基因修饰的T细胞及其用途

基因修饰的t细胞及其用途
技术领域
1.本发明总体上涉及生物技术和细胞疗法领域。具体而言，本发明涉及用于癌症免疫疗法的基因修饰的t细胞、它们的制备方法和在有需要的患者中的用途。


背景技术：

2.携带嵌合抗原受体(car)的t淋巴细胞的过继转移在消除某些类型的血液癌症的实质性负荷方面非常有效，并且已被美国食品和药物管理局(fda)批准用于治疗b细胞白血病。car构建体将b细胞分泌的单克隆抗体的特异性和高亲和力结合功能与t细胞受体(tcr)的细胞内信号传导结构域和t细胞的细胞毒性能力相结合，以将t细胞重新引导至癌细胞并实现有效杀伤靶细胞。car对t细胞的激活不依赖于tcr与主要组织相容性复合物(mhc)-肽复合物之间的相互作用，从而克服了肿瘤细胞经常使用的免疫逃避机制，例如mhc i类分子的下调和抗原加工缺陷的发生。
3.第一代car由细胞外肿瘤特异性结构域(例如来自单克隆抗体的单链可变片段(scfv))、跨膜结构域和用于t细胞活化的细胞内信号传导部分组成。尽管付出了巨大的努力，但第一代car-t细胞的研究并没有达到预期的临床结果，主要是因为car-t细胞增殖不足，导致体内寿命短，肿瘤杀伤力不足。
4.t细胞的完全活化需要两个信号。第一个信号是抗原特异性的，通过与抗原呈递细胞表面上的抗原肽-mhc复合物相互作用的t细胞受体(tcr)提供。第二个信号是抗原非特异性的，通过抗原呈递细胞上表达的共刺激分子与t细胞上的共刺激受体之间的相互作用传递。一个这样的实例是b7配体与共刺激受体cd28的相互作用；4-1bb配体(cd137l)与4-1bb(cd137)受体之间的相互作用是另一个实例。共刺激信号促进抗原呈递细胞和/或活化的t细胞本身产生的细胞因子的合成和分泌。第二个信号对于适当t细胞活化而没有无能是至关重要的，可促进活化的t细胞的长期增殖。鉴于双重信号传导对t细胞活化的重要作用，第二代car包括细胞内共刺激部分，例如来自cd28和4-1bb受体的部分，并显著改善了修饰的car-t细胞的功能，尤其是car-t细胞的体内增殖和持久性，使这些car-t细胞在患者体内成为“真正的活的药物”。
5.虽然car-t细胞的过继转移构成了一种非常有前景的白血病治疗策略，但是由于实体瘤的特殊病理生理学特征，将该方法转化用于非血液恶性肿瘤具有挑战性。针对实体瘤的临床car-t细胞技术的主要限制包括影响靶抗原选择的因素(例如肿瘤异质性和抗原丢失变体)、肿瘤微环境(tme)的内在负调控机制(例如pd-l1/pd-1信号转导通路)以及在靶脱瘤(on-target,off-tumor)毒性。
6.程序性细胞死亡1(pd-1)受体(cd279)是一种抑制性免疫受体，其作为免疫检查点发挥重要作用，尤其是在t细胞共抑制和耗竭中。pd-1与其同源配体pd-l1之间的相互作用是许多肿瘤用于免疫抑制和逃避的主要过程之一。pd-1在活化的淋巴细胞上表达，并且已显示，在与肿瘤细胞上表达的pd-l1结合后，负调节抗原受体信号传导，从而导致免疫细胞效应功能受损，例如细胞增殖、细胞因子分泌和肿瘤细胞裂解减少。使用pd-l1检测抗体和
免疫组织化学染色，已发现肿瘤细胞中的高pd-l1表达与各种人类癌症的总体存活率方面的不良预后相关。因此，pd-l1表达已被引入临床实践，作为选择pd-1/pd-l1抗体治疗反应者的生物标志物。使用单克隆抗体(mab)调节pd-1/pd-l1相互作用，是一种称为“免疫检查点阻断”的方法，该方法已在黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和其他肿瘤患者中产生了良好的临床反应并提高了总体生存率。然而，pd-1mab治疗可能导致免疫相关不良事件(irae)，这可能是严重的甚至是致命的。pd-1mab治疗最严重的不良事件是肺炎，在一项早期研究中导致3人死亡。
7.本发明解决了上述在嵌合抗原受体(car)修饰的t淋巴细胞治疗癌症，特别是实体瘤领域中的一些缺点。


技术实现要素：

8.在一方面，本发明公开了一种t细胞，所述t细胞经基因修饰以表达：i)重组嵌合抗原受体(car)，其包含(a)包含抗原结合区的细胞外结构域，(b)跨膜结构域，和(c)细胞内信号传导结构域，其中重组car不包含共刺激信号传导结构域，并且其中重组car的细胞外结构域包含nkg2d受体的细胞外结构域；和ii)重组嵌合共刺激受体(ccr)，其包含(a)包含抗原结合区的细胞外结构域，(b)跨膜结构域，(c)共刺激信号传导结构域，其中重组ccr不包含细胞内信号传导结构域，并且其中重组ccr的细胞外结构域包含pd-l1特异性单链可变片段(scfv)。
9.在另一方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含药学有效量的本发明的t细胞，和药学上可接受的赋形剂。
10.在另一方面，本发明公开了一种制备本发明的t细胞的方法，所述方法包括：a)获得或提供t细胞；b)提供i)编码重组car的重组核酸；和ii)编码ccr的重组核酸；和c)将编码重组car的重组核酸和编码ccr的重组核酸转移到t细胞中。
11.在又一方面，本发明公开了一种在有需要的受试者中治疗癌症或肿瘤的方法，其包括向受试者施用药学有效量的本发明的t细胞或药物组合物。
12.在进一步的方面，本发明公开了一种在有需要的受试者中治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括：a)从受试者或与待治疗的受试者不同的供体获得t细胞；b)提供i)编码重组嵌合抗原受体(car)的重组核酸，其中重组car包含(a)包含抗原结合区的细胞外结构域，(b)跨膜结构域，和(c)细胞内信号传导结构域，其中重组car不包含共刺激信号传导结构域，并且其中重组car的细胞外结构域包含nkg2d受体的细胞外结构域；和ii)编码重组嵌合共刺激受体(ccr)的重组核酸，其中重组ccr包含(a)包含抗原结合区的细胞外结构域，(b)跨膜结构域，和(c)共刺激信号传导结构域，其中重组ccr不包含细胞内信号传导结构域，并且其中重组ccr的细胞外结构域包含pd-1l1特异性单链可变片段(scfv)；c)将编码重组car的重组核酸和编码重组ccr的重组核酸转移到t细胞中，以获得基因修饰的t细胞；和d)向受试者施用药学有效量的从c)获得的t细胞。
附图说明
13.当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，其中：
14.图1显示了本技术中描述的嵌合受体的示意图。图1a显示了第一代nkg2d car是通
过将nkg2d受体的细胞外结构域与激活结构域融合而产生的。激活结构域源自cd3ζ或dap12。图1b显示了αpd-l1 ccr是通过将pd-l1特异性scfv与单个共刺激信号传导结构域融合而产生的。图1c显示了pd-1嵌合转换受体(csr)是通过将pd-1抑制性受体的细胞外结构域与单个共刺激信号传导结构域融合而产生的。在图1b和1c中，共刺激信号传导结构域源自4-1bb或cd28。图1d显示了本技术中描述的两种基于nkg2d car的组合是通过将第一代nkg2d car与αpd-l1 ccr(car-t1)或pd-1 csr(car-t2)配对而产生的。car，嵌合抗原受体；ccr，嵌合共刺激受体；csr，嵌合转换受体。
15.图2显示了细胞毒性测定的条形图结果，表明car-t1和car-t2修饰的t细胞对一组癌细胞系表现出剂量依赖性细胞毒性。hepg2(nkg2dl )、caov3(nkg2dl ,pd-l1 )和detroit-562(nkg2dl ,pd-l1 ,pd-l2 )癌细胞在标准的2-小时delfia时间分辨细胞毒性测定中作为靶细胞。car-t1和car-t2修饰的t细胞以不同的e:t比率20:1和10:1与靶细胞接种。car-t1和car-t2均表现出对靶细胞的细胞毒性呈剂量依赖性增加。car-t1和car-t2对所有三种细胞系的细胞毒性均未观察到显著差异(ns，p》0.05)。e:t，效应物与靶标。显示的数据是一式三份的平均值
±
sd，代表三个独立实验。通过双因素方差分析进行统计分析，然后进行tukey的多重比较。
16.图3.nkg2d car-t细胞的抗原依赖性扩增被αpd-l1 ccr进一步增强。car-t1和car-t2细胞用表达nkg2d配体和pd-1配体的k562髓系白血病细胞进行扩增。每10天使用一批新鲜的经γ照射的k562饲养细胞，e:t比率为2:1。显示的数据是来自一个供体的dna电穿孔后第17、27和37天从利用盼蓝排除测定法中获得的细胞数，代表三个独立实验。
17.图4.αpd-l1 ccr的纳入增强了ccr7-/cd45ra-效应记忆t细胞的发育。通过检测ccr7和cd45ra抗原，对car-t1和car-t2组的记忆t发育进行了表征。(a)ccr7-cd45ra 效应t细胞在扩增阶段中期和末期在car-t1和car-t2中的比例。(b)ccr7-cd45ra-效应记忆细胞在扩增阶段中期和末期在car-t1和car-t2中的比例。显示的数据是一个供体的单次测量，代表三个独立实验。
18.图5.αpd-l1 ccr的纳入减轻了t细胞耗竭标志物的表达。(a)来自三个供体的单个终点测量：在图3中描述的扩增阶段末期，在car-t1和car-t2细胞上评估pd-1、tigit、tim3和lag3的表达水平。(b)根据car实验组分类的每种耗竭标志物的表达水平的汇总平均值。
19.图6.car-t细胞治疗消除了小鼠异种移植模型中已建立的肿瘤。四组小鼠(每组5只小鼠)接受2
×
106个hct116-luc人结直肠癌细胞的腹腔注射(第0天)，然后在第7天和第32天腹腔注射pbs、对照car-t细胞、用nkg2d car pd-1 csr修饰的t细胞或用nkg2d car αpd-l1 ccr修饰的t细胞(每只小鼠每次注射1
×
107个car-t细胞)。在指定的日期通过生物发光成像监测hct116的生长。显示了生物发光图像。
20.图7.car-t细胞治疗显著延长了接种有人类癌细胞的小鼠的存活。在图6中描述的小鼠异种移植模型中，在肿瘤接种后长达150天监测动物存活率，并通过kaplan-meier方法进行分析。
21.图8显示了用于修饰如本公开中描述的t细胞的构建体的设计概念的示意图。
22.定义
[0023]“基因修饰的细胞”是指通过添加或修饰基因、dna或rna分子、或蛋白质或多肽而被修饰、转化或操纵的任何生物体的任何细胞。
[0024]“t细胞”是一种在胸腺中发育并在免疫反应中起核心作用的淋巴细胞。通过细胞表面上t细胞受体的存在，可以将t细胞与其他淋巴细胞区分开来。这些免疫细胞起源于来自骨髓的前体细胞，一旦它们迁移到胸腺中，就会发育成几种不同类型的t细胞。t细胞最初根据其功能被分类为一系列亚群，但也已根据相关基因或蛋白质表达模式被分类为亚群。t细胞受体(tcr)是一种发现于t细胞表面的分子，负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合体(mhc)分子结合的肽。tcr由两条不同的蛋白质链组成(即，它是异二聚体)。在人类中，在大多数t细胞中，tcr由α链和β链(分别由tra和trb编码)组成，因此被称为αβt细胞。在一小部分t细胞中，tcr由γ和δ链(分别由trg和trd编码)组成，因此被称为γδt细胞。对于不同类别的t细胞，分化和增殖的能力按以下顺序增加：效应t细胞、效应记忆t细胞、中央记忆t细胞、干细胞记忆t细胞。相反，它们的效应功能，例如细胞介导的细胞毒性和细胞因子释放，以相同的顺序降低。car-t细胞的临床疗效与在体内增殖和持续存在的能力直接相关。因此，更高的记忆顺序允许car-t细胞在患者体内持续存在更长时间，从而发挥更持久的抗肿瘤活性。
[0025]
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或缩写形式“car”是指人工受体蛋白或嵌合免疫受体，并且包括将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程化受体。car可用于将单克隆抗体的特异性提供给t细胞，从而可以产生大量的特异性t细胞，例如用于过继细胞疗法。car通常包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和包含抗原结合区的细胞外结构域。car可以将基于抗体的对所需抗原的特异性与激活t细胞受体的细胞内结构域相结合，以产生具有特定细胞免疫活性(例如抗肿瘤细胞免疫活性)的嵌合蛋白。在一些情况下，分子可以与car共表达，包括共刺激分子、用于成像的报告基因、在添加前药后有条件地清除nk细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
[0026]
如本文所用，术语“嵌合共刺激受体”或缩写形式“ccr”是指人工受体蛋白或嵌合免疫受体，其有助于特定免疫效应细胞例如t细胞的完全活化。例如，t细胞需要两个信号才能被完全激活，第一个是由t细胞受体(tcr)提供的抗原特异性信号，第二个是通过共刺激分子和共刺激受体之间的相互作用提供的抗原非特异性共刺激信号。ccr通常包含含有抗原结合区的细胞外结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域，但不包含细胞内激活结构域。因此，单独使用ccr不会导致免疫效应细胞的完全激活和产生。ccr通常必须与另一种包含细胞内激活结构域的重组受体(例如car)一起使用，从而完全激活免疫效应细胞。
[0027]
如本文所用，术语“抗原”是能够被抗体或细胞表面受体结合的分子。抗原通常可用于诱导体液免疫反应和/或导致产生淋巴细胞的细胞免疫反应。
[0028]
自然杀伤组2成员d，也称为klrk1(nkg2d)，是一种c型凝集素样受体，它首先在nk细胞中被鉴定为激活免疫受体。nkg2d是ii型跨膜糖蛋白，在细胞内结构域中不包含任何已知的信号传导元件。类似于许多激活受体，nkg2d依赖于衔接分子来启动信号转导和细胞激活。在人类中，nkg2d不仅由所有nk细胞表达，而且还由所有cd8
t细胞和γδ
t细胞亚群表达为共刺激受体。nkg2d的表达和信号传导可以受细胞因子和肿瘤衍生因子的调节。细胞因子如il-2、il-7、il-12、il-15和i型干扰素(ifn)会增加nkg2d的细胞表面表达。已显示细胞因子如il-21、ifn-γ和tgf-β可降低nkg2d表达。据报道，il-21可降低人cd8
t细胞和nk细胞中nkg2d的表达。在小鼠中，nk细胞的il-21刺激依赖于调节乳腺癌小鼠模型中nkg2d的表达。
[0029]
程序性死亡配体1(pd-l1)，也称为分化簇274(cd274)或b7同源物1(b7-h1)，是人类中由cd274基因编码的蛋白质。pd-l1是一种40kda的1型跨膜蛋白，其可作为pd-1的配体。pd-l1与其受体pd-1在t细胞上的结合递送了抑制tcr介导的il-2产生和t细胞增殖的激活的信号。通过基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)，基于与磷酸酶(shp-1或shp-2)的相互作用，pd-l1与抑制性检查点分子pd-1的结合传递了抑制信号。这减少了淋巴结中抗原特异性t细胞的增殖，同时减少了调节性t细胞(抗炎、抑制性t细胞)的凋亡——进一步由基因bcl-2的较低调节介导。pd-l1的上调可能使癌症逃避宿主免疫系统。
[0030]
人类中的程序性细胞死亡蛋白1，也称为pd-1和cd279(分化簇279)，由pdcd1基因编码。pd-1是一种细胞表面受体，其属于免疫球蛋白超家族，在t细胞和前b细胞上表达。pd-1结合两个配体，pd-l1和pd-l2。pd-1通过下调免疫系统来调节免疫系统对人体细胞的反应，并通过抑制t细胞炎症活动来促进自身耐受。pd-1是一种免疫检查点，通过两种机制预防自身免疫。首先，它促进淋巴结中抗原特异性t细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，它减少了调节性t细胞(抗炎、抑制性t细胞)的凋亡。pd-1的细胞外结构域的示例性序列是(从n末端到c末端)：pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlv(seq id no:1)，由以下示例性核苷酸序列编码：ccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtg(seq id no:2)。
[0031]
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scfv”是指免疫球蛋白的重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)的融合蛋白，用10到约25个氨基酸的短接头肽相连。接头通常富含甘氨酸以提高灵活性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度，并且可以将vh的n末端与v
l
的c末端连接起来，反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，该蛋白质仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。
[0032]
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离dna、任何序列的分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后进行对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后被进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则多核苷酸包括双链形式和已知或预计构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
[0033]
如本文所用，术语“重组核酸”是指通过基因重组(例如分子克隆)的实验室方法将来自多种来源的遗传物质聚集在一起而形成的核酸。用于构建重组核酸分子的核酸序列可
以来源于任何物种。例如，人类核酸可以与细菌核酸结合。此外，自然界中不存在的核酸序列可以通过核酸的化学合成产生，并被掺入重组分子中。可以由活细胞内重组核酸表达产生的蛋白质被称为重组蛋白质。当将编码蛋白质的重组核酸引入宿主生物体时，不一定会产生重组蛋白质。外源蛋白的表达需要使用专门的表达载体，并且通常需要通过外源编码序列进行重大重组。
[0034]
如本文所用，术语“载体”是指非染色体核酸，其包含完整复制子，使得当被置于(例如通过转化过程)允许的细胞内时，载体可以被复制。载体可以在一种细胞类型(例如细菌)中复制，但在另一种细胞(例如哺乳动物细胞)中复制的能力有限。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸dna；与阳离子脂质复合的dna，单独或与阳离子聚合物结合；阴离子和阳离子脂质体；dna-蛋白质复合物和包含与阳离子聚合物(如异质多聚赖氨酸、定长寡肽和聚乙烯亚胺)缩合的dna的颗粒，在一些情况下包含在脂质体中；以及使用包含病毒和多聚赖氨酸-dna的三元复合物。
[0035]
如本文所用，术语“转移”或“转染”是指将外源核酸引入至宿主细胞中的一般过程，所述过程可以是机械转染(包括电穿孔)、化学转染或病毒转导。“经转染的”细胞是已经使用任何上述方法用外源核酸转染的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
[0036]
如本文所用，术语“自体”意指来源于同一个体的任何材料，随后将其重新引入该个体。
[0037]
如本文所用，术语“同种异体”是指来源于与其随后将被引入的个体不同的个体的任何材料。
[0038]
如本文所用，“百分比同一性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列同一性。百分比同一性可以通过比较每个序列中的位置来确定，序列可以为了比较的目的而被比对(align)。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同一的。
[0039]
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指具有通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以包括蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括具有通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长链(在本领域中通常被称为蛋白质)两者，每种都有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0040]
如本文所用，短语“同源”或“变体”核苷酸序列、或“同源”或“变体”氨基酸序列是指特征在于在核苷酸水平或氨基酸水平上至少具有指定百分比的同一性的序列。同源核苷酸序列包括编码天然存在的等位基因变体和本文所述的核苷酸序列的突变的那些序列。同源核苷酸序列包括编码除人类之外的哺乳动物物种的蛋白质的核苷酸序列。同源氨基酸序列包括含有保守氨基酸取代并且多肽具有相同结合和/或活性的那些氨基酸序列。在一些实例中，同源核苷酸或氨基酸序列与比较序列具有至少60％或更多(例如至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％或至少99％)的同一性。在一些实例中，同源核苷酸或氨基酸序列与比较序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实例中，同源氨基酸序列具有不超过
15个、或不超过10个、或不超过5个或不超过3个保守氨基酸取代。百分比同一性可以通过例如gap程序(wisconsin序列分析软件包，unix版本8，genetics computer group,university research park,madison wis.)使用默认设置来确定，该程序使用smith和waterman的算法。在一些实例中，根据本公开的用于修饰t细胞的重组核酸分子与本文公开的示例性核苷酸序列(例如在seq id no:24、26、28和30中的任意中提供的序列)同源。在一些其他实例中，在修饰的t细胞中表达的嵌合抗原受体(car)和/或嵌合共刺激受体(ccr)与本文公开的示例性氨基酸序列(例如在seq id no:23、25、27和29中的任意中提供的序列)同源。
[0041]
术语“表达”是指在细胞中产生基因产物。
[0042]
当提及表达时，术语“瞬时”意指多核苷酸未被掺入细胞基因组中。相反，当提及表达时，术语“稳定”意指多核苷酸被掺入细胞基因组中。瞬时表达可以由被引入的构建体发生，该构建体包含在宿主细胞中起作用的表达信号，但是该构建体不复制并且很少整合到宿主细胞中，或者宿主细胞没有增殖。瞬时表达也可以通过诱导与目标基因可操作地连接的可调控启动子的活性来完成，尽管这样的可诱导系统经常表现出低的基础表达水平。可以通过引入可以整合到宿主基因组中或在宿主细胞中自主复制的核酸构建体来实现稳定表达。可以通过使用位于表达构建体上或与表达构建体一起转染的可选择标记，然后通过选择表达该标记的细胞来选择目标基因的稳定表达。当稳定表达由整合产生时，构建体的整合可以在宿主基因组内随机发生，或者可以通过使用这样的构建体来靶向：该构建体包含与宿主基因组同源的区域，足以靶向与宿主基因座的重组。当构建体靶向内源基因座时，所有或一些转录和翻译调控区可以由内源基因座提供。为了在宿主细胞中实现表达，转化的核酸与在宿主细胞中起作用的转录和翻译起始和终止调控区可操作地结合。
[0043]
如本文所用，术语“肿瘤”是指由组织异常生长引起的身体的一部分的肿块，通常没有炎症。肿瘤可以是良性的或恶性的(即癌性的)。良性肿瘤不会浸润附近的组织或扩散到身体的其他部位。常见类型的良性肿瘤包括腺瘤、纤维瘤、血管瘤、脂肪瘤、脑膜瘤、肌瘤、神经瘤和骨软骨瘤。腺瘤是始于腺体或腺体样结构的上皮组织的良性肿瘤。常见类型的腺瘤是结肠息肉。腺瘤也可能生长在肝脏或肾上腺、垂体或甲状腺中。纤维瘤是可以生长在任何器官中的纤维组织或结缔组织的肿瘤。血管瘤是皮肤或内脏器官中血管细胞的积聚。脂肪瘤由脂肪细胞生长而来。它们是成人中最常见的良性肿瘤，常见于颈部、肩部、背部或手臂。脑膜瘤是由围绕大脑和脊髓的膜发展而来的肿瘤。肌瘤是由肌肉生长而来的肿瘤。神经瘤是由神经发展而来的肿瘤。骨软骨瘤是由骨骼发展而来的肿瘤。
[0044]
如本文所用，术语“癌症”是指由于丧失正常控制而不受控制的细胞增殖，导致生长失控、缺乏分化、局部组织浸润，通常还有转移。有几种主要类型的癌症。癌是始于皮肤或排列或覆盖内脏器官的组织的癌症。肉瘤是始于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症。白血病是始于骨髓等造血组织的癌症，导致大量异常血细胞产生并进入血液。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是始于免疫系统细胞的癌症。中枢神经系统癌症是始于大脑和脊髓的组织的癌症。
具体实施方式
[0045]
本技术的发明人发现，在对t细胞进行基因修饰以表达包含nkg2d受体的细胞外结
构域的重组car和特异性靶向pd-ll的重组ccr后，该基因修饰的t细胞通过对表达pd-l1和nkg2d配体两者的癌细胞表现出特异性来促进更精确的癌症靶向，从而最大限度地降低与car-t细胞治疗相关的在靶脱瘤风险。发明人还发现，这种基因修饰的t细胞可以逃避肿瘤微环境(tme)内的主要免疫抑制机制。
[0046]
因此，在一个实例中，本发明涉及一种t细胞，所述t细胞经基因修饰以表达：i)重组嵌合抗原受体(car)，其包含(a)包含抗原结合区的细胞外结构域，(b)跨膜结构域，和(c)细胞内信号传导结构域，其中重组car不包含共刺激信号传导结构域，并且其中重组car的细胞外结构域包含nkg2d受体的细胞外结构域；和ii)重组嵌合共刺激受体(ccr)，其包含(a)包含抗原结合区的细胞外结构域，(b)跨膜结构域，(c)共刺激信号传导结构域，其中重组ccr不包含细胞内信号传导结构域，并且其中重组ccr的细胞外结构域包含pd-l1特异性单链可变片段(scfv)。
[0047]
在一些实例中，重组car的细胞外结构域是nkg2d受体的细胞外结构域。在一个实例中，nkg2d受体的细胞外结构域具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)：fnqevqipltesycgpcpknwicyknncyqffdesknwyesqascmsqnasllkvyskedqdllklvksyhwmglvhiptngswqwedgsilspnlltiiemqkgdcalyassfkgyiencstpntyicmqrtvas(seq id no:3)，由以下示例性核苷酸序列编码：ttcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacgtacatctgtatgcaaaggactgtggctagc(seq id no:4)。nkg2d配体是mhc i类分子的结构同源物。nkg2d配体在正常组织中不存在或很少表达，但在各种恶性肿瘤和病毒感染组织中广泛表达。人类nkg2d配体的实例包括i类链相关分子a和b(mica和micb)蛋白和视黄酸早期转录物-1(raet1)，也称为ul-16结合蛋白。小鼠nkg2d配体的实例包括五种不同的raet1亚型(raet1α、raet1β、raet1γ、raet1δ和raet1ε)、三种不同的h60亚型(h60a、b和c)和ul16结合蛋白1(由mult1基因编码)。尽管nkg2d配体是mhc i类分子的结构同源物，但它们不会将抗原呈递给t细胞或结合β2-微球蛋白。在一些实例中，嵌合抗原受体的细胞外结构域所结合的nkg2d配体是膜结合配体。
[0048]
在一些实例中，重组ccr的细胞外结构域是pd-l1特异性scfv，称为αpd-l1 scfv。在一个具体实例中，pd-l1 scfv具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdygfswvrqapgqglewmgwitayngntnyaqklqgrvtmttdtststvymelrslrsddtavyycardyfygmdvwgqgttvtvssggggsggggsggggseivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylvwyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwprtfgqgtkveikas(seq id no:5)，由以下示例性核苷酸序列编码：caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaccgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagtctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagactacttctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcggaaattgtgttgacacagt
ctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagtctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaagctagc(seq id no:6)。在一个具体实例中，pd-l1 scfv的重链可变结构域具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdygfswvrqapgqglewmgwitayngntnyaqklqgrvtmttdtststvymelrslrsddtavyycardyfygmdvwgqgttvtvss(seq id no:7)，由以下示例性核苷酸编码序列：caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaccgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagtctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagactacttctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca(seq id no:8)。在一个具体实例中，pd-l1 scfv的轻链可变结构域具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)：eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylvwyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwprtfgqgtkveik(seq id no:9)，由以下示例性核苷酸编码序列：gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagtctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa(seq id no:10)。pd-l1 scfv的重链可变结构域和轻链可变结构域可以通过接头肽连接。在一个具体实例中，pd-l1 scfv的重链可变结构域和轻链可变结构域通过具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)的(g4s)3接头肽连接：ggggsggggsggggs(seq id no:11)，由以下示例性核苷酸序列编码：ggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcg(seqid no:12)。
[0049]
重组嵌合抗原受体(car)和/或重组嵌合共刺激受体(ccr)的细胞外结构域也可以包含铰链区。铰链区是位于例如抗原结合区和跨膜结构域之间的序列。铰链区的序列可以从例如来自任何种属(包括人类或其部分)的任何合适的序列获得。在一些实例中，铰链区包括人类蛋白质的铰链区，所述人类蛋白质包括cd3、cd-8α、cd28、4-1bb、ox-40、t细胞受体α或β链、cd3ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd8a、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、其功能衍生物及其组合。在一些具体实例中，铰链区是cd3、cd8或cd28的铰链区。在一些实例中，重组car的铰链区和重组ccr的铰链区是相同的。在一些其他实例中，重组car的铰链区和重组ccr的铰链区是不同的。在一些实例中，铰链区可以是选自但不限于免疫球蛋白(例如igg1、igg2、igg3、igg4和igd)中的一种。
[0050]
应当理解，抗原结合区可以在其序列内包括一些可变性并且对于本文公开的靶标仍然具有选择性。因此，预期抗原结合区的多肽可以与本文公开的抗原结合区多肽序列具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％的同一性，并且对于本文公开的靶标仍然具有选择性，并在本公开的范围内。
[0051]
重组car和/或重组ccr的跨膜结构域包括跨越细胞膜的疏水性多肽。特别地，跨膜结构域从细胞膜的一侧(细胞外)跨越到细胞膜的另一侧(细胞内或细胞质)。
[0052]
在一些实例中，人工设计跨膜结构域，使得该结构域的多于25％、多于50％或多于75％的氨基酸残基是疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。
[0053]
跨膜结构域可以是α螺旋或β桶或其组合的形式。跨膜结构域可以包括具有许多跨膜区段、每个α-螺旋、β折叠或其组合的多型(polytopic)蛋白。
[0054]
在一个实例中，使用与car或ccr中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在另一个实例中，对跨膜结构域进行选择或通过氨基酸取代来修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
[0055]
例如，跨膜结构域包括t细胞受体α或β链、cd3ζ链、cd3ε、cd8、cd45、cd4、cd5、cd7、cd9、cd16、cd22、cd28、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd68、cd134、cd137、icos、cd41、cd154、其功能衍生物及其组合的跨膜结构域。在一些实例中，重组car的跨膜结构域和重组ccr的跨膜结构域是相同的。在一些其他实例中，重组car的跨膜结构域和重组ccr的跨膜结构域是不同的。在一个具体实例中，重组car的跨膜结构域是cd28跨膜结构域。在一个具体实例中，重组car的跨膜结构域具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)：eskygppcppcpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seq id no:13)，由以下示例性核苷酸序列编码：gaatctaaatatggccccccttgcccaccatgtcccttctgggttttggtagttgtcggcggggtgcttgcttgctattcattgttggttacggtggcttttataattttctgggta(seq id no:14)。在一个具体实例中，重组ccr的跨膜结构域是cd8跨膜结构域。在一个具体实例中，重组ccr的跨膜结构域具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)：fvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrn(seq id no:15)，由以下示例性核苷酸序列编码：ttcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaac(seq id no:16)。
[0056]
重组car的细胞内信号传导结构域负责激活已放置了重组car的免疫细胞的正常效应功能中的至少一种。术语“效应功能”是指分化细胞如t细胞的特化功能。细胞内信号传导结构域通常包括至少一个包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的结构域。每个itam具有两个重复的共有序列tyr-x-x-leu/ile(x是任何氨基酸)，间隔6到8个氨基酸。itam中的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后被磷酸化，并为参与细胞信号传导通路的其他蛋白质形成对接位点。在一些实例中，重组car的细胞内信号传导结构域包含仅一个itam，或不超过一个itam。在一些实例中，与表达在细胞内信号传导结构域中包含多于一个itam的重组car的t细胞相比，经基因修饰以表达在细胞内信号传导域中包含仅一个itam的重组car的t细胞释放较低水平的细胞因子。在一些实例中，car中的细胞内信号传导结构域包括部分或全部cd3ζ，或dap分子如dap 12，或其组合。在一个具体实例中，使用的细胞内信号传导结构域是cd3ζ。在一个具体实例中，使用的细胞内信号传导结构域是dap12。在一个具体实例中，car的细胞内信号传导结构域具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)：yflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrpyyk(seq id no:17)，通过以下示例性核苷酸序列编码：tacttcctgggacgacttgttcctcgggggcggggtgctgcagaagctgcaacgcgaaaacaaagaattaccgagactgagagtccgtatcaagaactgcagggccaaagaagcgacgtttactccgatctcaat
acccaacggccttactacaaa(seq id no:18)。
[0057]
在一些实例中，本文公开的重组car不包含共刺激信号传导结构域，例如ox40；cd27；cd28；cd30；cd40；pd-1；cd2；cd7；cd258；自然杀伤组2成员c(nkg2c)；自然杀伤组2成员d(nkg2d)，b7-h3；结合cd83、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos和4-1bb(cd137)中的至少一种的配体；cds；icam-1；lfa-1(cd1a/cd18)；cd40；cd27；cd7；b7-h3；nkg2c；pd-1；icos；其活性片段；其功能衍生物；及其组合。
[0058]
在一些实例中，在重组car和/或重组ccr的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或在重组car的细胞内信号传导结构域和跨膜结构域之间，掺入了间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指起到将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或细胞内结构域的功能的任何寡肽或多肽。间隔结构域可以包含多达约300个氨基酸，或约10至约100个氨基酸，或约25至约50个氨基酸。
[0059]
在一个具体实例中，基因修饰的t细胞中所需的重组car包含nkg2d受体、cd28跨膜结构域和dap12细胞内信号传导结构域。在一个具体实例中，基因修饰的t细胞中所需的重组ccr包含αpd-l1 scfv、cd8跨膜结构域和4-1bb共刺激信号传导结构域。
[0060]
术语“cd3ζ”、“cd3zeta”、“cd3z”在本文中可互换使用以指代相同的t细胞表面糖蛋白cd3ζ链。
[0061]
重组ccr的共刺激信号传导结构域可以增强t细胞的增殖、存活和/或发育。共刺激信号传导结构域的实例包括但不限于：4-1bb、cd27、cd28、ox-40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、其功能衍生物及其组合。在一个具体实例中，共刺激信号传导结构域是4-1bb。4-1bb，也称为cd137，是肿瘤坏死因子(tnf)受体家族的成员。在一个具体实例中，ccr的共刺激传导信号传导结构域具有以下氨基酸序列(从n末端到c末端)：rfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq idno:19)，由以下示例性核苷酸序列编码：cgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaagctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg(seq id no:20)。在另一个具体实例中，共刺激信号传导结构域是cd28。
[0062]
在一些实例中，为了产生重组car和/或重组ccr，将信号肽添加到重组car/ccr构建体的5’端。在一个具体实例中，信号肽是gm-csf信号肽，具有以下序列(从n末端到c末端)：mlllvtslllcelphpafllipgaha(seq idno:21)，由以下示例性核苷酸序列编码：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggcgcgcatgcc(seq id no:22)。
[0063]
在一个实例中，无信号肽的重组car具有以下序列(从n末端到c末端)：fnqevqipltesycgpcpknwicyknncyqffdesknwyesqascmsqnasllkvyskedqdllklvksyhwmglvhiptngswqwedgsilspnlltiiemqkgdcalyassfkgyiencstpntyicmqrtvasnwshpqfekggggsggggsnwshpqfekggggsggggsnwshpqfekggggsggggseskygppcppcpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvyflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrpyyk(seq id no:23)，由以下示例性核苷酸序列编码：ttcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattg
gatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacgtacatctgtatgcaaaggactgtggctagcaactggtcacacccccagtttgagaaaggtgggggagggtcaggtggtggggggtcaaattggtctcatccccagttcgagaagggcggaggaggttcaggtgggggtgggagcaactggagccaccctcaatttgaaaaaggaggtggagggagtggaggtggtggatctgaatctaaatatggccccccttgcccaccatgtcccttctgggttttggtagttgtcggcggggtgcttgcttgctattcattgttggttacggtggcttttataattttctgggtatacttcctgggacgacttgttcctcgggggcggggtgctgcagaagctgcaacgcgaaaacaaagaattaccgagactgagagtccgtatcaagaactgcagggccaaagaagcgacgtttactccgatctcaatacccaacggccttactacaaa(seq id no:24)。在一个实例中，具有信号肽的重组car具有以下序列(从n末端到c末端)：mlllvtslllcelphpafllipgahafnqevqipltesycgpcpknwicyknncyqffdesknwyesqascmsqnasllkvyskedqdllklvksyhwmglvhiptngswqwedgsilspnlltiiemqkgdcalyassfkgyiencstpntyicmqrtvasnwshpqfekggggsggggsnwshpqfekggggsggggsnwshpqfekggggsggggseskygppcppcpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvyflgrlvprgrgaaeaatrkqritetespyqelqgqrsdvysdlntqrpyyk(seq id no:25)，由以下示例性核苷酸序列编码：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggcgcgcatgccttcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacgtacatctgtatgcaaaggactgtggctagcaactggtcacacccccagtttgagaaaggtgggggagggtcaggtggtggggggtcaaattggtctcatccccagttcgagaagggcggaggaggttcaggtgggggtgggagcaactggagccaccctcaatttgaaaaaggaggtggagggagtggaggtggtggatctgaatctaaatatggccccccttgcccaccatgtcccttctgggttttggtagttgtcggcggggtgcttgcttgctattcattgttggttacggtggcttttataattttctgggtatacttcctgggacgacttgttcctcgggggcggggtgctgcagaagctgcaacgcgaaaacaaagaattaccgagactgagagtccgtatcaagaactgcagggccaaagaagcgacgtttactccgatctcaatacccaacggccttactacaaa(seq id no:26)。
[0064]
在一个实例中，无信号肽的重组ccr具有以下序列(从n末端到c末端)：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdygfswvrqapgqglewmgwitayngntnyaqklqgrvtmttdtststvymelrslrsddtavyycardyfygmdvwgqgttvtvssggggsggggsggggseivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylvwyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwprtfgqgtkveikasfvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no:27)，由以下示例性核苷酸序列编码：caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaccgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagtctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagactacttctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcggaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctt
tgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagtctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaagctagcttcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaaccgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaagctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg(seq id no:28)。在一个实例中，具有信号肽的重组ccr具有以下序列(从n末端到c末端)：mlllvtslllcelphpafllipgahaqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdygfswvrqapgqglewmgwitayngntnyaqklqgrvtmttdtststvymelrslrsddtavyycardyfygmdvwgqgttvtvssggggsggggsggggseivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylvwyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsnwprtfgqgtkveikasfvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no:29)，由以下示例性核苷酸序列编码：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaggcgcgcatgcccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaccgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagtctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagactacttctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcggtggcgggtcggaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagtctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaagctagcttcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaaccgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaagctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg(seq id no:30)。
[0065]
在一些实例中，为了测量重组car的表面表达水平，将肽标签添加到重组car构建体中。在一个实例中，肽标签被添加在细胞外结构域和跨膜结构域之间。在一个具体实例中，肽标签为st2标签，具有序列(从n末端到c末端)：nwshpqfekggggsggggsnwshpqfekggggsggggsnwshpqfekggggsggggs(seq id no:31)，由以下示例性核苷酸序列编码：aactggtcacacccccagtttgagaaaggtgggggagggtcaggtggtggggggtcaaattggtctcatccccagttcgagaagggcggaggaggttcaggtgggggtgggagcaactggagccaccctcaatttgaaaaaggaggtggagggagtggaggtggtggatct(seq id no:32)。
[0066]
重组car和/或重组ccr在基因修饰的t细胞中的表达可以是瞬时的或稳定的。在一些实例中，图1a和1b中的每一个中的构建体在基因修饰的t细胞中瞬时或稳定地表达。
[0067]
在一些实例中，本文公开的基因修饰的t细胞靶向表达nkg2d配体和pd-ll两者的癌症或肿瘤细胞。nkg2d配体与重组car的细胞外结构域的结合激活了基因修饰的t细胞，然后这些t细胞继续增殖、合成和分泌细胞因子。肿瘤细胞上表达的pd-l1与重组ccr的细胞外结构域的结合激活了重组ccr的共刺激信号传导结构域，从而增强t细胞的增殖、存活和/或发育，并促进细胞因子的合成和分泌。在与靶肿瘤细胞表达的pd-l1和nkg2d配体两者结合后，基因修饰的t细胞被完全激活并发挥功能。
[0068]
本文所述的基因修饰的t细胞可以作为组合物或药物组合物提供。因此，在一个实例中，提供了一种药物组合物，其包含药学有效量的如本文公开的t细胞和药学上可接受的赋形剂。本文所述的组合物可以以多种方式施用，这取决于是否需要局部或全身治疗。施用可以是局部的、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器；气管内的、鼻内的、表皮的和经皮的)或全身性的(例如口服)和/或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹腔或肌内注射或输注；或颅内(例如鞘内或心室内)施用。在一些实例中，施用途径可以选自由全身性施用、口服施用、静脉内施用和肠胃外施用组成的组。
[0069]
本文所述的组合物或药物组合物可以以单位剂型提供，其中每个剂量单位(例如注射剂)含有预定量的单独或与其他活性剂适当组合的如本文公开的t细胞。本文所用的术语“单位剂型”是指适于作为用于人和动物受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有预定量的单独或与其他活性剂组合的如本文公开的t细胞，以足以产生所需效果的量计算，适当时与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂结合。单位剂型的规格取决于与特定受试者中的药物组合物相关的特定药效学。可以根据制药工业中熟知的常规技术来制备单位剂型。这种技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体或半液体载体均匀且紧密地结合来制备制剂。
[0070]
本文所述的组合物可以另外包含通常在药物组合物中发现的其他辅助组分。因此，例如，组合物可以包含另外的、相容的药学活性物质，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包含用于物理配制本发明组合物的各种剂型的另外的物质，例如缓冲剂、染料、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂或其组合，它们适合与可以以适用于滴眼液的任何浓度添加到溶液中的药理活性剂一起使用。然而，这些物质在添加时不应过度干扰本公开组合物的组分的生物活性。制剂可以灭菌，如果需要，可以与助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等，其不会与制剂的t细胞有害地相互作用。
[0071]
在另一个实例中，提供了一种制备如本文公开的经基因修饰以表达重组car和重组ccr的t细胞的方法，所述方法包括：a)获得或提供t细胞；b)提供i)编码重组car的重组核酸；和ii)编码ccr的重组核酸；和c)将编码重组car的重组核酸和编码ccr的重组核酸转移到t细胞中。在一些实例中，所述方法进一步包括，在步骤a)之后，培养t细胞以扩大t细胞的数量。可以使用本领域已知的t细胞扩增方法。在一些实例中，将编码重组car的重组核酸和编码重组ccr的重组核酸同时转移到t细胞中。在一些实例中，将编码重组car的重组核酸和编码重组ccr的重组核酸同时转移到t细胞中，将编码重组car和重组ccr的重组核酸克隆到同一载体中。在一些其他实例中，将编码重组car的重组核酸和编码重组ccr的重组核酸相
继转移到t细胞中。
[0072]
可以使用本领域已知的方法产生编码重组car和/或重组ccr的重组核酸。对于每个结构域的氨基酸序列，可以从ncbi refseq id或genbenk的登录号获得编码氨基酸序列的碱基序列，并且可以使用标准分子生物学和/或化学程序来制备如本文公开的核酸。例如，基于碱基序列，可以合成多核苷酸，并且可以通过使用聚合酶链式反应(pcr)组合从cdna文库获得的dna片段来制备本公开的多核苷酸。编码car和/或ccr的开放阅读框的序列可以从基因组dna来源、cdna来源获得，或者可以被合成(例如通过pcr)，或其组合。根据基因组dna的大小和内含子的数量，可能需要使用cdna或其组合，因为据发现内含子可以稳定mrna。此外，使用内源性或外源性非编码区来稳定mrna可能更有利。
[0073]
可以将编码重组car和/或重组ccr的核苷酸序列插入适当的表达载体中，即，包含插入的蛋白质编码序列的转录和翻译的所必需的元件的载体。多种宿主-载体系统可用于表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于被病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统，被病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统，微生物如含有酵母载体的酵母，或用噬菌体、dna、质粒dna或粘粒dna转化的细菌，转基因植物或转基因非人类动物。载体的表达元件的强度和特异性各不相同。根据所使用的宿主-载体系统，可以使用多种合适的转录和翻译元件中的任何一种。
[0074]
任何用于将dna片段插入载体的已知方法可用于构建含有嵌合核苷酸序列的表达载体，所述嵌合核苷酸序列由适当的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列组成。示例性方法包括体外重组dna和合成技术。编码重组car和/或重组ccr的重组核酸序列的表达可以由第二核酸序列调节，使得重组car和/或重组ccr在用重组dna分子转化的宿主中表达。例如，重组car和/或重组ccr的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子元件控制。
[0075]
在一些实例中，重组表达载体的基本骨架是可商购的载体，其中插入了上述元件中的每一个。示例性表达载体包括但不限于pfastbac1、palter-ex1、palter-ex2、pcal-n、pcal-n-ek、pcal-c、pcal-kc、pcdna2.1、pdual、pet-3a-c、pet-9a-d、pet-11a-d、pet-12a-c、pet-14b、pet-15b、pet-16b、pet-17b、pet-19b、pet-20b( )、pet-21a-d( )、pet-22b( )、pet-23a-d( )、pet-24a-d( )、pet-25b( )、pet-26b( )、pet-27b( )、pet-28a-c( )、pet-29a-c( )、pet-30a-c( )、pet-31b( )、pet-32a-c( )、pet-33b( )、pet-34b( )、pet-35b( )、pet-36b( )、pet-37b( )、pet-38b( )、pet-39b( )、pet-40b( )、pet-41a-c( )、pet-42a-c( )、pet-43a-c( )、petblue-1、petblue-2、petblue-3、pgemex-1、pgemex-2、prset、ptriex-1、和ptriex-2表达载体。
[0076]
本领域通常已知的方法可用于从上述重组表达载体转录mrna。例如，可以使用重组表达载体作为dna模板进行pcr，以产生线性dna模板。然后可以使用产生的线性dna模板的体外转录来产生重组car和/或重组ccr mrna。任选地，在进行体外转录之前纯化线性dna模板。
[0077]
可以使用本领域公知的分子克隆技术将编码重组car和/或重组ccr的核酸克隆到表达载体中。
[0078]
可以使用本领域已知的任何技术，例如电穿孔、非病毒化学转染和病毒转导，将包含编码重组car和/或重组ccr的重组核酸的表达载体转移到t细胞中。在一个特定实例中，t细胞被基因修饰以通过电穿孔表达重组car和重组ccr。
[0079]
与经基因修饰以表达重组nkg2d car和重组pd-1嵌合转换受体(csr)的t细胞相比，本发明的基因修饰的t细胞提供改善的t细胞增殖、降低的t细胞耗竭标志物的表达和增强的体内肿瘤杀伤，如实验部分提供的数据所证明的那样。在一些实例中，经基因修饰以表达重组car和重组ccr的t细胞能够在体内复制，从而导致可导致持续的肿瘤控制的长期持续性。
[0080]
在一些实例中，医学疾病或病症可以通过施用如本文公开的t细胞群来治疗。在一些实例中，医学疾病或病症是癌症或肿瘤。在另一个实例中，提供了一种治疗有需要的受试者的癌症或肿瘤的方法，包括向受试者施用药学有效量的如本文公开的t细胞或如本文公开的药物组合物。在另一个实例中，提供了药学有效量的如本文公开的t细胞在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。在又一个实例中，提供了如本文公开的t细胞或药物组合物，用于治疗癌症或肿瘤。在一些实例中，用于治疗癌症或肿瘤的所述基因修饰的t细胞是在治疗过程中制备的。因此，在一个实例中，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括：a)从受试者或从与待治疗的受试者不同的供体获得t细胞；b)提供i)编码重组嵌合抗原受体(car)的重组核酸，其中重组car包含(a)包含抗原结合区的细胞外结构域，(b)跨膜结构域，和(c)细胞内信号传导结构域，其中重组car不包含共刺激信号传导结构域，并且其中重组car的细胞外结构域包含nkg2d受体的细胞外结构域；和ii)编码重组嵌合共刺激受体(ccr)的重组核酸，其中重组ccr包含(a)包含抗原结合区的细胞外结构域，(b)跨膜结构域，和(c)共刺激信号传导结构域，其中重组ccr不包含细胞内信号传导结构域，并且其中重组ccr的细胞外结构域包含pd-l1特异性单链可变片段(scfv)；c)将编码重组car的重组核酸和编码重组ccr的重组核酸转移到t细胞中，以获得基因修饰的t细胞；和d)向受试者施用药学有效量的从c)获得的t细胞。在一些其他实例中，所述方法进一步包括，在步骤a)之后，培养t细胞以扩大t细胞的数量。t细胞扩增方法是本领域已知的并且在本技术的实验部分中举例说明。
[0081]
如本文所用，术语“药学有效量”在其含义内包括足以提供所需的治疗效果，但无毒量的本文所述的t细胞。理想地，本文所述的有效量或足够量的t细胞存在于组合物中并被引入受试者，从而建立长期的、特异性的抗肿瘤反应，与在没有这种治疗的条件下否则会导致的情况相比，减小肿瘤的大小或消除肿瘤的生长或再生。理想地，引入受试者的一定量的t细胞导致与不存在t细胞的其他相同条件相比，肿瘤大小减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％。所需的t细胞的确切数量因受试者而异，取决于以下因素，例如接受治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、接受治疗的病况的严重程度(例如肿瘤的阶段和/或大小)、施用方式等。一般而言，t细胞的浓度理想地应足以在接受治疗的受试者中提供至少约1
×
106至约1
×
109个t细胞，甚至更理想地，约1
×
107至约5
×
108个t细胞，尽管可以使用例如5
×
108个细胞以上或例如1
×
107个细胞以下的任何合适的量。给药方案可以基于成熟的基于细胞的疗法，或者可以采用替代的连续输注策略。这些值提供了从业者在优化本文公开的治疗方法时要使用的t细胞范围的一般指导。本文列举的这些范围决不排除使用更高或更低量的组分，这可能在特定应用中得到保证。例如，实际剂量和计划可以根据组合物是否与其他药物组合物联合施用，或根据药代动力学、药物处置和代谢的个体间差异而变化。在任何给定情况下，合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
[0082]
本治疗方法适用的癌症或肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中发现的那些。在一些具体实例中，恶性肿瘤是实体瘤。示例性实体瘤可以包括但不限于选自由胰腺、结肠、盲肠、胃、大脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳房组成的组的器官的肿瘤。在一些具体实例中，恶性肿瘤是血液肿瘤。示例性血液肿瘤包括骨髓肿瘤、t细胞或b细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的进一步的实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、胃癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑色素瘤。癌症可能具体属于以下组织学类型，尽管不限于这些：赘生物，恶性的；癌；癌，未分化；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性的；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺的；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性的；卵巢间质瘤，恶性的；卵泡膜细胞瘤(thecoma)，恶性的；粒层细胞瘤，恶性的；男性细胞瘤(androblastoma)，恶性的；sertoli细胞癌；leydig细胞瘤，恶性的；脂质细胞瘤，恶性的；副神经节瘤，恶性的；乳腺外副神经节瘤，恶性的；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无色素型黑色素瘤；浅表扩散黑色素瘤；雀斑样恶性黑色素瘤；肢端雀斑样黑色素瘤；结节性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性的；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性的；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性的；brenner瘤，恶性的；叶状肿瘤，恶性的；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性的；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性的；卵巢甲状腺肿(struma ovarii)，恶性的；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性的；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性的；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性的；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性的；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性的；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性的；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性的；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性的；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性的；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性的；颗粒细胞瘤，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金的；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样真菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；b细胞淋巴瘤；低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级免疫母细胞型nhl；高级淋巴母细胞型nhl；高级小非裂解细胞型nhl；大块疾病nhl(bulky disease nhl)；套细胞淋巴瘤；艾滋
病相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(cll)；急性淋巴细胞白血病(all)；急性髓性白血病(aml)；和慢性粒细胞白血病。在一些实例中，可以使用本文提供的基因修饰的t细胞治疗的癌症/肿瘤包括结直肠癌、卵巢癌、头颈癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和神经胶质瘤。在一个具体实例中，可以治疗的癌症/肿瘤是结直肠癌。
[0083]
在一些实例中，癌症/肿瘤表达nkg2d配体和pd-ll两者。在一些其他实例中，在用另一种药物、辐射或生物药剂治疗后，癌症/肿瘤表达nkg2d配体和pd-l1。
[0084]
术语“治疗”及其语法变形是指治疗性治疗和预防性或防御性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理病况、病症或疾病或获得有益的或期望的临床结果。这种有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解；病况、病症或疾病的减轻程度；病况、病症或疾病的稳定状态(即不恶化)；病况、病症或疾病进展的延迟或减缓；病况、病症或疾病状态的改善、缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的；或病况、病症或疾病的改进或改善。治疗包括引发具有临床意义的细胞反应，而不会产生过高水平的副作用。治疗还包括与未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。
[0085]
术语“降低”、“减少的”、“减少”、“降低”、“去除”或“抑制”在本文中均一般用于表示统计学显著量的降低。然而，为避免疑问，“减少的”、“减少”或“降低”、“去除”或“抑制”表示与参考水平相比降低至少10％，例如降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或多达并包括100％的降低(例如，与参考样品相比不存在水平)，或与参考水平相比在10-100％之间的任何降低(例如，在不存在本文所述的治疗的情况下)。
[0086]
在一些实例中，待治疗的受试者或患者是动物、哺乳动物、人，包括但不限于分类为牛、猪、马、犬、狼、猫、鼠、绵羊、鸟、鱼、山羊、乌鸦、acrine或delphine的动物。在一个实例中，患者是人。
[0087]
可用于治疗医学疾病或病症的t细胞来源可以是任何种类的，但在具体实例中，细胞从脐带血库、外周血库、人胚胎干细胞库或诱导多能干细胞库获得。
[0088]
在一些实例中，可用于治疗医学疾病或病症的t细胞是自体的，即从待施用治疗的同一个体获得。例如，可以从需要治疗的患者收集t细胞的自体来源，并使用本文所述和本领域已知的方法激活和修饰t细胞，然后将t细胞回输到患者中。t细胞的一些自体来源包括pbmc、患者出生时获得并随后保存的脐带血以及来源于从患者获得的细胞的诱导多能干细胞。
[0089]
在一些其他实例中，可用于治疗医学疾病或病症的t细胞是同种异体的，即来源于与患者相同物种的不同个体，例如t细胞供体。在一些其他实例中，可用于治疗医学疾病或病症的t细胞是异种的，即来源于与患者不同物种的动物。来源于同种异体异种来源的基因修饰的t细胞可以提供现成的产品。
[0090]
同种异体或自体t细胞诱导快速免疫反应，但由于其有限的寿命而相对迅速地从循环中消失。因此，使用本文公开的治疗方法减少了对持续副作用的担忧。
[0091]
在某些实例中，本文所述的t细胞与第二治疗剂联合施用。例如，第二治疗剂可以
包括免疫调节剂、单克隆抗体或化疗剂。在非限制性实例中，免疫调节剂是来那度胺(lenolidomide)，单克隆抗体是阿仑单抗(alemtuzumab)、利妥昔单抗(rituxumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、adotranstuzumab、blinatunomab、达雷木单抗(daratumumab)或艾洛珠单抗(elotuzumab)，化疗剂是氟达拉滨或环磷酰胺。
[0092]
在施用本文公开的用于治疗或预防癌症/肿瘤的基因修饰的t细胞之后，可以以技术人员熟知的各种方式评估治疗的功效。例如，本领域普通技术人员将理解，通过观察到治疗性的基因修饰细胞降低了癌细胞负荷或防止癌细胞负荷的进一步增加，与化学佐剂一起递送的治疗性的基因修饰细胞在治疗或抑制患者的癌症方面是有效的。癌细胞负荷可以通过本领域已知的方法测量，例如，使用聚合酶链式反应测定来检测某些癌细胞核酸的存在，或使用例如抗体测定来检测来自受试者或患者的样品(例如但不限于血液)中标志物的存在以鉴定血液中的某些癌细胞标志物，或通过测量患者中循环癌细胞抗体水平的水平。
[0093]
可以在不存在本文未具体公开的任何元素、限制的情况下适当地实施在本文中示例性描述的本发明。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地理解而不受限制。此外，本文使用的术语和表述已被用作描述性术语而不是限制性术语，并且在使用这些术语和表述时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等同物，但应当认识到，在要求保护的本发明的范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可能会采用在本文中公开的所包含的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化是被认为是在本发明的范围内。
[0094]
如在本技术中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一个/一种遗传标记”包括多个遗传标记，包括其混合物和组合。
[0095]
如本文所用，在制剂组分的浓度的背景中，术语“约/大约”典型地表示所述值的 /-5％，更典型地为所述值的 /-4％，更典型地为所述值的 /-3％，更典型地为所述值的 /-2％，甚至更典型地为所述值的 /-1％，甚至更典型地为所述值的 /-0.5％。
[0096]
在整个本公开中，某些实施方案可以以范围格式公开。应当理解，以范围格式进行的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对所公开范围的保护范围的硬性限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围如从1到6的描述应该被认为已经具体公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
[0097]
也可以在本文中对某些实施方案进行广泛地和一般性地描述。落入一般性公开内容的每个较窄的种类和亚属组(sub-generic grouping)也构成本公开的一部分。这包括对实施方案的一般性描述，其中附带条件或负面限制从属中去除任意主题，无论本文是否具体列举了删减的物质。
[0098]
已经在本文中对本发明进行了广泛地和一般性地描述。落入一般性公开内容的每个较窄的种类和亚属组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，其中附带条件或负面限制从该属中去除任意主题，无论本文是否具体列举了删减的物质。
[0099]
其他实施方案在以下权利要求和非限制性实施例内。此外，在根据马库什组对本
发明的特征或方面进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明因此也根据马库什组的任何个体成员或成员亚组进行描述。
[0100]
实验部分
[0101]
方法和材料
[0102]
细胞系和培养条件
[0103]
将经工程化以表达cd64、cd86和cd137l的人k562髓系白血病饲养细胞维持在imdm中。将hepg2和detroit-562维持在dmem中。将caov3维持在rpmi中。所有类型的培养基均补充有10％fbs(gibco)。
[0104]
car-t细胞制备
[0105]
在irb的批准下，从卫生科学局(health sciences authority，hsa，新加坡)获得健康供者的血沉棕黄层，并利用密度梯度离心分离其pbmc。将pbmc以5
×
106个细胞/ml接种在t细胞培养基(aim-v 5％ab血清)中，并用1μg/ml的可溶性okt3(ebioscience)或transact(miltenyi biotec，德国)激活2-3天，每1
×
107个pbmc加入100μl transact。在培养开始时加入重组il-2(300iu/ml；peprotech)，并每隔一天补充一次。
[0106]
在第2天或第3天，收集活化的t细胞并用非病毒电穿孔法进行转导。在补充有5％ab血清或1％人血浆和300iu/ml il-2的aim-v中继续培养修饰的t细胞5天。在第8天，对基因修饰的t细胞进行计数并在补充有300iu/ml il-2的aim-v培养基中以1:2的比率与经γ照射的k562或k562#6细胞共培养。每10天以1:2的比率添加新的经γ照射的k562细胞来重新刺激car t细胞。对于未修饰的t细胞的增殖，将t细胞与经γ照射的k562#6以1:50的比率共培养，在共培养开始时补充60ng/ml okt3。在培养开始时加入300iu/ml il-2，并每隔一天补充一次。
[0107]
根据制造商的方案(miltenyi biotec，德国)，从第17天的car-t细胞培养物中去除cd56 细胞。简而言之，将多达1
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107个细胞悬浮在80μl automacs运行缓冲液中，并与20μl cd56微珠在4℃下避光孵育15分钟。将细胞以300g离心10分钟并重悬于500μl automacs运行缓冲液中。将ls柱置于macs multistand中，并通过用1ml automacs运行缓冲液冲洗两次来平衡ls柱。将细胞悬浮液加入ls柱中以捕获标记的cd56 细胞。cd56-流穿部分收集在15ml锥形离心管(bd biosciences，美国)的柱底部。
[0108]
流式细胞术
[0109]
对于t细胞的表型分析，使用以下标记的抗人抗体：cd3(克隆：okt3；ebioscience)、cd45ro(克隆：uchl1；bd biosciences)、ccr7(克隆：3d12；ebioscience)、pd-1(克隆：mih4；bd pharmingen)、tigit(克隆：mbsa43；ebioscience)、tim3(克隆：f38-2e2；ebioscience)和lag3(克隆：3ds223h；ebioscience)。使用适当的同型对照来验证圈门。在电穿孔后第5天和与经γ照射的k562#6共培养一周后的第12天，使用the
tm nwshpqfek标签抗体(genescript)测定t细胞上nkg2d car(其包括strep标签)的表达。进行流式细胞术分析并使用bd accuri
tm c6(bd biosciences)分析。
[0110]
体外细胞毒性测定
[0111]
使用delfia eutda cytotoxicity reagents试剂盒(perkinelmer)检测了经car修饰的t细胞的细胞裂解活性。使用的效应物与靶标(e:t)的比率范围为20:1至1:1。设置对照组以测量自发释放(仅添加靶细胞)、最大释放(添加有10μl裂解缓冲液的靶细胞)和培养
基背景(不添加细胞)。使用以下公式计算杀伤效力：
[0112]
％特定释放＝(实验释放(计数)-自发释放(计数))/(最大释放(计数)-自发释放(计数))
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100
[0113]
体内实验
[0114]
动物实验是根据新加坡的科学、技术和研究机构(a*star)的生物资源中心(brc)的实验动物管理与使用委员会(iacuc)审查和批准的方案进行的(许可号brc iacuc#181324)。在当前研究中维持并使用了非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷/il-2rγcnull(nsg)小鼠(8-10周龄，雄性，美国杰克逊实验室)。使用xenogen活体成像软件v3.2采集和分析所有发光信号和图像。
[0115]
为了建立小鼠结直肠癌(crc)异种移植模型，小鼠在第0天被腹腔注射2
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106个hct116-luc人结直肠癌细胞。在肿瘤接种后第7天，通过使用具有living image软件(perkinelmer)的ivis spectrum imaging平台监测的活体生物发光成像(bli)确认了肿瘤植入。具有相似bli信号强度的小鼠被随机分为4个不同的治疗组，每组5只小鼠。在第7天，通过腹腔注射100μl pbs或100μl含有1
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107个三个以下不同组的t细胞的细胞悬浮液来治疗小鼠：(1)对照t细胞，(2)nkg2d car pd-1 csr双car修饰的t细胞，或(3)nkg2d car αpd-l1 ccr双car修饰的t细胞。在肿瘤接种后第32天以相同剂量(1
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107个t细胞/小鼠)进行第二次注射。通过bli每周监测肿瘤进展。对小鼠进行密切监测，在观察到以腹水引起的明显腹胀、可触及的体温过低、无法行走和/或对操作缺乏明显反应为特征的濒死状态的发展后，对小鼠进行人道地安乐死。
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统计学
[0117]
对于体外和体内实验，使用非配对学生t检验来评估2组的连续变量，并且使用后测bonferroni的单因素方差分析来评估超过2组的连续变量。通过kaplan-meier方法和对数秩(mantel-cox)检验来分析存活，以比较成对的组。使用graphpad prism 7.0(graphpad软件)计算统计学。当p值小于0.05时，差异被认为是显著的。
[0118]
结果
[0119]
为了提高肿瘤反应性t细胞的体内持久性，已在几项研究中调查和验证了基于pd-1的csr的使用，使其与肿瘤反应性tcr或car组合。然而，pd-1自然识别pd-l1和pd-l2两者，其中pd-l2的表达模式主要限于髓系细胞，而pd-l1更常见于在各种肿瘤上上调。因此，需要进一步提高这种方法的肿瘤特异性。在本发明中，通过将nkg2d受体的细胞外结构域与源自dap12的激活结构域融合构建了第一代car(图1a)。为了特异性靶向pd-l1，产生了一个仅识别pd-l1但不识别pd-l2的αpd-l1 ccr(图1b)。同时，还产生了用于比较研究的基于pd-1的csr(图1 c)。在这两种构建体中，抗原靶向部分与源自4-1bb的单个共刺激结构域串联表达。以下，将nkg2d car与αpd-l1 ccr的组合称为car-t1，将nkg2d car与pd-1 csr的组合称为car-t2。
[0120]
为了评估car-t1和car-t2细胞的功能，将磁珠激活的t细胞与编码piggybac转座酶、nkg2d car和αpd-l1 ccr或pd-1 csr的质粒共电穿孔。为了扩增和富集表达nkg2d car的t细胞，将这些t细胞与人k562髓系白血病细胞系以1:2的效应物与靶标(e:t)比率共培养。然后将扩增的car-t1和car-t2细胞用作效应细胞，在2-小时细胞毒性测定中评估它们对带有nkg2d和pd-1配体的癌细胞的细胞毒性。使用了pd-1配体表达水平不同的三种不同
癌细胞系：hepg2仅表达nkg2dl，但不表达任何一种pd-1配体；caov3表达ngk2dl和pd-l1；detroit-562表达nkg2dl和两种pd-1配体。如图2所示，car-t1和car-t2细胞对这三种靶细胞系中的每一种产生的细胞毒性没有可观察到的统计学差异。
[0121]
为了评估大规模生产的潜力，在单独的il-2存在下，每10天用一批新鲜的γ照射的k562饲养细胞连续扩增car-t1和car-t2细胞。在30天的周期内计算了细胞数量的增加，并观察到这些car-t细胞的强劲扩增(图3)。虽然在植入αpd-l1 ccr或pd-1 csr的nkg2d car-t细胞之间没有可观察到的细胞毒性差异，但与car-t2相比，在与k562饲养细胞培养共培养时，car-t1的总细胞产量有所提高(图3)。这种改善趋势在所有三种受试供体中都是一致的。
[0122]
接下来，评估了αpd-l1 ccr的掺入可以如何进一步改善记忆t细胞亚群的发育。使用ccr7和cd45ra作为对各种记忆亚群进行分类的标志物，评估了这两种标志物在扩增阶段中期和末期在car-t1和car-t2细胞上的共表达。如图4所示，记忆t细胞的发育在两个car-t组中有所不同。比较扩增中期和扩增末期的t细胞组成，car-t2中效应t细胞的比例从33.2％略微上升至34.5％，而在car-t1中，这一比例从26.6％下降至15.2％。相反，效应记忆t细胞的百分比在car-t2中从66.2％下降至64.9％，但在car-t1中从73.3％增加至84.6％。虽然没有可检测到的中央记忆t细胞或干细胞记忆t细胞水平，但图4显示了αpd-l1 ccr和pd-1 csr之间效应记忆t发育的明显差异。
[0123]
慢性抗原活化通常导致典型t细胞耗竭标志物的表达升高。为了研究αpd-l1 ccr如何减轻t细胞耗竭标志物的表达并可能逆转t细胞在免疫抑制环境中的命运，在扩增阶段末期测量pd-1、tigit、lag3和tim3在car-t1和car-t2细胞上的表达。与图3和4中看到的结果一致，与car-t2细胞相比，car-t1细胞表现出这些耗竭标志物的表达水平降低(图5)。实验设置没有区分内源性抑制性pd-1受体和外源性pd-1 csr，因此，car-t2上更高水平的pd-1可能并不表示pd-1抑制升高。然而，在所有三种受试供体中，tigit、tim3和lag3的表达水平在car-t2细胞上始终较高。来自单个供体的单终点测量(图5a)和汇总平均值(图5b)共同表明，与pd-1 csr相比，αpd-l1 ccr的掺入在更大程度上缓解了t细胞耗竭。
[0124]
进一步研究了car-t1(nkg2d car αpd-l1 ccr)和car-t2(nkg2d car pd-1 csr)之间的体内肿瘤杀伤效果是否存在差异。我们通过腹腔(i.p.)注射人hct116-luc crc细胞在nsg小鼠中建立了小鼠结直肠模型。通过全身生物发光成像监测肿瘤进展(图6)。在第7天，当所有小鼠均已在腹腔内建立肿瘤时，将动物随机分为4组进行治疗：第1组进行两次pbs腹腔注射；第2组进行两次腹腔注射，每次注射107个对照car-t细胞；第3组和第4组接受两次腹腔注射，分别注射107个car-t1细胞和car-t2细胞。如图6所示，4组小鼠在治疗前在第7天表现出相似的肿瘤负荷，这由相似的生物发光强度证明。已建立的肿瘤在经pbs和对照car-t细胞处理的小鼠中继续生长，所有小鼠在第28天死亡。通过双重car-t治疗，已建立的肿瘤完全消除，它们的生物发光信号在第14天变得无法检测到。通过治疗，疾病的显著降低维持了》8周，到第62天，10只接受治疗的小鼠中有4只出现肿瘤再生，car-t2组有3只，car-t1组有1只。到第150天，虽然car-t2组有3只小鼠死亡，2只存活，但car-t1组的所有小鼠仍然存活良好：其中4只没有肿瘤，1只小鼠表现出稳定的疾病。kaplan-meier曲线和对数秩检验结果如图7所示，说明两组生存曲线之间存在显著差异。总体而言，这项动物实验表明，虽然car-t1和car-t2都能够在体内有效根除已建立的实体瘤，但通过将pd-1 csr替换
为αpd-l1 ccr用于双car构建，进一步显著增强了肿瘤杀伤功效。
[0125]
结论
[0126]
由于它们的特殊生物学特性，例如克隆异质性和对t细胞不利的抑制性肿瘤微环境(tme)，对于大多数癌症患者来说，根除大实体瘤仍然具有挑战性。
[0127]
pd-1识别pd-l1和pd-l2两者。pd-l1在肿瘤细胞上过表达，在大范围的非造血细胞上以低水平表达。与pd-l1相比，pd-l2的表达模式更受限制，其表达主要限于抗原呈递细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、b1b细胞和肥大细胞。因此，在两种pd-1配体中，pd-l1被认为是癌症免疫逃避的主要介质，而pd-l2似乎不是肿瘤部位t细胞抑制的主要介质，尽管pd-l2可能在某些情况下发挥作用。另一个区别是它们对pd-1的亲和力：pd-l2对pd-1的亲和力比pd-l1高2到6倍，并且与pd-1和pd-l1之间的相互作用相比，pd-l2显示出不同的结合/解离动力学。pd-l2和pd-l1的这些不同的结合特性可能是这两种pd-1配体对免疫反应的不同贡献的原因。
[0128]
先前的研究已经利用了基于pd-1受体的csr来保护转导的t细胞免受pd-l1诱导的t细胞抑制，并将抑制信号转变为所需的共刺激信号以实现最佳t细胞功能。当用于双特异性双car构建时，pd-l2对pd-1更高的结合特性可能会引导基于pd-1的双car-t细胞更容易被pd-l2阳性细胞激活。为了提高癌症特异性并减少对抗原呈递细胞的副作用和与pd-1阻断相关的不良事件，应使用pd-l1特异性csr，不幸的是，这通过使用pd-1受体的细胞外结构难以构建。为了避免该问题，本发明利用对pd-l1特异的scfv片段来产生嵌合共刺激受体(ccr)。当与第一代nkg2d car一起使用时，已经证明使用这种基于抗pd-l1 ccr的双特异性双car可改善t细胞增殖，降低t细胞耗竭标志物的表达，最重要的是，增强体内肿瘤杀伤。
[0129]
随着基于car-t细胞疗法的临床试验继续与在靶脱瘤效应、免疫逃避和免疫抑制进行斗争，需要新的策略来补充正在进行的临床工作。作为结束语，这里开发的双特异性双car在靶向pd-l1和nkg2d配体阳性癌症类型的不同治疗方案中提供了可以想象的有吸引力的机会。当一种肿瘤类型出现pd-l1的选择性过表达时，使用目前公开的双car可使t细胞克服免疫抑制性tme，同时激活t细胞对表达nkg2g配体的癌细胞的细胞毒性。重要的是，这种双特异性双car在理论上是安全的，不会对患者构成任何可能的威胁，从而为更顺畅的转化应用铺平了道路。