
n2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-n6-(6-吗啉代烟酰基)-l-赖氨酸(方法4)的fmoc保护基团可例如使用dmf中20％的哌啶通过本领域已知的标准程序去除。
[0357]
方法2：
[0358][0359]
将改性赖氨酸溶解在700μl的nmp(15mg，26.87μmol)中。随后伴随搅拌将300μl哌啶添加到溶液(哌啶：nmp＝7：3；1ml)中。将反应在室温下搅拌30分钟。随后使用离心(4000g，10分钟，4℃)将改性赖氨酸沉淀并在冷二乙醚(10ml)中洗涤3次。1h nmr(500mhz，cdcl3)用于确认fmoc去除。1h nmr(500mhz，cdl3)δ11.89(s，1h)，8.85(dd，1h)，7.89(dd，1h)，7.34(dd，1h)，3.52-3.71(m，8h)，3.35(t，1h)，2.72-2.61(t，2h)，2.01-1.57(m，6h)ppm。ms(esi)准确质量计算值[m h2o] ：352.55，实测值：352.04。
[0360]
方法5
[0361]
n2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-n6-(4-(叔丁氧基羰基)硫代吗啉-3-羰基)-l-赖氨酸的合成
[0362][0363]
将fmoc-l-lys-oh(8.94g，24.26mmol，1.2当量)在室温下在机械搅拌下溶解于thf-水(1∶1，800ml)中。一次性添加上述制备的活化酯(方法3)在dcm中的溶液，随后添加dipea(6.27g，48.53mmol，2.4当量)。将反应在室温下进一步搅拌直至起始材料(tlc，2h)消耗，然后添加etoac(250ml)。将混合物用hcl(1m，200ml)酸化，倒入分液漏斗，并分离各层。将水层用etoac(2x250ml)萃取。将有机层合并，用盐水(200ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并在真空下浓缩。获得呈淡黄色油状残余物的粗产物，将其溶解于dcm中，吸附在硅胶上，并经硅胶柱(7”x3”)通过快速色谱法纯化。将柱用在己烷中的50％-70％乙酸乙酯洗涤，以在真空抽吸下洗脱产物。将含有所需产物的级分合并并在真空下浓缩以提供呈灰白色固体的n2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-n6-(4-(叔丁氧基羰基)硫代吗啉-3-羰基)-l-赖氨酸(9.1g，75％)。1h nmir(500mhz，cdcl3)δ7.75(d，j＝7.5hz，2h)，7.63-7.51(m，2h)，7.38(t，j＝7.5hz，2h)，7.29(t，j＝7.5hz，2h)，5.71(dd，j＝7.5，23hz，1h)，4.97(br s，1h)，4.57-4.23(m，4h)，4.20(t，j＝7hz，1h)，3.51-3.18(m，3h)，3.17-2.96(br s，1h)，2.77(d，j＝12.5hz，1h)，2.70-2.58(m，1h)，2.38(d，j＝12.5hz，1h)，1.98-1.86(m，1h)，1.85-1.73(m，1h)，1.66-1.53(m，2h)，1.46(br s，12h)ppm；13cnmr(125mhz，cdcl3)δ175.0，156.4，155.8，143.9，141.4，127.9，127.3，125.3，120.1，67.3，60.6，53.8，47.3，39.2，31.5，29.1，28.5，
26.7，22.3ppm；c
31h39
n3o7s[m na] 的ms(esi)准确质量计算值：620.24，实测值：620.35。
[0364]
实例2
[0365]
(2s)-2-氨基-6-[(硫代吗啉-3-羰基)氨基]己酸(n6-(硫代吗啉-3-羧基)-l-赖氨酸)的合成
[0366]
方法1：
[0367][0368]
n2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-n6-(4-(叔丁氧基羰基)硫代吗啉-3-羰基)-l-赖氨酸(方法5)的fmoc保护基团可例如使用dmf中20％哌啶通过本领域已知的标准程序去除。类似地，boc保护基团可例如使用在dcm中的30％tfa通过本领域已知的标准程序去除。
[0369]
方法2：
[0370][0371]
将改性赖氨酸溶解在700μl的nmp(15mg，25.12μmol)中。随后伴随搅拌将300μl哌啶添加到溶液(哌啶：nmp＝7∶3；1ml)中。将反应在室温下搅拌30分钟以去除fmoc保护基团。随后使用离心(4000g，10分钟，4℃)将改性赖氨酸沉淀并在冷二乙醚(10ml)中洗涤3次。风干过夜后，将产物溶解于50％tfa：dcm(1ml)中并在室温下搅拌15分钟。使用旋转蒸发仪去除tfa：dcm溶液，并沉淀并在冷乙醚中洗涤2次。使用以下确认fmoc去除：1h nmr：δ11.56-12.04(1h，br)，7.34(s，1h)，3.65-3.76(dd，2h)，3.42(t，j＝7.3hz，1h)，3.01-3.15(m，2h)，2.70-2.89(m，2h)，2.55-2.61(t，j＝5.6hz，2h)，2.06-2.18(m，2h)，1.74-1.85(m，2h)，1.58-1.64(q，2h)1.05(1h，s)ppm，和ms(esi)准确质量计算值[m h2o] ：279.22，实测值：
279.62。
[0372]
方法6
[0373]
n2(1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮)-l-赖氨酸的合成
[0374][0375]
可采用以下程序来产生n2(1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮)-l-赖氨酸，可在室温下在机械搅拌下将fmoc-l-lys-oh(1.2当量)溶解于thf-水(1：1，800ml)中。可以一次性添加上述制备的活化酯在dcm中的溶液，随后添加dipea(2.4当量)。可将反应在室温下进一步搅拌直至起始材料(tlc，2h)消耗，然后可添加etoac(250ml)。可将混合物用hcl(1m，200ml)酸化，倒入分液漏斗，并分离各层。可将水层用etoac(2x250ml)萃取。可将有机层合并，用盐水(200ml)洗涤，经无水na2so4干燥，过滤并在真空下浓缩。可将粗产物溶解于dcm中，吸附在硅胶上，并经硅胶柱(7”x3”)通过快速色谱法纯化。可将柱用在己烷中的50％-70％乙酸乙酯洗涤，以在真空抽吸下洗脱产物。可将含有所需产物的级分合并并在真空下浓缩以提供n2-(n2(1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮)-l-赖氨酸。
[0376]
实例3
[0377]
(2s)-2-氨基-6-[2-(吗啉-4-基)乙酰氨基]己酸(n6-(2-吗啉代乙酰基)-l-赖氨酸)的合成
[0378]
方法1：
[0379][0380]
n2(1-{[(吗啉-4-基)乙酰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮)-l-赖氨酸(方法6)的fmoc保护基团可例如使用dmf中的20％哌啶通过本领域已知的标准程序去除。
[0381]
方法2：
[0382][0383]
将改性赖氨酸溶解在700μl的nmp(15mg，25.02μmol)中。随后伴随搅拌将300μl哌啶添加到溶液(哌啶：nmp＝7∶3；1ml)中。将反应在室温下搅拌30分钟。随后使用离心(4000g，10分钟，4℃)将改性赖氨酸沉淀并在冷二乙醚(10ml)中洗涤3次。使用以下确认fmoc去除：h-nmr：1h nmr(500mhz，cdl3)δ12.01(br s，1h)，3.62-3.74(m，4h)，3.40(t，1h)，3.29(s，2h)，3.10(t，1h)，2.59-2.70(m，4h)，1.88-2.01(m，2h)，1.58-1.65(m，2h)，和1.46-1.56(q，2h)以及ms(esi)准确质量计算值[m h2o] ：273.17，实测值：273.33。
[0384]
实例4
[0385]
聚(l-赖氨酸)和peg-聚(l-赖氨酸)多肽
[0386][0387][0388]
通过使方法1-3中制备的nhs-酯与相应的pll(mw 5000，阿拉曼达聚合物公司(alamanda polymers inc.)，亨茨维尔，亚拉巴马州)或peg-pll(mw 13000，阿拉曼达聚合物公司，亨茨维尔，亚拉巴马州)反应来制备改性peg-pll和pll。在pll的末端羧基端处向所有聚合物提供聚合反应引发剂残基(本文简称为pll)或meo-peg-(ch2)
2-nh-基团(本文称为peg-pll)。将pll(20mg，2.5μmol)或peg-pll(20mg，1.5μmol)溶解于新鲜制备的0.1m碳酸氢钠(ph 8.0(4ml))中。将40mm的方法1、2或3的化合物在二甲基乙酰胺(dmac)(1.5摩尔过量)中制备并在搅拌的同时逐滴添加到聚合物溶液中。通过控制nhs-酯的摩尔进料比率，制备了一系列具有不同改性程度的pll。改性反应在12.5至50摩尔当量nhs酯：聚合物下进行。在室温下将反应搅拌1小时，并且随后使用截留分子量(mwco)为3.5kda的透析盒通过在ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)，并且然后在水中透析去除未反应基团。对于pll(tm)和peg-pll(tm)，通过将冻干产物在30％三氟乙酸/dcm中孵育30分钟，使用现有技术中使用的标准方案去除中间产物(*)上的boc保护基团。赖氨酸改性的程度由d20中记录的h-nmr光谱，按lys((ch2)3，δ＝1.3-1.9ppm)的β、γ和δ-亚甲基质子的峰强度与来自吗啉(m)(起始材料方法1)和吗啉代-烟酸基团(起始材料方法2)(mn)(针对吗啉和吗啉代-尼克酸((ch2)2，δ＝3.86和2.58ppm))和针对硫代吗啉(tm)(起始材料方法3)((ch2)2，δ＝3.11和3.56ppm)的吗啉环亚甲基质子的峰值强度之和的比率确定，结果如下表所示。
[0389][0390]
表1：改性pll和peg-pll
[0391]
实例5
[0392]
含遗传物质的纳米颗粒的制备与表征
[0393]
通过在中性缓冲液中混合多肽和核酸溶液制备纳米颗粒。使用标准技术(包括动态光散射(dls)、透射电子显微镜(tem)和溴化乙锭排除测定)对纳米颗粒进行评估，以确认纳米颗粒的形成。
[0394]
a)纳米颗粒制备
[0395]
将dna(gwiz荧光素酶；genlantis公司(genlantis)，圣地亚哥，加利福尼亚州)(66.6μg/ml)和聚合物溶液在ph 7.0的20mm4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(hepes)缓冲液中制备。将聚合物溶液用pll(50单位，阿拉曼达聚合物公司，亨茨维尔，亚拉巴马州)，peg(5k)-pll(50单位)(阿拉曼达聚合物公司，亨茨维尔，亚拉巴马州)以及“p：pll(m)29”、“p：pll(mn)31”、“p：pll(tm)28”、“p：peg-pll(m)33”、“p：peg-pll(mn)31”和“p：peg-pll(tm)30”制备(均通过类似于实例4的程序制备)。聚合物溶液也在hepes中制备，因此聚合物中的
naoh滴定至ph为11。搅拌时，用0.1m hcl以5μl增量滴定聚合物溶液至ph为4.5。缓冲能力报告为将聚合物溶液ph改变0.5所需的平均体积(μl)。细胞外中性ph7.4和内体酸性ph 4.5之间质子化程度的变化(δα7.4-4.5)计算为：所添加的将ph从7.4改变为4.5的hcl摩尔数除以每种溶液中胺的总摩尔数。所有滴定实验一式三份地进行。结果显示于图1a中。
[0412]
b)溶酶体缓冲
[0413]
将gwiz荧光素酶(genlantis公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)用两种荧光团标记(ph不敏感的绿色染料和ph敏感的红色染料)，以通过测量在相同像素中共存在的绿色：红色荧光比率来估算ph。首先，使用mfp488核酸试剂盒(mirus生物有限责任公司(mirus bio llc，madison wi)，威斯康星州麦迪逊)标记dna，并且然后使用制造商建议的方案用胺核酸试剂盒(mirus生物有限责任公司，威斯康星州麦迪逊)进行胺功能化。采用乙醇沉淀法去除未反应的染料。随后用nhs酯phrodo红色(赛默飞世尔公司(thermo fischer)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)标记dna并经由乙醇沉淀进行纯化。用分光光度法确认和定量具有不同荧光团(每个质粒约40个染料)的dna的改性。然后使用mfp-488和phrodo红色双标记dna如下所述制备纳米颗粒。对于细胞研究，将h1299细胞以每孔10,000个细胞接种在96孔板中，并使其在补充有10％fbs和1％p/s的洛斯维公园纪念研究所(roswell park memorial institute，rpmi)培养基中附着24h。接下来，将细胞用100μl pbs洗涤两次，并用100μl opti-mem洗涤一次。如上文所述，用pei、peg-pll、“p：peg-pll(m)35”(聚合物12)、“p：peg-pll(mn)39”(聚合物15)和“p：peg-pll(tm)33”(聚合物18)，通过将dna(66.6μg/ml)和聚合物溶液以比率为5的胺与磷酸盐(最终dna浓度为33.3μg/ml)混合在20mm hepes中制备dna纳米颗粒。然后在opti-mem(1：10稀释)中以每孔0.1μg dna将np添加到细胞中。4小时时间段后，用赫斯特染色(5μg/ml储备液于pbs中持续5分钟)处理细胞，并使用荧光显微镜用evos细胞成像系统(赛默飞世尔公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)成像。将纳米颗粒在缓冲液(酸性、中性和碱性缓冲液)中处理后，通过成像固定的透性化细胞产生近似细胞内ph的比例尺。在此测定中，phrodo红色信号随着ph的降低而显著增加，而mfp488对ph不敏感，因此酸性囊泡呈红色或橙色，中性囊泡呈绿色。结果显示于图1b中。
[0414]
实验2
[0415]
纳米颗粒稳定性
[0416]
针对阴离子解离和活体内药代动力学(pk)研究评估纳米颗粒的稳定性。
[0417]
a)阴离子解离
[0418]
如以上实例5中所述，使用peg-pll和以n：p为5的聚合物12、15和19与2μg gwiz荧光素酶dna(genlantis公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)制备纳米颗粒。将20mm hepes缓冲液和硫酸葡聚糖(ds)(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，20mm hepes缓冲液中5g/ml)溶液添加到每个纳米颗粒样品中，使最终pdna浓度保持恒定，并且ds浓度在0到200mg/ml之间变化。在37℃下处理30分钟时间段后，将15μl的每种配制品添加到含有溴化乙锭的2％的电泳凝胶(赛默飞世尔科技公司)中，并使用标准e-凝胶方案运行10分钟。结果显示于图2a中。
[0419]
b)血流中纳米颗粒稳定性
[0420]
通过多光子共焦荧光显微镜对小鼠耳垂血管成像，以确定血流中纳米颗粒的稳定性。如实例5中所述，用peg-pll和聚合物12、15和19，使用cy5标记的pdna(20染料/质粒)在
5％海藻糖溶液(n：p＝5)中以100μg dna/ml制备纳米颗粒溶液。随后在吸气室中用异氟烷麻醉balb/c小鼠，随后将该小鼠转移到位于显微镜台的鼻锥上。使用定制的载玻片架和玻璃载玻片将小鼠的耳朵定位并展平，以便使用徕卡sp8 dive多光子显微镜进行成像。使用25x1.0na水浸物镜(具有m32后孔)用于纳米颗粒成像。cy5染料是用光谱物理x3激光器(spectra-physics x3 laser)的1220nm线进行激发的。使用dive系统的两个非去扫描探测器(non-descanned detector)进行成像。一个dive hyd探测器调整到605-615nm，以用于第二谐波成像。第二探测器调整到635-775nm，以用于cy5发射检测。第二谐波用于定位静脉和动脉的视野，随后通过尾静脉静脉注射200μl(20μg pdna)给小鼠静脉内施用纳米颗粒配制品。对小鼠进行成像，直到血管内的信号与周围组织中的信号相等或持续2小时时间段。用imagej生成针对每个指定时间点经1s时间段采集的图像的最大强度投影。每种配制品至少在3只小鼠中进行测试。结果显示于图2b中。
[0421]
实验3
[0422]
纳米颗粒转染
[0423]
针对阴离子解离和循环评估纳米颗粒的稳定性。
[0424]
将h1299和c2c12细胞以10,000个细胞/孔接种于96孔板中的rpmi培养基中；或以20,000个细胞/孔接种于补充有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素链霉素(p/s)的杜尔贝科改良的伊格尔培养基(dmem)中。在转染前，允许h1299细胞有24h的恢复期，而通过将c2c12成肌细胞在补充有2％的马血清的dmem中孵育至少7天分化成肌管。随后，将细胞用100μl pbs洗涤两次，并用培养基或改良的伊格尔最低培养基(opti-mem)洗涤一次。如实例5中所述，使用pei、pll，“pll(m)37”(聚合物2)、“pll(mn)33”(聚合物5)、“pll(tm)39”(聚合物8)、peg-pll、“peg-pll(m)35”(聚合物12)、“peg-pll(mn)39”(聚合物15)、“peg-pll(tm)33”(聚合物18)制备纳米颗粒。未改性的pei、pll和peg-pll纳米颗粒用1μg dna以n：p为3制备，并且改性的pll纳米颗粒以n：p为5制备。复合后，在opti-mem(1∶10稀释)或培养基中以每孔0.1μg dna将np添加到细胞中。16小时时间段后，去除补充纳米颗粒的培养基，并添加新鲜的培养基。绿色荧光蛋白(gfp)的表达用incucyte(埃森生物科学公司(essen bioscience)，安娜堡，密歇根州)成像，并且荧光素酶/活性用one-glo
tm
tox荧光素酶报告仪(普洛麦格公司(promega)，麦迪逊，威斯康辛州)和pherastarfsx仪器(bmg实验室技术公司(bmg lab tech)，凯里，北卡罗来纳州)的标准方案定量。结果展示于图3和4中。
[0425]
4)毒性
[0426]
使用存活死亡测定评估材料毒性。
[0427]
将h1299细胞接种于96孔板(10000/孔)中。在24小时恢复期后，用0.1至2μgpei(25k，波利塞斯公司，费城，宾夕法尼亚州)、pll(阿拉曼达聚合物公司，亨茨维尔，亚拉巴马州，5kda)，和在opti-mem中制备的p：pll(m)33、p：pll(mn)33和p：pll(tm)33”处理细胞。暴露16小时后，用存活/死亡染色或代谢测定分析细胞。对于存活/死亡测定，将10μl钙黄绿素am(2mm于dmso中)和5μl的碘化丙啶(2mm dmso)储备溶液溶解于5ml pbs中。然后将细胞用pbs洗涤两次，并添加染色溶液(100μl/孔)。在37℃下孵育30分钟时间段后，将细胞使用incucyte酶标仪(赛多利斯公司(sartorius))成像。可替代地，使用制造商标准方案使用发光测定进行代谢测定。使用pherastar酶标仪(bmg实验室技术公司)采集发光测量，并通过在microsoft excel中拟合数据推导ic
50
剂量。
[0428][0429]
表3.高分子材料的体外毒性/ic
50
(μg/孔)
[0430]
测试的细胞系
[0431]
5)肌内转染
[0432]
通过监测肌内注射后报告蛋白荧光素酶的表达评估纳米颗粒在体内的转染效率。
[0433]
将裸(nu/nu)小鼠的每个后肢(n＝2/小鼠)肌内注射在50μl的5％的海藻糖溶液中的与pei、peg-pll或p：peg-pll(mn)39(聚合物(15))复合的5μg dna。每天/每周使用ivis(珀金埃尔默公司)评估表达，接着向小鼠腹膜内(ip)注射施用150μl的rediject(30mg/ml荧光素-d)。发光采集一式四份，以平均值 /-标准偏差表示。结果显示于图5中。