一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用的制作方法

al.2006)、部分胶原蛋白肽段(yanagisawa et al.2007)，以及p25融合的红色荧光蛋白(royer et al.2005)等；在中部丝腺表达了人血清白蛋白(ogawa et al.2007)、增强型绿色荧光蛋白(tomita et al.(2007)、鼠单克隆抗体(iizuka et al.2009)、人胶原蛋白α链基因(adachi et al.2010)以及可溶性gm
‑
csf受体α(urano et al.2010)等。但总体上，上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：这类丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响，研究人员尝试过蛋白复性策略，但是流程繁琐且收效甚微，因而极大的限制的丝素重链表达系统的应用。所以，有必要对现有的丝素重链表达系统进行改造，以提高外源蛋白的表达效率与生物活性，推动家蚕丝腺生物反应器技术体系在生物制药和功能性蚕丝遗传改良领域中的应用。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种高效丝素重链启动子分泌表达系统，解决了现有丝素重链表达系统由于调控元件较为单一，并且外源蛋白需要与内源丝蛋白进行融合才能实现分泌表达，对外源蛋白的表达量和生物活性产生不利影响的问题。
6.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
7.一种高效丝素重链pbac载体的构建方法，其特征在于，所述pbac载体包括pbac
‑
frf 载体、pbac
‑
hfrf载体、pbac
‑
hfrs载体、pbac
‑
hflrs载体；所述pbac
‑
hfrf载体、pbac
‑
hfrs 载体、pbac
‑
hflrs载体是由所述pbac
‑
frf载体形成的插入型载体；所述pbac载体的构建包括以下步骤：
8.1)采用特异性引物以phsrsv载体为模板进行pcr扩增，得到红色荧光蛋白dsred1、 hr3 cq增强子和ser1pa终止子，将得到的片段分别克隆到pmd 19t simple载体中，分别得到pdsred1载体、phr3载体和pser1pa载体；
9.2)采用特异性引物以家蚕基因组dna为模板进行pcr扩增，得到f(1967)，将得到的 f(1967)片段克隆到pmd19t simple载体中，得到pf1967载体，f(1967)的序列如seq id no.1 所示；
10.采用特异性引物以fibhpolya(fibhpa)终止子为模板进行pcr扩增，将得到的dna 片段克隆到pmd19t simple载体中，得到pfibhpa载体；
11.3)将pdsred1载体上用bamh i和not i酶切得到的dsred1片段连接到用bamh i和 not i酶切后的pf1967载体上，得到pfr载体；
12.将p
‑
fibhpa载体上用not i和kpn i酶切得到的fibhpa片段连接到用not i和kpn i酶切后pfr载体上，得到pfrf载体，pfrf的序列如seq id no.2所示；
13.4)将pfrf载体用ascⅰ酶切得到frf片段，将其插入pbac[3xp3dsredaf]转基因载体中，得到pbac
‑
frf载体。
[0014]
进一步的，一种高效丝素重链pbac
‑
hfrf载体的构建方法，包括以下步骤：将hr3插入 pfrf载体得到phfrf载体，phfrf的序列如seq id no.2所示，将phfrf载体用asci酶切得到hfrf片段，将其插入pbac[3xp3dsredaf]转基因载体中生成pbac
‑
hfrf。
[0015]
进一步的，一种高效丝素重链pbac
‑
hfrs载体的构建方法，包括以下步骤：将phfrf 载体中的fibhpa用ser1pa替换生成phfrs；phfrs的序列如seq id no.2所示，将phfrs 载体
用asci酶切得到hfrs片段，将其插入pbac[3xp3dsredaf]转基因载体中生成 pbac
‑
hfrs。
[0016]
进一步的，一种高效丝素重链pbac
‑
hfirs载体的构建方法，包括以下步骤：在phfrs 中，用exon2(genbank登录号af226688，nt.63451
‑
63846)替换exon2 ntd 2aa以生成载体phflrs；将phfirs载体用asci酶切得到hfirf片段，将其插入pbac[3xp3dsredaf]转基因载体中生成pbac
‑
hfirs。
[0017]
一种上述高效丝素重链pbac载体在制备高效丝素重链启动子分泌表达系统中的应用。
[0018]
一种高效丝素重链启动子分泌表达系统，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
[0019]
1)将pbac载体与辅助质粒pha3pig以质量比为1:1的比例一起注入g0代卵中，饲养后得到g0蛾子，然后进行交配制种得到g1代；
[0020]
2)用荧光显微镜对g1代卵的眼睛或神经是否有荧光进行阳性个体筛选获得转基因家蚕，获得的转基因家蚕饲养、传代，保留pbac
‑
frf载体、pbac
‑
hfrf载体、pbac
‑
hfrs载体单拷贝的阳性转基因个体分别为frf品系、hfrf品系和hfrs品系。
[0021]
进一步的，所述pbac载体中pbac
‑
frf载体、pbac
‑
hfrf载体、pbac
‑
hfrs载体在染色体上的插入位点分别为1号染色体、25号染色体和20号染色体。
[0022]
一种上述高效丝素重链启动子分泌表达系统在家蚕生物反应器中合成和分泌成熟的重组蛋白中的应用。
[0023]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0024]
1)建立了一种高效的丝素重链分泌表达系统，实现了外源蛋白在蚕丝中以其天然大小的分子量大量分泌且具备活性，与之前的丝素表达系统相比在应用上更有前景。
[0025]
2)高效的丝素重链分泌表达系统可用于生物反应器中表达和分泌成熟的重组蛋白，而且在n
‑
末端没有任何额外的丝素重链氨基酸残基不会影响蛋白的大小。
附图说明
[0026]
图1为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中丝素重链启动子 pbac表达载体构建示意图。
[0027]
图2为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中转基因家蚕阳性个体的筛选示意图。
[0028]
附图2中a、b、g和h为frf品系,c、d、i和j为hfrf品系,e、f、k和l为hfrs品系。a、c、e、g、i和k分别在白光下观察，b、d、f、h、j和l分别在dsred激发光下观察。
[0029]
图3为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1基因染色体上的定位图。
[0030]
图4为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1在转基因家蚕中的表达示意图。
[0031]
附图4中a为wt，b为frf，c为hfrf，d为hfrs。a、b、c、d和e分别在白光下观察，f在dsred激发光下观察。
[0032]
图5为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1在后部丝腺与中部丝腺的分布示意图。
[0033]
图6为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中不同转基因
蚕茧的示意图。
[0034]
图7为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中转基因家蚕茧层率的对比示意图。
[0035]
图8为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1在转基因蚕茧内层和外层的观察示意图。
[0036]
图9为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1在转基因蚕茧中的分布示意图。
[0037]
图10为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1mrna在后部丝腺的相对表达图。
[0038]
图11为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1mrna在中部丝腺的相对表达图。
[0039]
图12为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中fibhmrna在后部丝腺和中部丝腺的相对表达图。
[0040]
图13为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1的蛋白电泳分析图。
[0041]
图14为本发明一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的建立与应用中dsred1的免疫印迹分析图。
[0042]
附图14中，dsred
‑
6xhis样品为标准对照样。
具体实施方式
[0043]
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0044]
实施例1：一种高效丝素重链pbac载体的构建
[0045]
本发明从家蚕基因组dna中用特异性引物通过pcr扩增出一个长度为1967bp的dna片段，称为f(1967)载体，f(1967)载体上的丝素重链启动子基础元件序列与genbank上登录的家蚕fibh基因accessionno.af226688(nt.61490
–
63456)一致，包括5’utr(628bp)，promoterregion(320bp)，exon1(42bp)，intron1(971bp)，exon2
‑
ntd2aa(6bp)。hr3cq增强子、ser1pa终止子和fibhpa终止子序列为已知序列(wangetal.2013)。
[0046]
pbac载体包括pbac
‑
frf载体、pbac
‑
hfrf载体、pbac
‑
hfrs载体、pbac
‑
hflrs载体；pbac
‑
hfrf载体、pbac
‑
hfrs载体、pbac
‑
hflrs载体是由pbac
‑
frf载体形成的插入型载体；pbac载体的构建包括以下步骤：
[0047]
1)采用特异性引物以phsrsv载体为模板进行pcr扩增，得到红色荧光蛋白dsred1、hr3cq增强子和ser1polya(ser1pa)终止子，将得到的片段分别克隆到pmd19tsimple载体(takara)中，分别得到pdsred1载体、phr3载体和pser1pa载体；
[0048]
2)采用特异性引物以家蚕基因组dna为模板进行pcr扩增，得到f(1967)(序列如seqidno.1所示)，将得到的f(1967)片段(genbank登录号af226688，nt.61490
‑
63456)克隆到pmd19tsimple载体(takara)中，得到pf1967载体；
[0049]
采用特异性引物以fibhpolya(fibhpa)终止子为模板进行pcr扩增，将得到的dna 片段克隆到pmd19t simple载体(takara)中，得到pfibhpa载体；
[0050]
3)将pdsred1载体上用bamh i和not i酶切得到的dsred1片段连接到用bamh i和 not i酶切后的pf1967载体上，得到pfr载体；
[0051]
将p
‑
fibhpa载体上用not i和kpn i酶切得到的fibhpa片段连接到用not i和kpn i酶切后pfr载体上，得到pfrf载体(序列如seq id no.2所示)；
[0052]
4)将pfrf载体用ascⅰ酶切得到frf片段，将其插入pbac[3xp3dsredaf]转基因载体中，得到pbac
‑
frf载体。
[0053]
将hr3插入pfrf载体得到phfrf载体(序列如seq id no.3所示)，将phfrf载体用 asci酶切得到hfrf片段，将其插入pbac[3xp3dsredaf]转基因载体中生成pbac
‑
hfrf载体；
[0054]
将phfrf载体中的fibhpa用ser1pa替换生成phfrs(序列如seq id no.4所示)；将phfrs载体用asci酶切得到hfrs片段，将其插入pbac[3xp3dsredaf]转基因载体中生成pbac
‑
hfrs载体。
[0055]
在phfrs中，用exon2(genbank登录号af226688，nt.63451
‑
63846)替换exon2 ntd 2aa以生成载体phflrs；将phfirs载体用asci酶切得到hfirf片段，将其插入 pbac[3xp3dsredaf]转基因载体中生成pbac
‑
hfirs载体。
[0056]
pbac载体构建中进行pcr扩增需要的特异性引物的核苷酸序列见表1。
[0057]
表1核苷酸序列表
[0058][0059]
注：下划线表示相应限制性内切酶酶切位点的序列。
[0060]
实施例2：一种高效丝素重链启动子分泌表达系统的制备
[0061]
一种高效丝素重链启动子分泌表达系统，制备方法包括以下步骤：
[0062]
1)将pbac载体与辅助质粒pha3pig以质量比为1:1的比例一起注入g0代卵中，饲养后得到g0蛾子，然后进行交配制种得到g1代；
[0063]
2)用荧光显微镜对g1代卵的眼睛或神经是否有荧光进行阳性个体筛选获得转基
因家蚕，获得的转基因家蚕饲养、传代，保留pbac
‑
frf载体、pbac
‑
hfrf载体、pbac
‑
hfrs载体单拷贝的阳性转基因个体分别为frf品系、hfrf品系和hfrs品系。
[0064]
实施例3：利用反向pcr法对pbac载体在染色体上的插入位点检测
[0065]
将基因组dna在37℃下用酶切haeiii过夜，酶切产物回收后用t4dna连接酶在16℃下连接过夜使dna片段环化。将连接产物用转座子特异性引物pbacl
‑
f/pbacl
‑
r(用于 piggybac左臂)和pbacr
‑
f/pbacr
‑
r(用于piggybac右臂)进行pcr扩增。克隆pcr片段并测序。使用silkdb 3.0(https://silkdb.bioinfotoolkits.net)确定pbac表达载体在家蚕基因组上的插入位点。
[0066]
通过检测，pbac载体中pbac
‑
frf载体、pbac
‑
hfrf载体、pbac
‑
hfrs载体在染色体上的插入位点分别为1号染色体、25号染色体和20号染色体。
[0067]
实施例4：dsred1重组蛋白在上簇期丝腺组织中的分布
[0068]
在自然光照下对frf品系、hfrf品系和hfrs品系三种品系家蚕观察上簇期转基因，并用数码相机拍摄。然后对家蚕进行解剖取出丝腺，用装有rfp滤光器的体式荧光显微镜进行红色荧光蛋白的观察。最后，将丝腺中部和后部(msg和psg)分别用包埋剂tissue
‑
teko.c.t.compound(sakurafinetechnical)进行包埋，用液氮冷冻。用恒冷箱切片机(一般
‑
22℃) 切片，切片机厚度为10μm，将切片粘贴在预处理的载玻片上。用dapi染色，然后滴加抗荧光淬灭剂完成封片，最后将切片置于荧光显微镜观察与拍摄。
[0069]
通过附图4、附图5发现，对上簇期的转基因家蚕观察发现hfrs(图4d)和hfrf(图 4c)转基因品系全身呈橘红色，对其进行解剖发现hfrs和hfrf丝腺的中部与后部都呈粉红色，frf与wt组基本一致(如图4e所示)；在荧光显微镜下观察发现，frf、hfrf和hfrs 的中部和后部丝腺呈红色荧光，而且荧光以次增强(如图4f所示)。解剖刚上簇的蚕，取出丝腺分别对后部和中部丝腺进行冷冻切片观察(如图5所示)，frf、hfrf和hfrs后部丝腺细胞内均有dsred1的表达，后部丝腺腔内也有dsred1的分布，丝胶层也略呈红色荧光，而且红色荧光以此增强；在中部丝腺腔内分布着大量的球状的红色荧光点，且hfrs品系最强。
[0070]
实施例5：dsred1重组蛋白在蚕茧中的分布
[0071]
在自然光照下对frf品系、hfrf品系和hfrs品系三种品系家蚕观察上簇期转基因，并用数码相机拍摄。各选取30个转基因蚕茧进行茧层率的统计，将转基因茧用打孔器打孔获得直径5mm的圆片，进一步荧光观察茧的外层和内层，对蚕茧进行冷冻切片观察，并用装有rfp滤光片的荧光显微镜进行了拍摄。
[0072]
见附图6
‑
9，收取阳性个体的蚕茧发现hfrs的蚕茧呈橘红色，而且内层要红于外层， hfrf组和frf组以次减弱，wt组无红色荧光，而且hfrs组茧最小。进行茧层率的统计分析，frf组茧层率与wt组无明显差异，hfrf和hfrs组均显著低于wt组。将蚕丝进行冷冻切片观察发现，阳性个体的丝素和丝胶层均有红色荧光蛋白的分布，hfrs组分布的最多。
[0073]
实施例6：丝腺中dsred1的mrna的相对表达
[0074]
提取转基因家蚕5龄第3天到上簇期的msg和psg中总rna。然后通过反转录获得 cdna,以cdna为模板进行qpcr检测，以家蚕核糖体蛋白49(rp49)为内参。采用abi 7500 快速实时系统(applied biosystems)在以下条件下进行qpcr反应：95℃30s，在95℃，3s 和60℃，30s的条件下进行40个循环。表1描述了用于qpcr的fibh、dsred1和rp49引物。
[0075]
见附图10
‑
14，对家蚕幼虫l5d3、l5d4、l5d5、l5d6、l5d7和上簇期的丝腺分别进行
rna提取，分别对中部丝腺和后部丝腺进行dsred1基因和fibh基因进行荧光定量pcr 检测，上簇期hfrf和hfrs品系后部丝腺dsred1的相对表达量分别是frf的5.7倍和6.9 倍，显著高于frf组，而且hfrf和hfrs品系dsred1在中部丝腺也有少量的表达。而且 hfrs和hfrf品系会影响fibh相对表达。
[0076]
实施例7：蚕茧中dsred1含量的分析
[0077]
在40℃，旋涡振荡10min条件下，将80mg剪碎的转基因蚕茧用1ml 9.3ml libr进行溶解，然后加入1ml 8m尿素，用混合旋涡混合器(eppendorf)混合。混合液用9倍pbs稀释。最后在4
‑
20％梯度丙烯酰胺凝胶(genscript)上进行蛋白电泳，考马斯亮蓝r
‑
250染色和 western blotting分析。利用image j软件对转基因蚕茧中重组rfp的含量进行了灰度分析。
[0078]
实施例3与实施例6中反向pcr/qpcr反应所用引物的核苷酸序列见表2。
[0079]
表2核苷酸序列表
[0080][0081][0082]
见附图13、附图14，将frf、hfrf和hfrs品系的蚕茧进行蛋白提取，对dsred1的含量进行比较，hfrs和hfrf组蚕茧中dsred1的含量是frf组的7.2倍和4.1倍。
[0083]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。