与源自人真皮乳头细胞的外泌体有关的组合物和方法

与源自人真皮乳头细胞的外泌体有关的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年3月31日提交的美国临时专利申请号63/002,825的优先权和权益，该临时专利申请出于所有目的以引用方式全文并入本文。
3.政府支持
4.本发明是在美国国立卫生研究院授予的赠款编号hl123920、hl137093、hl144002和hl146153下在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
5.本公开提供了与使用源自人真皮乳头(dp)细胞的外泌体(exosome)有关的组合物和方法。具体地讲，本公开提供了用于产生和维持源自dp球体的外泌体的新型组合物和方法，以及用于将外泌体递送至受试者以用于各种治疗目的诸如治疗与毛囊发育相关的疾病和病症的组合物和方法。


背景技术：

6.受中度脱发影响的人通常会转向局部治疗，如米诺地尔(抗高血压钾通道开放剂)和非那雄胺(抑制双氢睾酮的5α还原酶抑制剂)，这是美国食品和药品管理局(fda)唯一批准的用于诱导毛发再生的治疗方法。两者通常都需要持续的施用以维持毛发生长。许多研究人员通过关注毛囊周期来寻求更有效的方法，以促进毛囊从静止期(休止期)转变为活跃期(生长期)。研究人员试图通过体外培养和增殖毛囊细胞或间充质细胞然后植入它们来使用细胞疗法来治疗脱发，而不是使用成本高昂且有时面临供体短缺的毛囊单位移植(器官)。在生长期，毛囊隆起区域是活跃生长的真皮乳头细胞(dp)的丰富来源，这些真皮乳头细胞在静止期脱落。有人提出，秃发区域的毛囊并没有消失，而是尺寸减小了。因此，将dp补充到秃发区域是休止期到诱导毛发生长所需的生长期阶段过渡的似乎合理方法。
7.上皮细胞与间充质细胞之间的相互作用对于调节毛发生长的周期至关重要。作为毛囊单位的主要间充质成分，dp诱导从休止期到生长期的周期变化和新毛囊的形成。调节真皮乳头细胞对于增加细胞分裂和生长速度至关重要。二维(2d)培养的dp已证明对毛囊生长没有治疗作用。据报道，三维(3d)球体培养物导致诱导能力的部分恢复并且能够在人体皮肤中诱导新生毛囊。dp必须聚集到毛囊区域才能有效。因此，球体培养疗法可以是恢复体外毛发再生能力的有效方法。然而，全面理解强调这种再生过程的分子机制将提供额外的好处。


技术实现要素：

8.本公开的实施方案包括一种组合物，该组合物包含源自人真皮乳头细胞(dp)球体的多个外泌体。根据这些实施方案，多个外泌体包括以下中的至少一种：(i)增加的至少一种mirna的表达和/或(ii)减少的至少一种mirna的表达。
9.在一些实施方案中，多个外泌体源自使用三维(3d)细胞培养物培养的dp球体。在
一些实施方案中，与天然存在的dp来源的外泌体相比，多个外泌体包括(i)和(ii)中的至少一种。在一些实施方案中，与使用二维(2d)细胞培养物培养的dp来源的外泌体相比，多个外泌体包括(i)和(ii)中的至少一种。
10.在一些实施方案中，至少一种mirna选自由以下组成的组，(i)的至少一种mirna选自由mir-218-5p、let-7f-5p、let-7g-5p、let-7d-5p、mir-16-5p、let-7a-5p、mir15b-5p、mir-155-5p、mir-23b-3p、mir-22-3p、mir-125b-5p、mir-21a-5p、mir-24-3p、let-7e-5p、mir-34c-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-125a-5p、mir-138-5p、mir-17-5p、mir-541-5p、mir-196a-5p、mir-27b-3p、let-7i-5p、mir-872-5p、let-7c-5p、mir-28c、mir-99a-5p、mir-27a-3p、mir-140-5p、mir-106b-5p、mir-9-5p、mir-23a-3p、mir-30c-5p、let-7b-5p、mir-191-5p或它们的任何组合组成的组。在一些实施方案中，至少一种mirna在多个外泌体中富集至少1.1倍。在一些实施方案中，至少一种mirna选自由mir-218-5p、let-7f-5p、let-7g-5p或它们的任何组合组成的组。
11.在一些实施方案中，(ii)的至少一种mirna选自由mir-31-5p、mir-29b-3p、mir-322-5p、mir-140-3p、mir-25-3p、mir-146a-5p、mir-30e-5p、mir-92a-3p、mir-20a-5p、mir-183-5p、mir-19b-3p、mir-744-5p、mir-291a-3p、mir-186-5p、mir-30a-5p、mir-199a-5p、mir-101a-3p、mir-18a-5p、mir-425-5p、mir-19a-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-214-3p、mir-182-5p、mir-130a-3p、mir-10a-5p、mir-30d-5p、mir-150-5p、mir-467e-5p、mir-124-3p、mir-196b-5p、mir-10b-5p、mir-15a-5p、mir-142a-3p、mir-488-3p、mir-411-5p、mir-503-5p、mir-96-5p、mir-1a-3p、mir-302d-3p、mir-467c-5p、mir-142a-5p、mir-32-5p、mir-144-3p、mir-880-3p、mir-295-3p、mir-141-3p、mir-335-5p或它们的任何组合组成的组。在一些实施方案中，(ii)的至少一种mirna在多个外泌体中减少至少0.9倍。在一些实施方案中，(ii)的至少一种mirna选自由mir-335-5p、mir-141-3p、mir-295-3p、mir-880-3p、mir-144-3p、mir-32-5p、mir-142a-5p或它们的任何组合组成的组。
12.在一些实施方案中，多个外泌体还包括增加的至少一种毛囊调节基因的表达。在一些实施方案中，至少一种毛囊调节基因选自fgf2、timp2或它们的组合。
13.本公开的实施方案还包括产生能够调节皮肤组织的至少一个特征的多个外泌体的方法。根据这些实施方案，该方法包括使用三维(3d)细胞培养物培养人真皮乳头细胞(dp)球体，以及从dp球体中分离出多个外泌体。在一些实施方案中，多个外泌体包括以下中的至少一种：(i)增加的至少一种mirna的表达和/或(ii)减少的至少一种mirna的表达。在一些实施方案中，与天然存在的dp来源的外泌体相比，多个外泌体包括(i)和(ii)中的至少一种。在一些实施方案中，与使用二维(2d)细胞培养物培养的dp来源的外泌体相比，多个外泌体具有(i)和(ii)中的至少一种。
14.本公开的实施方案还包括治疗皮肤病症或疾病的方法。根据这些实施方案，该方法包括向有需要的受试者施用源自真皮乳头细胞(dp)球体的多个外泌体。在一些实施方案中，施用多个外泌体调节受试者皮肤组织的至少一种特征。在一些实施方案中，多个外泌体包括以下中的至少一种：(i)增加的至少一种mirna的表达和/或(ii)减少的至少一种mirna的表达。在一些实施方案中，多个外泌体源自使用三维(3d)细胞培养物培养的dp球体。在一些实施方案中，与天然存在的dp来源的外泌体相比，多个外泌体包括(i)和(ii)中的至少一种。在一些实施方案中，与使用二维(2d)细胞培养物培养的dp来源的外泌体相比，多个外泌
体包括(i)和(ii)中的至少一种。
15.在一些实施方案中，多个外泌体通过注射、微量注射(微针)、皮内(id)注射、皮下(sc)注射、非侵入性方法、无针注射或局部施加向受试者的皮肤施用。
16.在一些实施方案中，调节受试者的皮肤组织的至少一种特征包括以下中的至少一种：(i)增加β-连环蛋白的表达；(ii)减少sfrp2的表达；(iii)增强dp细胞迁移和/或存活；(iv)增强毛囊生长；和/或(v)维持毛发周期的生长期。在一些实施方案中，调节(i)-(v)中的至少一种来治疗受试者的皮肤病症或疾病。在一些实施方案中，皮肤病症或疾病包括男性或女性型脱发、斑秃、休止期脱发或生长期脱发。
附图说明
17.图1a-1i：3d dp球体的制备和表征。(a)从触须中分离小鼠真皮乳头细胞(dp)。比例尺：500μm。(b)常规培养物使2d dp生长。比例尺：100μm。(c)超低细胞培养瓶中dp球体的生长。比例尺：100μm。(d)球体的cd133(绿色)和β-连环蛋白(红色)的双重染色。(e-f)角蛋白(e)和3d球体加载角蛋白的扫描电子显微镜(sem)图像。(f)一个明显的球体以黄色突出显示。(g)示出用于细胞保留研究的小鼠背部的注射部位的示意图。(h)将小鼠剃毛并注射在背部皮肤上，如(g)所示，在背部皮肤上使用不同的制剂。细胞通过did标记，然后再悬浮于pbs或角蛋白中进行皮内注射。在不同时间点拍摄体内成像系统(ivis)图像。(i)ivis图像的定量。数据显示为平均值
±
s.d.(n＝3只小鼠)。3d球体/角蛋白显示出最长的保留时间。
18.图2a至图2g：用5％米诺地尔的局部处理的毛囊期分别与注射2d dp细胞或3d球体的比较。(a)脱毛小鼠的处理侧(左)和远侧(右)的图示。(b)不同处理后β-连环蛋白在处理部位和远侧部位的表达。(c)示出不同处理后在处理部位和远侧部位的cd133表达的代表性图像。(d)ki67在处理部位和远侧部位不同处理后的表达。(e-g)β-连环蛋白阳性(β-连环蛋白
阳性
)(e)、cd133
阳性
(f)和ki67
阳性
细胞(g)的定量。粉红色表示处理部位，灰色表示远侧部位。n＝5，n.s.表示无显著差异，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
19.图3a至图3b：c57bl/6小鼠的背部毛发生长实验。(a)观察毛发覆盖率。将小鼠分成五组(n＝5)，并在其左半部进行处理。分别在第0、10、15和20天对小鼠进行成像。(b)第10、15和20天毛发覆盖率的定量。记录左侧和右侧部位。n＝5，n.s.表示无显著差异，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
20.图4a至图4e：采用各种处理的蛋白质印迹和免疫组织学。(a)第20天背部皮肤中β-连环蛋白、p-erk1/2、erk1/2、sfrp2和gapdh蛋白质含量的蛋白质印迹。b)按组对蛋白质印迹蛋白水平进行定量。n＝3，n.s.，无显著差异，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。(c)来自不同组的皮肤样品的sfrp2和β-连环蛋白的免疫荧光共染色。细胞核被4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(dapi，蓝色)染色。比例尺：50μm。(d)sfrp2的相对表达的定量。(e)β-连环蛋白相对表达的定量。n＝5，n.s.表示无显著差异，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
21.图5a至图5e：来自2d dp和3d dp球体的分泌组(secretome)。(a)示出dp球体如何通过因子和外泌体的迁移和分泌来促进毛发周期从退行期到休止期的转变的示意图。在生长期，生长中的dp的丰富来源是在毛囊隆起内。dp在退行期减少。dp的补充促进了生长期的开始。(b-e)2d dp-xo和3d dp-xo的表征。(b)tem图像。黄色箭头指出外泌体。比例尺：500μ
m。(c)nanosight的尺寸分布。(d)与2d dp-xo相比，3d dp-xo的前十个上调和十个下调mirna。(n＝3个生物学重复，每个生物学重复3个技术重复)。(e)示出fgf2和timp2驱动的毛囊调节和mir-218-5p诱导的毛囊发育的示意图。
22.图6a至图6g：外泌体处理对背部毛发再生的影响。(a)将小鼠分成三组(n＝4)并在其左侧进行处理。分别在第10天和第15天对小鼠进行成像。(b)对不同组进行相应的毛发覆盖率分析。记录左侧和右侧。3d dp-xo比米诺地尔和2d dp-xo更有效地促进毛囊生长。n＝4，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。(c)对来自不同处理组的皮肤样品上的sfrp2(绿色)和β-连环蛋白(红色)进行免疫荧光共染色。细胞核被dapi(蓝色)染色。比例尺：100μm。(d)sfrp2的相对表达的定量。n＝5，***p《0.001。(e)分别在注射阴性对照、mir-218-5p模拟物和抑制剂后第20天成像的代表性小鼠。红色圆圈表示注射点。注射部位有一个小秃点，这意味着递送方法需要进一步修改。(f)第15天三组毛发覆盖水平(％)的定量。n＝4，*p《0.05，**p《0.01。(g)富集mir-218-5p的外泌体和经由体内jetpei递送的mir-218-5p模拟物可以转染mir-218-5p以靶向sfrp2，从而上调wnt/β-连环蛋白途径；mir-218-5p将在一定程度上阻断这种信号传导。
23.图7a至图7b：dp球体的尺寸分布。(a)超低附着96孔板中的dp球体的四个代表性图像。比例尺：200μm。(b)球体的尺寸定量。
24.图8a至图8b：2d dp的免疫细胞化学。通过共聚焦成像证实dp的β-连环蛋白(a)和cd133(b)的表达。比例尺：100μm。
25.图9a至图9b：2d dp和3d dp球体上的cd133和β-连环蛋白表达。流式细胞术显示2d dp(a)和球体(b)的cd133和β-连环蛋白的表达。
26.图10：注射部位和远侧部位中did
阳性
细胞的定量。n＝5，**p《0.01，****p《0.0001。
27.图11a至图11d：处理后背部皮肤的马松三色和苏木精和伊红(h&e)染色。(a)代表性马松三色染色和(b)每组的h&e染色图像(比例尺：200μm)。(c)收集每组中毛皮最薄的背部皮肤并进行染色。马松三色染色(比例尺：200μm)。(d)收集每组中毛皮最厚的背部皮肤并进行染色。h&e染色(比例尺：60μm)。胶原层用黄色箭头标记。在(d)中，红色箭头指出毛囊。从左到右：pbs(皮内)、5％米诺地尔、角蛋白、3d球体(pbs)和3d球体(角蛋白)。
28.图12：细胞因子阵列揭示了由2d dp和3d dp球体分泌的因子之间的差异。n＝3，**p《0.01，****p《0.0001。
29.图13：常见外泌体标志物alix、cd9和cd81的蛋白质印迹。
30.图14：3d dp-xo和2d dp-xo的mirna阵列分析。(a)代表性mirna阵列显示3d dp-xo与2d dp-xo之间的mirna表达的差异。(b)mmu-mirna的倍数差异(3d/2d dp-xo)。(n＝3个生物学重复，每个生物学重复3个技术重复)。
31.图15a至图15b：2d dp-xo和3d dp球体-xo对细胞迁移的影响。(a)与外泌体一起孵育0h、12h和24h的细胞图像。比例尺：50μm。(b)对在间隙区域迁移的细胞进行定量。n＝3，*p《0.05，****p《0.0001。
32.图16：mir-218模拟物或抑制剂处理的皮肤样品的免疫组织化学。来自不同组的皮肤的sfrp2(绿色)和β-连环蛋白(红色)的免疫荧光共染色。细胞核被dapi(蓝色)染色。比例尺：50μm。
具体实施方式
33.本公开的实施方案提供了用于产生和维持源自真皮乳头细胞球体的外泌体的新颖组合物和方法。如本文进一步描述的，毛囊周期从休止期到生长期的进展是调节毛发再生的关键。真皮乳头细胞(dp)支持毛发生长并调节毛发周期。然而，随着培养，它们逐渐失去了关键的诱导特性。dp可以通过球体培养部分恢复其促进毛发再生的能力。在本公开中，发现dp球体有效促进毛囊周期从休止期到生长期(例如，与dp或5％米诺地尔相比)。由于旁分泌信号传导在此过程中的重要性，从dp细胞培养物中分离出分泌组和外泌体并比较它们的治疗功效。本公开的实施方案还表明，mir-218-5p在dp球体来源的外泌体中显著上调，并且dp球体来源的外泌体下调分泌型卷曲相关蛋白2(sfrp2)并上调β-连环蛋白，同时促进毛囊的发育和维持。
34.来自dp球体和dp的差异表达的分泌组或外泌体可能对调节毛囊周期很重要。最近，dp来源的分泌组和细胞外囊泡表现出促进毛发生长的作用，但其机制尚不清楚。与间充质干细胞来源的外泌体相比，dp来源的外泌体被证明是有效的tgf-β激活剂，并且被证明在促进人毛囊真皮乳头细胞的增殖和毛发生长方面很重要。三维(3d)培养已被证明是一种在分泌组中富集某些蛋白质和mirna的方法。以往的研究表明，源自3d dp的外泌体(3d dp-xo)促进dp细胞和外根鞘细胞的增殖，并增加dp细胞中的生长因子的表达。然而，来自2d dp和3d dp的差异表达的分泌组和mirna的重要性以及3d dp或3d dp-xo在促进毛发再生方面的可能机制尚未得到证实。
35.鉴于目前治疗脱发的方法的局限性，诸如非那雄胺和米诺地尔的暂时功效和可用的治疗数量有限，发现用于预防脱发和促进毛发再生的新疗法的需要仍然是一项紧迫且未满足的需要。虽然用体外培养的dp补充dp细胞是驱动毛囊周期中休止期向生长期转变的一种可能的方法，但是当在平坦的塑料表面上培养时，dp将随着时间的推移而失去其毛发诱导能力。例如，已观察到培养的dp细胞(例如，超过6次传代)在原位植入后不能诱导任何毛囊过渡到生长期。dp必须在毛囊球中凝结以促进毛囊形成。本公开的实施方案证明了与dp相比，dp球体的cd133和β-连环蛋白的表达更高，这表明dp球体可以在体内表现出更好的毛发生长诱导能力。
36.来自dp球体的分泌组也与分离的dp细胞的分泌组不同。研究人员已经表明，真皮球体在形态上类似于生长期的dp，其表达谱与2d细胞不同，但与完整的dp非常相似。移植的毛囊如何影响秃发区域的环境和旁分泌效应的证据并不充分。本公开的实施方案证明dp主要通过旁分泌机制发挥其对毛发周期的调节作用。β-连环蛋白的表达不仅在注射部位上调，而且也在远侧部位上调。dp释放多种生长因子和囊泡来调节毛囊生物学，并且已确定在球体中的培养最有效地在体外保留这些细胞的初始表型。注射外泌体以调节毛囊周期，而不是引入更多的dp以积累到毛囊中。球体来源的外泌体还增强了β-连环蛋白的表达并下调了sfrp2，从而正向调节毛囊生长并维持毛发周期的生长期。
37.虽然c57bl/6小鼠是用于筛选促进毛发生长的剂的有用模型，因为它们的皮肤色素沉着仅在生长期期间产生色素。导致脱发的激素、环境和/或遗传原因更适用于人类和其他哺乳动物。与米诺地尔相比，细胞或细胞分泌组疗法在治疗这些类型的脱发方面可以提供某些优势，因为米诺地尔的作用机制是增加流向治疗部位的皮肤血流量并引起细胞膜的过极化，从而允许更多的营养物到达毛囊和细胞。本公开的实施方案已证明，球体促进健康
小鼠的毛发周期从退行期到生长期。与米诺地尔相比，疾病相关模型或激素相关脱发模型可能同样受益于外泌体疗法的增强的治疗效果。
38.如本文进一步描述的，本公开的结果已证明富集某些mirna和调节基因(例如，mir-218-5p和timp2)的外泌体加速了生长期的开始，并且3d球体培养物为基于外泌体递送的细胞疗法提供了有价值的机制。如本文所提供的，mir-218-5p通过下调wnt信号传导抑制剂sfrp2来调节毛囊发育，从而促进β-连环蛋白，从而产生促进毛发发育和再生的正反馈环路。基于这些因子(例如，源自dp球体的外泌体)施用疗法提供了一种具有优于当前脱发治疗方法的微创替代方法。
39.本章节中使用的章节标题和本文的全部公开内容仅用于组织目的，并且不旨在进行限制。
40.1.定义
41.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。如有冲突，以本文档(包括定义)为准。下文描述了优选的方法和材料，但与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试。本文中提及的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入。本文公开的材料、方法和实例仅仅是说明性的而不是旨在作为限制性的。
42.如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体旨在为不排除附加动作或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文中另外明确指定，否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。本公开还涵盖了“包括”本文呈现的实施方案或要素、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施方案，无论是否明确阐述。
43.对于本文的数值范围的表述，明确设想了其间相同精度的每个居间数字。例如，对于6至9的范围，除了6和9之外还涵盖数字7和8，并且对于6.0至7.0的范围，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
44.如本文所用，“与
……
相关”是指与
……
相比。
45.如本文所用，术语“动物”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、猪、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)、苍蝇等。
46.术语“细胞培养过程”或“细胞培养”通常是指细胞在受控条件下生长或维持的过程。细胞培养过程可以在体外或离体进行。在一些实施方案中，细胞培养过程具有扩增期和生产期两者。在一些实施方案中，扩增期和生产期由过渡期或转变期分开。“培养”细胞是指在适于生长或维持细胞的条件下使细胞与细胞培养基接触。“细胞培养物”还可以指含有细胞的溶液。在一些实施方案中，细胞培养物可以是三维(3d)或二维(2d)。通常，2d细胞培养系统在通常由塑料制成的平盘上生长细胞。将细胞放置在涂覆的表面上，其中细胞粘附并以二维方式扩散。通常，3d细胞培养系统可以描述为在提供模拟组织和器官特定微架构的三维结构的微组装装置和支持件内培养活细胞(参见例如john w.haycock等人“3d cell culture:a review of current approaches and techniques”)。
47.术语“培养基”(medium)和“细胞培养基”(复数，“培养基”(media))通常是指用于生长或维持细胞的营养源。如本领域普通技术人员所理解的，生长培养基或细胞培养基是设计用于支持微生物、细胞或小植物的生长的液体或凝胶。细胞培养基通常包含适当的能
量来源和调节细胞周期的化合物。典型的培养基可由氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和作为生长因子、激素和附着因子的来源的血清的补体组成，但不限于这些。除了营养物之外，培养基还有助于维持ph和渗透压。
48.如本文所用，术语“组合物”是指包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。与药物组合物相关的这种术语旨在涵盖包含活性成分和构成载体的惰性成分的产品，以及由任何两种或更多种成分的组合、络合或聚集、或由一种或多种成分的解离、或由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产品。因此，本公开的组合物涵盖通过将本公开的组分(例如，源自人真皮乳头细胞(dp)球体的外泌体)和药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制成的任何组合物。当本公开的组分与一种或多种其他药物同时使用时，除了本公开的组分之外，还考虑含有这种其他药物的组合物。因此，除了本公开的组分之外，本公开的组合物还包含也含有一种或多种其他活性成分的那些。本公开的组分与第二活性成分的重量比可义变化并且将取决于每种成分的有效剂量。通常，将使用每种的有效剂量。本公开的组分和其他活性成分的组合通常也将在上述范围内，但在每种情况下，应使用每种活性成分的有效剂量。在这种组合中，本公开的组分和其他活性剂可以单独或结合施用。此外，一种组分的施用可以在其他剂施用之前、同时或之后。
49.如本文所用，术语“药物组合物”是指可施用于受试者以治疗或预防患者的疾病或病理状况的组合物(例如，源自人真皮乳头细胞(dp)球体的外泌体)。组合物可以根据已知的用于制备药学上有用的组合物的方法配制。此外，如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指任何标准的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以包括稀释剂、佐剂和媒介物，以及植入载体，以及不与本发明的活性成分反应的惰性、无毒的固体或液体填充剂、稀释剂或包封材料。实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水和乳液，诸如油/水乳液。载体可以是含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。含有药学上可接受的载体的制剂描述于本领域技术人员熟知且容易获得的许多来源中。例如，remington's pharmaceutical sciences(martin e w,remington's pharmaceutical sciences,easton pa.,mack publishing company,第19版增刊,1995)描述了可以与本发明结合使用的制剂。
50.适于施用的制剂包括例如水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，从而在使用之前仅需要无菌液体载体例如注射用水的条件。临时注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应当理解，除了上述具体提到的成分之外，本发明的制剂还可以包括本领域中关于所讨论的制剂类型的其他常规试剂。
51.如本文所用，术语“药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物”是指不干扰活性成分的有效性或活性并且对其所施用的宿主无毒并且经联邦或州政府的监管机构批准或列于美国药典或其他一般公认的药典中用于动物且更具体地用于人的培养基。载体、赋形剂或媒介物包括稀释剂、粘结剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、增量剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲液以及可能需要用于制备特定组合物的各种材料，诸如吸收剂。载体等的实例包括但不限于盐
水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合。此类培养基和试剂用于活性物质的用途在本领域中是众所周知的。
52.如本文所用，术语“源自”是指细胞或生物样品(例如，血液、组织、体液等)并指示细胞或生物样品是在某个时间点从所述来源获得的。例如，源自个体的细胞可以表示直接从个体获得的(例如，未修饰的)原代细胞。在一些情况下，源自给定来源的细胞经历一轮或多轮细胞分裂和/或细胞分化，使得原始细胞不再存在，但是后续细胞(例如，来自所有世代的子细胞)将被理解为源自同一来源。该术语包括直接获得、分离和培养，或获得、冷冻和解冻。术语“源自”还可以指从组织或细胞获得的细胞的组分或片段(例如，细胞外囊泡、外泌体、脂质体等)。术语“源自”还可以指来自组织或细胞的细胞的组分或片段，包括但不限于蛋白质、核酸、膜或膜的片段等。
53.当提及细胞或分子(例如，核酸或蛋白质)时，术语“分离”或“分离的”表示该细胞或分子与或已经与其天然、原始或先前环境分离。例如，分离的细胞可以从源自其宿主个体的组织中取出，但是可以在存在其他细胞的情况下存在(例如，在培养物中)，或者可以重新引入到其宿主个体中。
54.如本文所用，本文使用的术语“受试者”和“患者”可互换地指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲骆、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。在一个实施方案中，受试者是人。受试者或患者可以经历多种形式的治疗。
55.如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”在本文中各自可互换使用以描述逆转、减轻或抑制该术语适用的疾病和/或损伤或这种疾病的一种或多种症状的进展。取决于受试者的状况，该术语还指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可以以急性或慢性方式进行。该术语还指在患上该疾病之前降低疾病或与该疾病相关的症状的严重程度。这种在患病之前预防或降低疾病的严重程度是指向在施用时未患有疾病的受试者施用治疗。“预防”还指预防疾病或与这种疾病相关的一种或多种症状的复发。
56.如本文所用，术语“施用”组合物是指向需要治疗(例如，与毛囊发育相关的疾病和病症的治疗)的受试者提供本公开的组合物。本公开的组合物可以通过口服、肠胃外(例如，肌内、腹腔内、静脉内、icv、脑池内注射或输注、皮下注射、喷雾或植入)、通过吸入喷雾、鼻、阴道、直肠、舌下或局部施用途径施用，并且可以单独或一起配制成含有适合于每种施用途径的常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的合适剂量单位制剂。
57.除非本文另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交结合使用的任何术语和所述领域的技术是本领域公知和通常使用的那些。术语的含义和范围应该是清楚的；然而，如果存在任何潜在的歧义，则本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。另外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
58.2.组合物和方法
59.本公开提供了与使用源自人真皮乳头(dp)细胞的外泌体有关的组合物和方法。具
体地讲，本公开提供了用于产生和维持源自dp球体的外泌体的新型组合物和方法，以及用于将外泌体递送至受试者以用于各种治疗目的诸如治疗与毛囊发育相关的疾病和病症的组合物和方法。
60.本公开的实施方案包括一种组合物，该组合物包含源自人真皮乳头细胞(dp)球体的多个外泌体。根据这些实施方案，多个外泌体包含增强毛囊发育和促进毛发生长的各种因子。在一些实施方案中，多个外泌体源自使用三维(3d)细胞培养物培养的dp球体。在一些实施方案中，与天然存在的dp来源的外泌体相比，或与使用二维(2d)细胞培养物的dp来源的外泌体相比，多个外泌体富集多种因子(例如，mirna和/或毛囊调节基因)。来自3d细胞培养物的dp来源的外泌体可由于增加的表达、丰度、活性或功效程度和/或它们的任何组合而富集多种因子。
61.在一些实施方案中，本公开的外泌体表现出增加的至少一种mirna的表达。在一些实施方案中，外泌体富集mir-218-5p、let-7f-5p、let-7g-5p、let-7d-5p、mir-16-5p、let-7a-5p、mir15b-5p、mir-155-5p、mir-23b-3p、mir-22-3p、mir-125b-5p、mir-21a-5p、mir-24-3p、let-7e-5p、mir-34c-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-125a-5p、mir-138-5p、mir-17-5p、mir-541-5p、mir-196a-5p、mir-27b-3p、let-7i-5p、mir-872-5p、let-7c-5p、mir-28c、mir-99a-5p、mir-27a-3p、mir-140-5p、mir-106b-5p、mir-9-5p、mir-23a-3p、mir-30c-5p、let-7b-5p、mir-191-5p或它们的任何组合或具有增加的它们的表达。在一些实施方案中，外泌体富集mir-218-5p、let-7f-5p和let-7g-5p或它们的任何组合或具有增加的它们的表达。在一些实施方案中，与天然存在的外泌体或来自2d细胞培养物的外泌体相比，mirna具有至少1.1倍的更高表达或更高丰度。在一些实施方案中，与天然存在的外泌体或来自2d细胞培养物的外泌体相比，mirna具有至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍的更高表达或更高丰度。在一些实施方案中，外泌体使mir-218-5p的表达增加至少25倍。
62.在一些实施方案中，本公开的外泌体表现出减少的至少一种mirna的表达。在一些实施方案中，外泌体减少或具有减少的mir-31-5p、mir-29b-3p、mir-322-5p、mir-140-3p、mir-25-3p、mir-146a-5p、mir-30e-5p、mir-92a-3p、mir-20a-5p、mir-183-5p、mir-19b-3p、mir-744-5p、mir-291a-3p、mir-186-5p、mir-30a-5p、mir-199a-5p、mir-101a-3p、mir-18a-5p、mir-425-5p、mir-19a-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-214-3p、mir-182-5p、mir-130a-3p、mir-10a-5p、mir-30d-5p、mir-150-5p、mir-467e-5p、mir-124-3p、mir-196b-5p、mir-10b-5p、mir-15a-5p、mir-142a-3p、mir-488-3p、mir-411-5p、mir-503-5p、mir-96-5p、mir-1a-3p、mir-302d-3p、mir-467c-5p、mir-142a-5p、mir-32-5p、mir-144-3p、mir-880-3p、mir-295-3p、mir-141-3p、mir-335-5p或它们的任何组合的表达。在一些实施方案中，外泌体减少或具有减少的mir-335-5p、mir-141-3p、mir-295-3p、mir-880-3p、mir-144-3p、mir-32-5p、mir-142a-5p或它们的任何组合的表达。在一些实施方案中，与天然存在的外泌体或来自2d细胞培养物的外泌体相比，mirna的表达减少或以至少0.9倍的更低丰度存在。在一些实施方案中，与天然存在的外泌体或来自2d细胞培养物的外泌体相比，mirna具有至少0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.45倍、0.4倍、0.35倍、0.3倍、0.25倍、0.2倍、0.15倍、0.1
5p、mir-155-5p、mir-23b-3p、mir-22-3p、mir-125b-5p、mir-21a-5p、mir-24-3p、let-7e-5p、mir-34c-5p、mir-29a-3p、mir-93-5p、mir-125a-5p、mir-138-5p、mir-17-5p、mir-541-5p、mir-196a-5p、mir-27b-3p、let-7i-5p、mir-872-5p、let-7c-5p、mir-28c、mir-99a-5p、mir-27a-3p、mir-140-5p、mir-106b-5p、mir-9-5p、mir-23a-3p、mir-30c-5p、let-7b-5p、mir-191-5p或它们的任何组合的表达或富集的外泌体。在一些实施方案中，与天然存在的dp来源的外泌体相比，或与使用二维(2d)细胞培养物的dp来源的外泌体相比，多个外泌体具有减少量的多种因子(例如，mirna和/或毛囊调节基因)。在一些实施方案中，该方法包括产生具有减少的mir-31-5p、mir-29b-3p、mir-322-5p、mir-140-3p、mir-25-3p、mir-146a-5p、mir-30e-5p、mir-92a-3p、mir-20a-5p、mir-183-5p、mir-19b-3p、mir-744-5p、mir-291a-3p、mir-186-5p、mir-30a-5p、mir-199a-5p、mir-101a-3p、mir-18a-5p、mir-425-5p、mir-19a-3p、mir-126a-3p、mir-126a-5p、mir-214-3p、mir-182-5p、mir-130a-3p、mir-10a-5p、mir-30d-5p、mir-150-5p、mir-467e-5p、mir-124-3p、mir-196b-5p、mir-10b-5p、mir-15a-5p、mir-142a-3p、mir-488-3p、mir-411-5p、mir-503-5p、mir-96-5p、mir-1a-3p、mir-302d-3p、mir-467c-5p、mir-142a-5p、mir-32-5p、mir-144-3p、mir-880-3p、mir-295-3p、mir-141-3p、mir-335-5p或它们的任何组合的表达的外泌体。在一些实施方案中，该方法包括产生具有增加的至少一种毛囊调节基因诸如fgf2和/或timp2的表达或富集的外泌体。在一些实施方案中，多个外泌体通过注射、微量注射(微针)、皮内(id)注射、皮下(sc)注射、非侵入性方法、无针注射或局部施加向受试者的皮肤施用。
66.在一些实施方案中，调节受试者的皮肤组织的至少一种特征包括增加β-连环蛋白的表达、减少sfrp2的表达、增强dp细胞迁移和/或存活、增强毛囊生长和/或维持毛发周期的生长期。在一些实施方案中，调节这些方面中的任何一个或多个治疗受试者的皮肤病症或疾病。在一些实施方案中，皮肤病症或疾病包括男性或女性型脱发、斑秃、休止期脱发或生长期脱发。
67.如本领域普通技术人员将基于本公开认识到的，与天然存在的dp来源的外泌体或使用二维(2d)细胞培养物培养的dp来源的外泌体相比，在dp球体来源的外泌体中富集的本文公开的多种因子(例如，mirna和/或毛囊调节基因)可包括在治疗性组合物中并用于治疗存在或不存在外泌体或球体的脱发病症，并且可以使用本领域已知的方法(例如，靶向基因递送)递送至受试者。在一些实施方案中，这些因子还可以包含在由合成工程化的外泌体或球体或本领域已知的其他类似递送囊泡组成的治疗性组合物中。
68.在一些实施方案中，本公开的组合物包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。药学上可接受的赋形剂和/或载体或诊断上可接受的赋形剂和/或载体包括但不限于无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲溶液、基于氨基酸的缓冲液或碳酸氢盐缓冲溶液。所选择的赋形剂和所使用的赋形剂的量将取决于施用模式。特定受试者/患者的有效量可能会根据诸如所治疗的病症、患者的整体健康状况、施用途径和剂量以及副作用的严重程度等因素而变化。可获得关于治疗和诊断方法的指导(参见例如maynard等人(1996)a handbook of sops for good clinical practice,interpharm press,boca raton,fla.；dent(2001)good laboratory and good clinical practice,urch publ.,london,uk)。对于本文所述的包含细胞外囊泡(例如，外泌体)的任何组合物，治疗有效量可以最初从动物模型确定。治疗有效剂量也可以根据已知表现出类似的药理活性的人类数据诸如其他佐剂来确定。肠胃
外施用可能需要更高的剂量。施加的剂量可以基于所施用的细胞外囊泡(例如，外泌体)和任何相应的货物(例如，微小rna)的相对生物利用度和效力来调整。基于上述方法和本领域熟知的其他方法调整剂量以实现最大功效在本领域普通技术人员的能力范围内。
69.药学上可接受的赋形剂和/或载体或诊断上可接受的赋形剂和/或载体包括但不限于无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲溶液、基于氨基酸的缓冲液或碳酸氢盐缓冲溶液。所选择的赋形剂和所使用的赋形剂的量将取决于施用模式。特定受试者/患者的有效量可能会根据诸如所治疗的病症、患者的整体健康状况、施用途径和剂量以及副作用的严重程度等因素而变化。可获得关于治疗和诊断方法的指导(参见例如maynard等人(1996)a handbook of sops for good clinical practice,interpharm press,boca raton,fla.；dent(2001)good laboratory and good clinical practice,urch publ.,london,uk)。对于本文所述的包含细胞外囊泡(例如，外泌体)的任何组合物，治疗有效量可以最初从动物模型确定。治疗有效剂量也可以根据已知表现出类似的药理活性的人类数据诸如其他佐剂来确定。肠胃外施用可能需要更高的剂量。施加的剂量可以基于所施用的细胞外囊泡和任何相应的货物(例如，微小rna)的相对生物利用度和效力来调整。基于上述方法和本领域熟知的其他方法调整剂量以实现最大功效在本领域普通技术人员的能力范围内。
70.本公开的各种组合物提供了赋予优势和/或有益的药代动力学特征的剂型、制剂和方法。本公开的组合物可用于呈纯或基本上纯的形式、呈其药学上可接受的盐的形式以及也呈包括无水或水合形式的其他形式的剂型中。有益的药代动力学特征可通过施用适于一天一次、两次或三次或更多次施用的制剂或剂型来获得，该制剂或剂型包含一种或多种本公开的组合物，其以足以向用于治疗本文公开的疾病(特别是癌症)的使用环境提供所需浓度或剂量的组合物的量存在。
71.本公开的药物或治疗可以包括单位剂量的至少一种本公开的组合物以提供治疗效果。“单位剂量”或“剂量单位”是指单位的(例如，单个剂量)，其能够施用于患者，并且其可以容易地处理和包装，保持为物理和化学稳定的单位剂量，其包含活性剂本身或与一种或多种固体或液体药物赋形剂、载体或媒介物的混合物。
72.3.材料和方法
73.从c57bl/6小鼠中分离真皮乳头细胞。从安乐死的c57bl/6小鼠切下触须垫，然后在pbs中冲洗三次。将毛囊解剖并在培养箱中用0.25％分散酶(stemcell technologies)孵育20分钟。然后，在真皮乳头上方进行水平切割。然后，将毛囊球转移到大鼠尾胶原i(sigma-aldrich)涂覆的盘中。使用伊格尔最低限度必需培养基(mem；gibco)、10％ fbs(corning)、1％青霉素-链霉素和10ng/ml bfgf(fisher scientific)作为dp培养基。大约三天后，dp从球中生长出来。然后，洗掉毛囊球并将其放置在新鲜培养基中。dp在一周后到达汇合处。
74.2d细胞和3d球体培养。对于2d培养物，使用大鼠尾胶原i涂覆的烧瓶进行传代。使用第3-6代dp。对于3d培养，将dp接种在超低附着96孔板(corning，5
×
104个/孔)中以计数球体的数量。在接种后第2天形成球体。第5-7天，将球体用于动物研究。将dp培养基(mem、10％fbs、1％青霉素-链霉素和10ng/ml bfgf)用于细胞培养。为了收集条件培养基或外泌体，一旦细胞达到80％汇合，就将dp培养基更换为碱性mem培养基(无fbs)。然后收集条件培养基(三天)。
75.分泌组和外泌体分离和分析。经由ultra-15离心过滤单元(3kda截止)浓缩条件培养基并用pbs洗涤一次。经由ultra-15离心过滤单元(100kda截止)浓缩外泌体并用pbs洗涤一次。根据制造商的说明书使用小鼠血管生成阵列(raybio)和mirna pcr阵列小鼠mifinder(qiagen)。
76.角蛋白水凝胶的制备。角蛋白水凝胶根据先前公布的经过修改的方法制备。简言之，用水洗涤毛发(局部理发)，然后将毛发切成小块。然后，将毛发片段用2.5％(w/v)过乙酸处理过夜，然后用流水彻底洗涤。将毛发片段浸入150mm tris碱中两小时以提取蛋白质。然后，经由40μm筛去除纤维，通过对di水(用3kda分子截止透析膜，fisher scientific)进行透析纯化并冷冻干燥(冻干)后，获得澄清溶液。将所得冻干固体进一步研磨成细粉。通过用pbs重构细粉来制备百分之十五角蛋白水凝胶(w/v)。将球体分散在角蛋白溶液中并置于培养箱中过夜，同时角蛋白形成水凝胶。
77.扫描电子显微镜(sem)。通过sem观察水凝胶的形态。将样品用2％戊二醛固定，然后在梯度乙醇中连续脱水10分钟。然后将它们在六甲基二硅氮烷(sigma-aldrich)中干燥。在成像之前用金溅镀凝胶(jeol 6010la sem,jeol ltd,japan)。
78.动物和体内研究。从jackson实验室购买七周龄雄性c57bl/6小鼠，并使其适应新环境1周。通过使用脱毛膏去除毛发以观察粉红色皮肤。然后，将动物随机分组(n＝5)，以研究毛发再生。每天局部施用米诺地尔作为阳性对照。皮下给予其他处理。使用小鼠的所有工作均符合iacuc。细胞处理剂量：将200μl pbs中的1.0
×
106个细胞皮下注射到背部皮肤左侧的10个点(每个部位20μl)中。外泌体处理剂量：将200μl pbs中的2.0
×
109个外泌体皮下注射到背部左侧的10个点(每个部位20μl)。阴性对照，mir-218-5p模拟物和抑制剂(sigma-aldrich)：根据由体内-jetpei
tm
(polyplus transfection)提供的方案施用。简言之，小鼠每块脱毛的背部皮肤接受十次注射。将400ng mirna模拟物或抑制剂溶解于90μl 5％葡萄糖(w/v)溶液中，然后添加10μl体内-jet pei溶液。立即将溶液涡旋混合，并在注射前在室温下孵育15分钟。将对照组注射模拟对照。
79.皮肤组织学。将小鼠安乐死并去除整个背部皮肤。将皮肤组织固定在4％多聚甲醛中，然后通过使用cryostat将皮肤组织切割成5μm厚的切片。根据方案对苏木精和伊红(h&e)和马松三色进行染色。对于免疫荧光组织化学，使用的一级抗体：小鼠抗β-连环蛋白(abcam，ab6301)和兔抗cd133抗体(ab19898)、兔抗ki67抗体(ab16667)和兔sfrp2(ab137560)。使用的二级抗体：山羊抗小鼠igg(alexa488)(ab150113)、山羊抗兔igg(alexa488)(ab150077)和山羊抗小鼠igg(alexa555)(ab150114)。
80.蛋白质印迹。加载样品并将其与标准梯度(precision plus protein
tm standards,bio-rad)进行比较。一级抗体：小鼠抗β-连环蛋白(abcam,ab6301)、兔sfrp2(ab137560)、抗erk1(pt202/py204) erk2(pt185/py187)抗体[mapk-yt](ab50011)、抗erk1 erk2抗体(ab17942)和抗gapdh抗体(hrp)(ab9482)。
[0081]
统计分析。除非另有说明，否则所有定量实验均一式三份进行。数据显示为平均值
±
sem，并通过双尾非配对学生t检验进行分析以便在两组之间进行比较。使用单向方差分析(anova)分析多于两组之间的数据比较，然后进行事后bonferroni检验。通过使用双向anova分析分组样品之间的数据。p值小于0.05的差异被认为具有统计学显著性。
[0082]
4.实施例
[0083]
对于本领域技术人员来说将显而易见的是，本文描述的本公开的方法的其他合适的修改和改变是容易适用和可理解的，并且可以在不脱离本公开的范围或本文公开的方面和实施方案的情况下使用合适的等效物进行。现在已经对本公开进行了详细描述，通过参考以下实施例将更清楚地理解本公开，这些实施例仅用于示出本公开的一些方面和实施方案，并且不应被视为对本公开的范围进行限制。本文提及的所有期刊参考文献、美国专利和出版物的公开内容均以引用方式整体并入本文。
[0084]
本公开具有多个方面，由以下非限制性实施例说明。
[0085]
实施例1
[0086]
dp球体在体外增强β-连环蛋白和cd133的表达和体内移植植入。c57bl/6小鼠被广泛用于毛发生理学研究中，因为在它们的背部脱毛后，当小鼠长到七周龄时，该区域的所有毛囊都会进入暂停阶段。从c57bl/6小鼠的胡须中分离出dp。在本公开中培养和使用第3-6代。图1a示出dp从毛囊球中生长出来，并且当它们形成多层平行阵列时，它们表现出纺锤样形状。在传代后，dp显示为扁平的多边形形态(图1b)。通过将dp传代到低附着烧瓶中来形成dp球体。球体直径为100-300μm(图1c；图7)并表达cd133(绿色)和β-连环蛋白(红色)的强免疫荧光信号(图1d)。在二维(2d)培养的dp中，cd133和β-连环蛋白的表达较低(图8)。在球体中，由于细胞间接触的增加，β-连环蛋白的表达增强。cd133表达也被分析并在球体中得到增强。cd133阳性dp细胞在体内表现出毛发诱导能力。这通过流式细胞术进一步证实。在来自球体的门控细胞中证实了增强的信号强度(图9)。
[0087]
为了比较移植后的细胞存活率，将用did(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青、4-氯苯磺酸盐)染色的dp和dp球体注射到c57bl/6小鼠的脱毛背部。毛发角蛋白已经作为细胞培养支架在体外和体内进行了研究，因为它们是自体、易于提取、可降解和生物相容的。dp的活力在封装过程中得以保留，并在角蛋白水凝胶的多孔微结构中保持。如图1e至图1f所示，角蛋白水凝胶和球体的网络在水凝胶内部自组装。收集2d细胞或3d球体并将其分布在pbs或角蛋白水凝胶(105个细胞/20μl)中以用于皮下施用。为了提高移植后的细胞存活率，比较了dp/pbs、dp/角蛋白、dp球体/pbs和dp球体/角蛋白(图1g)。ivis证明球体在注射后表现出增强的保留率和存活率(图1f至图1i)。角蛋白进一步支持细胞附着和增殖。dp球体/角蛋白水凝胶在移植到小鼠的背部皮肤上之后维持高细胞活力。
[0088]
实施例2
[0089]
dp球体增强β-连环蛋白、cd133和ki67在体内毛囊中的表达。在脱毛之后将dp和dp球体注射到小鼠的一侧中(十次一次性注射，均匀分布在处理侧上，在20μl中105个细胞/点)，或每天在处理侧上局部处理5％米诺地尔(图2a)。十天后，从注射部位(左侧)和未处理部位(右侧)均采集背部皮肤样品。十天后，收集背部皮肤的注射部位(左侧)和远侧部位(右侧)两者。将β-连环蛋白、cd133和ki67染色(图2b至图2d)以比较dp、dp球体和5％米诺地尔的毛囊诱导机制。相应的定量结果示出于图2e至图2g中。
[0090]
米诺地尔对毛囊产生血管舒张作用，直接导致毛囊细胞增殖。在处理侧，5％米诺地尔在第10天促进了处理侧的ki67的表达至37.2％，但没有促进β-连环蛋白(2.3％)和cd133(7.2％)的表达，这表明整个毛囊细胞的增殖和生长受到非特异性促进。相比之下，2d dp的注射增强了处理侧的β-连环蛋白(19.1％)和cd133(9.8％)、未处理侧的β-连环蛋白(19.9％)和cd133(6.8％)的表达。3d dp球体的注射增强了处理侧的β-连环蛋白(32.6％)
和cd133(19.1％)、未处理侧的β-连环蛋白(27.8％)和cd133(13.7％)的表达。与米诺地尔相比，两者均在未处理部位显示出一定量的细胞迁移和未处理侧的β-连环蛋白、cd133和ki67的表达增强。具体地讲，与dp组相比，dp球体显示出更强的β-连环蛋白和cd133染色。然而，米诺地尔没有改变两侧的b-连环蛋白或cd133表达。对于米诺地尔、2d dp和3d dp，处理侧的ki67信号分别为37.2％、37.4％和39.5％，无显著差异，然而，未处理侧的ki67信号分别为7.1％、12.6％和17.5％。细胞迁移和活力(红色信号)可能有助于这种远侧促进。该研究表明，植入的细胞不仅影响注射部位的毛囊，而且还调节未处理区域的毛囊。dp球体植入更有效地调节毛囊生长。此外，由于皮肤中细胞的迁移非常有限，因此旁分泌效应也可能是此过程中的一个重要机制。
[0091]
实施例3
[0092]
dp球体处理可加速c57bl/6小鼠的毛发再生。c57bl/6小鼠广泛用于毛发生理学研究，因为所有毛囊在约7周脱毛后进入暂停阶段。在本公开中使用八周龄雄性c57bl/6小鼠。脱毛后皮肤呈粉红色，并且在处理过程中颜色越来越暗。将米诺地尔(用于脱发的金标准处理)用作阳性对照。据报道，培养的dp逐渐失去其毛发诱导能力。鉴于2d培养的dp施用的有限作用(参见例如图2)，进一步研究3d球体的毛囊诱导能力。
[0093]
在第0、10、15和20天拍摄脱毛小鼠的毛发再生状态，并通过形态观察分析毛发生长区域(图3a至图3d)。在第10天，米诺地尔组和细胞处理组开始出现黑色素沉着。dp球体/角蛋白组中的所有小鼠都表现出比其他组更暗的皮肤。在第15天，米诺地尔组的处理侧的毛皮覆盖率为35％，未处理侧为10％。dp球体/pbs组毛皮覆盖率平均为40％，dp球体/角蛋白的毛皮覆盖率为约90％。pbs中细胞的移植和存活率不均匀，由此产生的治疗效果也是如此，而角蛋白提高了球体的整体移植和细胞存活率。
[0094]
masson三色和h&e染色表明，dp球体/角蛋白处理组与其他组相比产生了更大的毛囊和更多的胶原分布(图11a至图11b)。静止毛囊过渡到生长期导致毛囊尺寸增加。相比之下，与用dp球体处理的组相比，对照组具有较小的毛囊和较薄的胶原层。dp球体的注射没有诱导皮肤组织的炎症，因为这些细胞是自体的。此外，角蛋白水凝胶在体内未诱发急性免疫应答。收集每个组中最薄的毛皮区域(没有可见的毛发；图11c)和最厚的毛皮区域(有毛发，图11d)。图11c中3d球体组中较深和较厚的毛囊很明显。在pbs组中，即使存在毛发生长，也仅表层毛囊进入生长期周期(图11d)。
[0095]
实施例4
[0096]
dp球体通过上调β-连环蛋白来加速毛囊生长期的发生。为了阐明分子机制，在通过蛋白质印迹处理20天后在脱毛的背部皮肤中分析β-连环蛋白、细胞外信号调节蛋白激酶1和2(erk
1/2
)、磷酸-erk1/2(p-erk
1/2
)、分泌型卷曲相关蛋白2(sfrp2)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)的蛋白质水平(图4a至图4b)。结果表明，与对照组和米诺地尔组相比，dp球体组中β-连环蛋白和p-erk
1/2
的表达上调，sfrp2的表达下调。wnt/β-连环蛋白途径已被证明在调节毛发周期、促进毛发生长方面具有关键作用。β-连环蛋白是毛囊生长的关键调节因子，并且据报道它是生长期的主要引发剂。据报道，sfrp2通过在核转位中下调β-连环蛋白在若干细胞活动和生物过程中起作用。这些结果表明，dp球体可通过上调wnt途径中的β-连环蛋白信号传导来激活毛囊发育。还进行了sfrp2和β-连环蛋白的免疫荧光染色(图4c至图4e)以进一步确认球体/角蛋白组中sfrp2的下调和β-连环蛋白的上调。因此，dp球体培养可以
是在用于脱发处理的细胞施用之前改善dp治疗效力的有效策略。
[0097]
实施例5
[0098]
dp与dp球体之间蛋白质和microrna谱的比较。dp球体不仅影响局部注射部位，还由于旁分泌信号传导而影响远侧区域毛囊周期的调节。dp通过释放各种生长因子和外泌体来刺激毛囊发育并调节间充质-上皮相互作用(图5a)。分离并检测来自dp和dp球体的外泌体和条件培养基。与其他处理组相比，球体分泌组导致bfgf和timp2的表达水平显著较高(图12)。透射电子显微镜(tem,fei talos f200x)图像示出外泌体的形状(图5b)。dp来源的外泌体(dp-xo)的平均尺寸为约180nm，并且dp球体来源的外泌体(dp球体-xo)的平均尺寸为约130nm(图4c)。图13示出外泌体标志物alix、cd9和cd81。为了比较外泌体中的mirna，进行了mirna阵列，并且结果表明dp球体-xo以显著高于dp-xo的水平表达mir-218-5p(图5d和图14)。
[0099]
如图5e所示，bfgf可以被细胞膜上结合的fgfr接受，并上调p-erk1/2的表达，从而调节β-连环蛋白的表达。已知timp2抑制mmp2的表达，这可能阻碍dp的迁移和增殖。生长因子参与促进毛发生长周期，并且bfgf的作用机制之前已得到证实。尽管bfgf和timp2在球体分泌组中较高，但与2d细胞分泌组相比，它们大约增加了一倍；而mir-218-5p富集了25倍。
[0100]
实施例6
[0101]
用于毛发再生的dp球体来源的外泌体处理。基于细胞的疗法是在实现毛囊新生过程中向前迈出的有希望的一步。然而，利用细胞组分通过作为治疗性催化剂将得到甚至更方便的治疗性产品，从而避免细胞作为治疗性载体。外泌体和分泌组都可能有助于毛发生长过程，与2d dp相比，外泌体中差异表达的mir-218-5p可能有助于3d球体在促进毛发生长方面具有更高的功效。此外，根据文献，mir-218-5p直接靶向sfrp2，因此它上调wnt/β-连环蛋白途径。因此，mir-218-5p上调的外泌体是本研究的主要研究对象。
[0102]
实验结果表明，与来自2d细胞的外泌体相比，来自球体的外泌体有效地促进dp迁移(图15)，因此它具有促进dp迁移到毛囊球的潜力。然后，对c57bl/6小鼠进行体内实验。向背部皮肤的一侧施用外泌体(图2a)并与5％米诺地尔局部处理进行比较。在形态学观察(图6a)和相应的定量(图6b)中，2d dp-xo的治疗功效未显示与米诺地尔组的显著差异，而3d dp球体-xo加速毛发生长并且效果与细胞处理相当。为了探索处理后皮肤中sfrp2和β-连环蛋白表达的变化，在第15天从不同组采集背部皮肤。免疫染色证实，与用2d dp-xo和米诺地尔处理的组相比，dp球体-xo组的β-连环蛋白表达增加。dp球体-xo可通过下调sfrp2和上调β-连环蛋白来调节毛发生长周期(图6c至图6d)。由于mir-218-5p直接靶向sfrp2，因此使用mir-218-5p模拟物和抑制剂来进一步验证mir-218-5p富集的重要性。
[0103]
实施例7
[0104]
mir-218-5p在外泌体介导的毛发再生中起着至关重要的作用。mirna处理的主要挑战之一是递送。考虑到毛囊中细胞的不同类型，体外模型不能准确反映mir-218-5p是否在调节毛囊生长中发挥重要作用。在本文中，根据制造商的说明书将mmu-mir-218-5p模拟物与pei(体内-jetpei
tm
；polyplus transfection,illkirch,france)混合。将pei/阴性对照、pei/模拟物或pei/抑制剂复合物溶液(每个部位10μl)小心地皮下施用到脱毛小鼠的背部皮肤中(图6e)。通过靶向sfrp2，mir-218-5p模拟物促进毛囊发育，而mir-218-5p抑制剂抑制毛囊周期中生长期的开始。与对照组和mir-218-5p抑制剂相比，mir-218-5p模拟物的
处理显示出显著的毛发再生效果。然而，在第20天，这种效果(50％～90％的毛发覆盖率)不如外泌体处理(95％～100％的毛发覆盖率)有效。这些数据表明外泌体含有多种mirna和蛋白质。mir-218-5p仅是一种参与促进毛发生长的物质。
[0105]
使用各种不同的策略来促进毛发生长。如图6g所示，富集mir-218-5p的外泌体和被体内pei包裹的mir-218-5p模拟物均促进了mir-218-5p的转录。mir-218-5p的遗传结构表明它会直接靶向sfrp2。为了证明mir-218-5p和wnt信号传导在毛发生长周期中的调节作用，通过蛋白质印迹检查了转录介质、sfrp2和β-连环蛋白。皮肤样品(第15天)显示mir-218-5p模拟稳健增加的内源性β-连环蛋白表达，而用mir-218-5p抑制剂处理显示减少的β-连环蛋白表达(图16)。
[0106]
这些数据共同支持了富集mir-218-5p的外泌体通过下调wnt信号传导sfrp2的抑制剂和上调β-连环蛋白来刺激wnt信号传导的主要机制。