一种生物转化米格列醇中间体的方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种生物转化米格列醇中间体的制备方法。


背景技术：

2.糖尿病是最为常见的一种内分泌代谢失调引起的疾病，主要分为i型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病，idd)和ii型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病，nidd)。随着人民生活水平的提高和营养结构的改善，糖尿病作为慢性非传染性疾病正在呈流行趋势。其中，又以ii型糖尿病为主。
3.1966年，在链霉菌的发酵液中首次发现了野尻霉素(nojirimycin)，四年后发现它对β-糖苷酶具有强烈的抑制作用，成为第一个被发现的淀粉酶抑制剂。由野尻霉素还原得到的1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)及其一系列的衍生物同样具有糖苷酶抑制作用，n-取代-1-脱氧野尻霉素的降糖作用最为明显，米格列醇就是其中之一。
4.米格列醇(n-羟乙基-1-脱氧野尻霉素)是1-脱氧野尻霉素的母体修饰物，结构与葡萄糖相似。作为第一个假单糖类α-葡萄糖苷酶抑制剂，因其明显的降糖效果、且安全有效、一般耐受性良好，已成为治疗ii型糖尿病的首选药物。
5.现在米格列醇的生产中大都采用化工合成和结合生物催化。先用葡萄糖胺化生成n-羟乙基葡萄糖胺(中间体i)，再生物转化成6-(取代氨基)-6-脱氧-α-l-呋喃山梨糖(中间体ii)，最后氢化生成n-羟乙基-1-脱氧野尻霉素即米格列醇。在生物转化中间体i(n-羟乙基葡萄糖胺)的过程中，生产厂家大都先把中间体i用酸调好ph，再加入菌体，控制温度和溶氧，流加碱液调节ph，反应结束后，收集滤液再氢化，最终得米格列醇。此生物转化过程中，初期反应剧烈，且加碱液量大，中后期趋于平稳，使用酸调中间体i，再加碱液调生物转化过程中ph，造成浪费。


技术实现要素：

6.克服现有技术不足，本发明提供了一种生物转化米格列醇中间体的制备方法，采用流加中间体i的方法进行生物转化，通过流加中间体i和碱液的方式共同控制溶液保持ph＝5.0-5.6，节省了初始调节中间体i用的酸，也大大减少了反应中用的碱液，且流加可控，能随时掌控反映的速度和进程，适合工业生产，绿色环保。
7.本发明的第一个目的在于一种米格列醇中间体的制备方法，将菌体投入生物转化灌，采用流加米格列醇中间体i的方式进行生物转化，得到米格列醇中间体ii。
8.所述的米格列醇中间体i为n-羟乙基葡萄糖胺；米格列醇中间体ii为6-(取代氨基)-6-脱氧-α-l-呋喃山梨糖；所述菌体为氧化葡萄糖酸菌。
9.进一步的，所述在流加米格列醇中间体i时ph控制为5.0-5.6。
10.进一步的，所述在流加米格列醇中间体i时可流加碱液，共同调控ph为5.2-5.4。
11.具体的，生物转化方法是流加中间体i，ph变化与流加速度相关，ph值上升迅速，则适当降低流加速度，ph值下降则适当提高流加速度。
12.其中，所述碱液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钙溶液中的一种或多种。
13.具体的，所述碱液为氢氧化钠溶液，优选为质量分数为10％氢氧化钠溶液。
14.进一步的，所述菌体和米格列醇中间体i的体积比为0.6-1.4:1，优选为0.8-1.2:1。
15.所述生物转化反应中，温度控制27-32℃，通气量0.2-0.4vvm，罐压0.04-0.06mpa，溶氧始终≥30％。
16.具体的，所述生物转化反应中，流加时间为1-4h。
17.所述生物转化终点判断米格列醇中间体ii采用tlc点板取样检测，rf值为0.4-0.5。
18.本发明的第二个目的在于提供所述的方法在生物转化法制备米格列醇中的应用，其包括以下步骤：
19.固体平板培养：菌种涂布于固体培养基上，30℃培养3-5天；
20.摇瓶扩培：平板接种于摇瓶中，30℃、180rpm培养2-3天；
21.种子罐培养：摇瓶接种于种子罐中，30℃培养，转速200rpm，通气量0.5vvm，罐压0.04kg/cm2,，溶氧大于40％，15-25小时即可移种；
22.发酵罐培养：利用压差法将种子液接入到发酵液中，30℃培养，转速80rpm，通气量0.5vvm，罐压0.04kg/cm2,，溶氧≥50％，流加碱液调控ph5.3-5.5,培养25-45小时即可放罐转到陶瓷膜过滤；
23.菌体收集：发酵液用陶瓷膜过滤，收集菌体并洗脱后转入生物转化罐；
24.生物转化：温度30℃，转速150rpm，通气量0.3vvm，罐压0.05mpa，溶氧维持≥30％，流加中间体i，流加碱液调控ph5.2-5.4，8-14小时即可放罐转入陶瓷膜、微膜过滤；
25.中间体ii收集：用陶瓷膜、微膜收集中间体ii，转入氢化工序；
26.氢化：在催化剂作用下，中间体ii与氢气高压下反应生成米格列醇；
27.本发明的方法和现有技术相比有以下优点：
28.本发明采用中间体i和碱液共同流加控制溶液ph的方法，转化过程平缓，调控ph和溶氧更易操控，所获米格列醇的纯度更高，产率更高，减少了酸和碱的使用量，绿色环保，为后续转化液的收集、洗脱节省人力、物力，易于工业化生产。
具体实施方式
29.为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，实施例仅用于解释本发明。本领域技术人员应该理解的是，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。下面结合实施例对本发明进一步描述，但本发明并不为实施例所限制。
30.菌体培养——氧化葡萄糖酸菌
31.1)固体平板培养：固体培养基成分为：葡萄糖0.1％，酵母抽提物0.2％，蛋白胨0.1％磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％，氯化钙0.05％，硫酸镁0.05％，调ph5.5，于121℃灭菌30分钟，菌种涂布于培养基上，30℃培养3-5天；
32.2)摇瓶扩培：平板接种于摇瓶中，摇瓶培养基的成分为：葡萄糖0.1％，酵母抽提物0.2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.05％，调ph5.5，于121℃灭菌30分钟，30
℃、180rpm培养2-3天；
33.3)种子罐培养：摇瓶接种于种子罐中，培养基与摇瓶培养基相同，121℃灭菌30分钟，30℃培养，转速200rpm，通气量0.5vvm，罐压0.04kg/cm2,，溶氧大于40％，15-25小时即可移种；
34.4)发酵罐培养：发酵培养基的组份为酵母抽提物0.1％，d-山梨醇1.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％，调ph5.5,121℃灭菌30分钟，利用压差法将种子液接入到发酵液中，30℃培养，转速80rpm，通气量0.5vvm，罐压0.04kg/cm2,，溶氧大于50％，流加碱液调控ph5.3-5.5，培养25-45小时即可放罐转到过滤；
35.5)菌体收集：发酵液用陶瓷膜过滤，孔径为0.2-0.5微米，收集菌体并洗脱至电导率100以下转入生物转化罐；
36.米格列醇hplc检测
37.米格列醇hplc的分析条件及系统适用性色谱柱如下：
38.lichrospher氨丙基硅烷键合硅胶色谱柱(250lqflm*4.6mm，5μm)；流动相：乙腈—0.01mol/l磷酸二氢铵溶液(三乙胺调ph至7.5)(65:35)；检测波长210nm；流速1.0ml/min；进样量20μl；柱温25℃；检测器：二极管阵列检测器(dad)。理论塔板数按米格列醇峰计算应不低于1000。
39.实施例1
40.收集已经洗脱好的350m3菌液，生物量25％(v/v)加入转化罐，调控温度30℃，初始ph5.5，通气量32
±
3m3/h，压力0.05mpa，初始转速150rpm，开始流加中间体i，转化过程ph控制5.0左右，溶氧50％，流加在1小时完成，在流加过程中，转化反应略微剧烈，溶氧下降略快，流加碱液(氢氧化钠溶液10％)调控ph和溶氧量，8h后tlc点板检测rf值0.46，转化结束，转化液转入下一工序；
41.转化液经陶瓷膜、微膜过滤、洗脱、浓缩，转入氢化釜进行氢化反应，反应完成后，取滤液hplc检测米格列醇浓度19.2g/l，收率94.66％。10％氢氧化钠溶液用量150l，米格列醇中间体i加入量350m3。
42.实施例2
43.收集已经洗脱好的350m3菌液，生物量25％(v/v)加入转化罐，调控温度30℃，初始ph5.5，通气量32
±
3m3/h，压力0.05mpa，初始转速150rpm，开始流加中间体i，转化过程ph控制5.3左右，溶氧40％，流加在2小时完成，在流加过程中，转化反应平缓，溶氧量波动幅度小，流加碱液(氢氧化钠溶液10％)调控ph和溶氧量，10h后tlc点板检测rf值0.45，转化结束，转化液转入下一工序；
44.转化液经陶瓷膜、微膜过滤、洗脱、浓缩，转入氢化釜进行氢化反应，反应完成后，取滤液hplc检测米格列醇浓度20.2g/l，收率98.94％。10％氢氧化钠溶液用量120l，米格列醇中间体i加入量350m3。
45.实施例3
46.收集已经洗脱好的280m3菌液，生物量25％(v/v)加入转化罐，调控温度30℃，初始ph5.5，通气量32
±
3m3/h，压力0.05mpa，初始转速150rpm，开始流加中间体i，转化过程ph控制5.2左右，溶氧30％，流加在3小时完成，在流加过程中，转化反应相对平缓，溶氧逐渐下降，流加碱液(氢氧化钠溶液10％)调控ph和溶氧量，11h后tlc点板检测rf值0.47，转化结
束，转化液转入下一工序；
47.转化液经陶瓷膜、微膜过滤、洗脱、浓缩，转入氢化釜进行氢化反应，反应完成后，取滤液hplc检测米格列醇浓度19.8g/l，收率96.92％。10％氢氧化钠溶液用量116l，米格列醇中间体i加入量350m3。
48.实施例4
49.收集已经洗脱好的350m3菌液，生物量25％(v/v)加入转化罐，调控温度30℃，初始ph5.5，通气量32
±
3m3/h，压力0.05mpa，初始转速150rpm，开始流加中间体i，转化过程ph控制5.4左右，溶氧40％，流加在4小时完成，在流加过程中，转化反应相对平缓，溶氧逐渐下降，流加碱液(氢氧化钠溶液10％)调控ph和溶氧量，12h后tlc点板检测rf值0.47，转化结束，转化液转入下一工序；
50.转化液经陶瓷膜、微膜过滤、洗脱、浓缩，转入氢化釜进行氢化反应，反应完成后，取滤液hplc检测米格列醇浓度19.6g/l，收率95.93％。10％氢氧化钠溶液用量115l，米格列醇中间体i加入量350m3。
51.实施例5
52.收集已经洗脱好的350m3菌液，生物量25％(v/v)加入转化罐，调控温度30℃，初始ph5.5，通气量32
±
3m3/h，压力0.05mpa，初始转速150rpm，开始流加中间体i，转化过程ph控制5.6左右，溶氧50％，流加在1.5小时完成，在流加过程中，转化反应比较平稳，溶氧逐渐下降，流加碱液(氢氧化钠溶液10％)调控ph和溶氧量，9h后tlc点板检测rf值0.46，转化结束，转化液转入下一工序；
53.转化液经陶瓷膜、微膜过滤、洗脱、浓缩，转入氢化釜进行氢化反应，反应完成后，取滤液hplc检测米格列醇浓度19.5g/l，收率95.61％。10％氢氧化钠溶液用量134l，米格列醇中间体i加入量350m3。
54.实施例6
55.收集已经洗脱好的420m3菌液，生物量25％(v/v)加入转化罐，调控温度30℃，初始ph5.5，通气量32
±
3m3/h，压力0.05mpa，初始转速150rpm，开始流加中间体i，转化过程ph控制5.3左右，溶氧30％，流加在2.5小时完成，在流加过程中，转化反应平稳，溶氧量波动幅度小，流加碱液(氢氧化钠溶液10％)调控ph和溶氧量，10h后tlc点板检测rf值0.46，转化结束，转化液转入下一工序；
56.转化液经陶瓷膜、微膜过滤、洗脱、浓缩，转入氢化釜进行氢化反应，反应完成后，取滤液hplc检测米格列醇浓度20.0g/l，收率97.83％。10％氢氧化钠溶液用量118l，米格列醇中间体i加入量350m3。
57.对比实施例1
58.收集已经洗脱好的350m3菌液，生物量25％(v/v)加入转化罐，调控温度30℃，初始ph5.5，通气量32
±
3m3/h，压力0.05mpa，初始转速150rpm，将中间体i用盐酸调ph5.5，直接加入转化釜中，转化过程ph控制5.3左右，溶氧30％，初始转化反应非常剧烈，溶氧急剧下降，碱液(氢氧化钠溶液10％)急速加，1.2小时后逐渐缓慢。共加碱260l，8h后tlc点板检测rf值0.46，转化结束，转化液转入下一工序；
59.转化液经陶瓷膜、微膜过滤、洗脱、浓缩，转入氢化釜进行氢化反应，反应完成后，取滤液hplc检测米格列醇浓度17.8g/l，收率87.71％。10％氢氧化钠溶液用量260l，米格列
醇中间体i加入量350m3。
60.对比实施例2
61.收集已经洗脱好的350m3菌液，生物量25％(v/v)加入转化罐，调控温度30℃，初始ph5.5，通气量32
±
3m3/h，压力0.05mpa，初始转速150rpm，开始流加中间体i，转化过程ph控制5.8左右，溶氧20％，流加在0.5小时完成，在流加过程中，转化反应非常剧烈，溶氧下降极快，流加碱液(氢氧化钠溶液10％)调控，8h后tlc点板检测rf值0.46，转化结束，转化液转入下一工序；
62.转化液经陶瓷膜、微膜过滤、洗脱、浓缩，转入氢化釜进行氢化反应，反应完成后，取滤液hplc检测米格列醇浓度18.1g/l，收率90.02％。10％氢氧化钠溶液用量220l，米格列醇中间体i加入量350m3。