葛根素6

葛根素6
″‑
o-乙酸酯的酶促合成方法
技术领域
1.本发明属于生物催化领域，具体涉及一种以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的方法和一种以乙酰辅酶a为酰基供体酶促合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的方法。


背景技术：

2.葛根素(puerarin)是一种分离自中药葛根的异黄酮类化合物。目前，葛根素注射液已被开发上市，临床上常用于治疗冠心病、心绞痛和突发性耳聋等疾病。此外，葛根素还具有保护神经系统、修复肝损伤等功能，因此也被用于糖尿病及其并发症、阿尔茨海默症、酒精性肝损伤等疾病的联合用药。随着临床应用范围的扩大，葛根素所导致的不良反应逐渐被报道，包括药物致热、变态反应和溶血等。这些不良反应的产生大多与葛根素溶解性差、生物利用度低有关。
3.葛根素结构特殊，其4
′
位和7位酚羟基易形成分子氢键，增强葛根素分子间的作用力，降低了其在油脂体系和水溶性体系中的溶解性，使其难以达到有效浓度，从而降低了临床疗效。为了改善葛根素的溶解性和生物利用度，常对葛根素进行结构修饰以获得相关性质改善的葛根素衍生物。
4.酰基化修饰可协助提高葛根素脂溶性，强化其生物活性与药效。由于葛根素具有多羟基结构，因此基于酶法合成的生物催化因其高选择性成为葛根素单位点酰基化修饰的有力工具。基于以上研究现状，急需开发葛根素单酰化衍生物的酶促合成方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6
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o-乙酸酯的方法。
6.本发明提供的一种以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的方法，以麦芽糖-o-酰基转移酶(maltose-o-acetyltransferase，mat，accession no:act42309.1)为催化剂，催化葛根素和双醋瑞因生成葛根素6
″‑
o-乙酸酯，具体反应式如下：
[0007][0008]
具体的，上述反应过程中，1分子的酰基供体双醋瑞因可提供2分子的乙酰基。
[0009]
所述麦芽糖-o-酰基转移酶mat来源于大肠杆菌bl21(de3)，其氨基酸序列和核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
[0010]
上述酶催化体系中，葛根素与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为1:1；反应温度为20～80℃；反应ph为3～9。
[0011]
作为优选，反应温度为20～60℃；反应ph为4～8。更优选，反应温度为30～60℃；反
应ph为4.5～7。最优选，反应温度为30～50℃；反应ph为4.5～6。
[0012]
在最优选条件下，本发明还提供了以麦芽糖-o-酰基转移酶mat为生物催化剂，以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的转化效率为68.10％。
[0013]
进一步，为提高上述方法的合成效率，本发明还提供了通过定向进化获得的活性显著提高的麦芽糖-o-酰基转移酶突变体mat-e125v，mat-e125m，mat-e125r。以双醋瑞因为酰基供体，其合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的效率分别提升至94.03％，92.81％，92.18％。
[0014]
具体的，麦芽糖-o-酰基转移酶突变体mat-e125v，mat-e125m，mat-e125r得氨基酸序列选自seq id no.3，seq id no.5，seq id no.7，核苷酸序列选自seq id no.4，seq id no.6，seq id no.8。
[0015]
本发明的另一目的在于提供一种以乙酰辅酶a为酰基供体酶促合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的方法。
[0016]
本发明提供的一种以乙酰辅酶a为酰基供体酶促合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的方法。以麦芽糖-o-酰基转移酶mat为催化剂，催化葛根素和乙酰辅酶a生成葛根素6
″‑
o-乙酸酯，具体反应式如下：
[0017][0018]
具体的，所述麦芽糖-o-酰基转移酶来源于大肠杆菌bl21(de3)，其氨基酸序列和核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
[0019]
上述酶催化体系中，葛根素与酰基供体乙酰辅酶a的摩尔比为1:1；反应温度为20～80℃；反应ph为3～7。
[0020]
作为优选，反应温度为20～70℃；反应ph为3～6。更优选，反应温度为30～60℃；反应ph为3～5。最优选，反应温度为30～50℃；反应ph为3.5～5。
[0021]
在最优选条件下，本发明还提供了以麦芽糖-o-酰基转移酶mat为生物催化剂，以乙酰辅酶a为酰基供体酶促合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的转化效率为29.62％。
[0022]
进一步，为提高上述方法的合成效率，本发明还提供了通过定向进化获得的活性显著提高的麦芽糖-o-酰基转移酶突变体mat-e125n，mat-e125t，mat-e125p。以乙酰辅酶a为酰基供体，其合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的效率分别提升至68.53％，57.37％，56.41％。
[0023]
具体的，麦芽糖-o-酰基转移酶突变体mat-e125n，mat-e125t，mat-e125p氨基酸序列选自seq id no.9，seq id no.11，seq id no.13，核苷酸序列选自seq id no.10，seq id no.12，seq id no.14。
[0024]
本发明还提供了一种含有所述核苷酸序列的表达载体，选自pet-28a( )。
[0025]
本发明还提供了一种所述表达载体的宿主细胞。其优选的宿主细胞选自大肠杆菌bl21(de3)。
[0026]
有益技术效果：
[0027]
本发明提供了两种酶促合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的方法，分别以麦芽糖-o-酰基转移酶mat及其突变体为生物催化剂，以双醋瑞因或乙酰辅酶a为酰基供体。这两种方法均可一步制备葛根素6
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o-乙酸酯，避免化学合成中复杂的保护与脱保护过程，具备位点选择性高、易于制备、条件温和、操作简便等优势。尤其是本发明中以双醋瑞因为酰基供体制备葛根素6
″‑
o-乙酸酯的方法，由于1分子的双醋瑞因可提供2分子的乙酰基，因此该方法有望实现高效合成、降低成本的目标，可广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。
附图说明
[0028]
图1：mat重组蛋白sds-page分析考马斯亮蓝染色结果，其中m为蛋白分子量标准；1为bl21(de3)[pet28a-mat]诱导结果；2为bl21(de3)[pet28a( )]的诱导结果，3为纯化后的mat重组蛋白。
[0029]
图2：mat重组酶催化葛根素和乙酰辅酶a合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的检测结果：(a)液相检测结果，其中a为对照组(不加mat纯酶)；b为mat催化的反应组。(b)葛根素及其乙酰化衍生物1a的紫外光谱对比图。
[0030]
图3：mat重组酶催化葛根素和双醋瑞因合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的检测结果：(a)液相检测结果，其中a为对照组(不加mat纯酶)，b为mat催化的反应组。(b)葛根素其乙酰化衍生物1a的紫外光谱对比图，双醋瑞因及其脱乙酰化合物的紫外光谱图。
[0031]
图4：mat重组酶催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的液质分析图。
[0032]
图5：mat重组酶催化合成葛根素6
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o-乙酸酯的1h-nmr谱图。
[0033]
图6：mat重组酶催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的
13
c-nmr谱图。
[0034]
图7：ph对以乙酰辅酶a为酰基供体合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的影响。
[0035]
图8：温度对以乙酰辅酶a为酰基供体合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的影响。
[0036]
图9：ph对以双醋瑞因为酰基供体合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的影响。
[0037]
图10：温度对以双醋瑞因为酰基供体合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的影响。
[0038]
图11：以乙酰辅酶a为酰基供体，mat丙氨酸突变体催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的效率比较。
[0039]
图12：以双醋瑞因为酰基供体，mat丙氨酸突变体催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的效率比较。
[0040]
图13：以乙酰辅酶a为酰基供体，mat 125位饱和突变体催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的效率比较。
[0041]
图14：以双醋瑞因为酰基供体，mat 125位饱和突变体催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的效率比较。
具体实施方式
[0042]
本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
[0043]
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
[0044]
本发明中的bl21(de3)感受态、fast mutageneis system试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。
[0045]
本发明中所使用的葛根素、双醋瑞因购自成都普思生物科技股份有限公司，乙酰辅酶a购自sigma有限公司。
[0046]
本发明的催化反应通过高效液相色谱仪agilent 1200进行监测与分析，色谱柱型号silgreen c18 column,250
×
4.6mm,5μm,beijing,china，检测波长254nm。以乙酰辅酶a为酰基供体合成葛根素6
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o-乙酸酯的hplc分析条件：a相为水；b相为100％的乙腈。以双醋瑞因为酰基供体合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的hplc分析条件为：a相为0.1％的磷酸水溶液；b相为100％的乙腈。
[0047]
实施例1 mat重组蛋白的诱导表达
[0048]
取2μl前期已构建好的质粒pet28a-mat，加入刚刚融化的100μl bl21(de3)感受态中，冰浴30min，在42℃水浴中热激45s，然后立即冰浴2min。转化产物涂布于含有50μg
·
ml-1
卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆于10ml含有50μg
·
ml-1
卡那霉素的lb培养基中37℃，220rpm培养6h，按1:100比例转接入100ml含相同浓度卡那霉素的lb培养基中，当菌液的od
600
大约为0.6时，加入终浓度为0.2mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，在18℃，160rpm的条件下培养18小时。
[0049]
实施例2 mat重组蛋白的sds-page检测
[0050]
取1.5ml诱导后的菌液，离心收集菌体。加入100μl双蒸水重悬菌体沉淀，菌体悬浮液采用超声破碎法破碎，程序设置为超声3s，停3s，总共破碎时间为2min。而后12000rpm，离心2min，取40μl上清，加入10μl的5
×
loading buffer，混合均匀后，沸水浴5min，使蛋白变性完全。取6μl蛋白样品进行sds-page分析，利用考马斯亮蓝法进行蛋白显色。结果显示(图1)，样品组中25kda附近有一较强的蛋白条带，与mat重组蛋白的分子量大小相符。由于重组mat的n末端融合了his标签，故其蛋白大小等于mat蛋白与pet-28a( )载体序列表达的肽段分子量之和。在对照组相应位置则未观察到该条带，表明mat蛋白在大肠杆菌中成功表达。
[0051]
实施例3重组mat蛋白的纯化和定量
[0052]
利用大型高速离心机，在6566rpm、4℃的条件下离心6min，收集菌体。用pbs buffer(ph＝8.0，20mm)对菌体沉淀进行洗涤，按发酵菌液与pbs buffer的体积比为1l：30ml的比例对洗涤后的菌体进行重悬。冰浴条件下超声破碎，参数设置为超声5s，间歇5s，总时间40min。大量菌体则采用高压细胞破碎仪进行破碎，在800bar压力下循环破碎3次；10000rpm、4℃的条件下离心30min。收集破碎液上清，每升菌液破碎后的上清中加入2.5μl的重组的dnase i(rnase-free)(takara公司)，4℃条件下过夜消化以去除核酸。而后在10000rpm，4℃的条件下再次离心30min，所得上清通过ni胶纯化树脂柱亲和层析进行纯化。首先将处理好的蛋白上样液加入已经预平衡的ni胶纯化树脂，使蛋白同胶结合。然后用洗脱缓冲液(ph 8.0，20mm pbs buffer，10-30mm咪唑)冲洗不能结合以及非特异性结合的蛋白。紧接着用洗脱缓冲液(ph 8.0，20mm pbs buffer，60-300mm咪唑)将结合在ni胶上的带有组氨酸标签的重组mat蛋白洗脱下来，收集洗脱组分，收集的流出液即为纯化的mat。取10μl流出液进行sds-page分析，考马斯亮蓝显色(图1)，结果显示在25kda附近出现单一且清晰的条带，说明纯化后蛋白样品纯度较高。
[0053]
使用10kd的超滤管对目的蛋白所在的洗脱液进行浓缩，以去除咪唑、磷酸盐以及水。使用超滤管前应先用去离子水冲洗干净乙醇保存液，而后用pbs buffer(ph＝8.0，20mm)进行平衡，每次超滤加入10ml蛋白洗脱液，6361rpm离心15min。纯化浓缩后的蛋白需
加入终浓度为20％的甘油于-20℃保存备用。通过bradford法对纯化浓缩的mat蛋白进行定量实验确定蛋白浓度，具体过程参考购于北京康为世纪生物科技有限公司super-bradford protein assay kit蛋白定量试剂盒。用与待测蛋白样品一致的稀释液将标准浓度牛血清白蛋白bsa(2000μg
·
ml-1
)用去离子水逐级稀释形成梯度浓度(1500，1000，500，250，125μg
·
ml-1
)，取0μg
·
ml-1
浓度为空白对照；分别取5μl稀释好的bsa标准品以及待测蛋白样品(原液或者稀释液)加入到96孔板中，再加入250μl bradford protein assay peagent，每组平行重复3次，充分混匀，室温放置10min，而后用酶标仪检测595nm波长下的吸光值；以蛋白含量(μg
·
ml-1
)为横坐标，吸光度值(a
595
)为纵坐标，绘制标准曲线，计算待测样品的浓度。根据获得的标准bsa蛋白的浓度方程：计算纯化后的mat蛋白浓度为97.60mg
·
ml-1
。
[0054]
实施例4以乙酰辅酶a为酰基供体催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯
[0055]
以纯化的mat蛋白作为催化剂，建立100μl柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(ph 4.0，10mm)的反应体系，包括终浓度为1mm的葛根素，1mm的乙酰辅酶a和127.61μg纯化的mat重组蛋白，40℃水浴中反应2h，而后用100μl甲醇终止，12000rpm离心2min，上清用0.22μl滤膜过滤，取30μl滤液进行hplc分析。空白对照组中则不添加mat纯酶，其他组分以及反应结束后的处理操作与样品组完全相同。空白对照及mat催化的反应组通过表1所示的hplc洗脱条件进行检测。如图2a所示，a为未添加mat纯酶的空白对照组；b为mat催化的葛根素和乙酰辅酶a反应结果。结果表明与不添加mat纯酶的对照组相比，葛根素(1)在mat纯酶的作用下转化为新化合物(1a)，新化合物1a与葛根素具有相似的紫外光谱(图2b)，表明1a与葛根素具有相似的化学结构，推测是葛根素乙酰化衍生物。
[0056]
表1以乙酰辅酶a为酰基供体催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的hplc检测条件
[0057][0058]
实施例5以双醋瑞因为酰基供体催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯
[0059]
双醋瑞因是本发明研究发现的一种新颖高效的乙酰基供体，此前未见报道。建立100μl柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(ph 5.5，10mm)的反应体系，将葛根素(1mm)、双醋瑞因(1mm)与mat纯酶(127.61μg)在50℃下孵育2h。对照组中则仅添加双醋瑞因和葛根素，以水代替mat纯酶。对照组和实验组在相同条件下进行，反应结束后用100μl甲醇终止，12000rpm离心2min，上清用0.22μl滤膜过滤，取30μl滤液进行hplc分析。通过agilent 1200高效液相对样品进行检测，hplc洗脱条件如表2所示。
[0060]
如图3a所示，在未加mat纯酶的对照反应中，观察到双醋瑞因自发微量地水解，产生4-乙酰大黄酸(2a)，5-乙酰大黄酸(2b)，大黄酸(2c)，这一现象与文献报道一致。而在反应组中则发现双醋瑞因完全转化为大黄酸(2c)，说明在该反应中双醋瑞因脱掉了两个乙酰基，即1分子的双醋瑞因可在反应过程中提供2分子的乙酰基。与空白对照组相比，反应组中同样明显地观察到疑似葛根素乙酰化衍生物的化合物峰(1a)，且该新化合物的生成量显著
高于以乙酰辅酶a为酰基供体的反应组。新化合物1a的紫外吸收光谱与底物葛根素相似，说明其与葛根素的结构相似。
[0061]
表2以双醋瑞因为酰基供体催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的hplc检测条件
[0062][0063]
实施例6葛根素6
″‑
o-乙酸酯的结构鉴定
[0064]
1、液质分析
[0065]
esi-ms显示疑似葛根素乙酰化衍生物1a的准分子离子峰m/z 459.13260[m h]

，分子式为c
23h23o10
(图4)，与葛根素单乙酰化衍生物的分子量及结构式相符。
[0066]
2、核磁分析
[0067]
在此基础上，对疑似葛根素乙酰化衍生物1a进行了制备，通过核磁共振波谱(图5和图6)进一步确认该葛根素衍生物的乙酰化位点。
[0068]
以cd3od-d4为溶剂，从
13
c-nmr图谱中可明显观察到乙酰基中羰基碳(c＝o)与甲基(-ch3)的特征信号峰，这是底物葛根素中不存在的化学基团，由此可判断产生的葛根素衍生物1a的分子结构中含有乙酰基(表3)。此外，与标准化学位移相比，葛根素母核上的碳原子的化学位移没有发生明显的改变，但是葡萄糖基中的c5
″
和c6
″
则发生了相应的位移变化，其中c6
″
的化学位移向低场移动，而c5
″
的化学位移向高场移动。根据表3所示的核磁数据，表明乙酰化修饰发生在葛根素的c6
″‑
oh上。以上实验数据说明，在mat纯酶的催化下，以乙酰辅酶a或双醋瑞因为酰基供体均能有效的合成葛根素单乙酰化衍生物，即葛根素6
″‑
o-乙酸酯。
[0069]
表3葛根素6
″‑
o-乙酸酯的1h和
13
c nmr数据
[0070][0071]
实施例7葛根素及其衍生物葛根素6
″‑
o-乙酸酯油水分配系数的测定
[0072]
采用正辛醇-水分配系数(log p)法测定葛根素及其衍生物葛根素6
″‑
o-乙酸酯油水分配情况，以观察葛根素及其衍生物葛根素6
″‑
o-乙酸酯的脂溶性。将一定量的葛根素及葛根素6
″‑
o-乙酸酯充分混合在相同体积的水合正辛醇中。涡旋震荡2min，然后超声15min，充分混合均匀后，12000rpm，离心5min。溶液分为上下两层，从上下两层分别取40μl，用hplc计算出化合物在正辛醇溶液和水溶液中相应浓度c1和c2，按公式p＝c1/c2计算油水分配系数。结果表明，葛根素的log p为-0.413，而葛根素6
″‑
o-乙酸酯的log p(-0.354)有所提高，从而说明通过以上酶促方法所获得的葛根素6
″‑
o-乙酸酯的脂溶性高于葛根素。
[0073]
实施例8以乙酰辅酶a为酰基供体合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯最适反应条件的测定1、最适ph的确定
[0074]
为获得最大转化效率，测定以乙酰辅酶a为酰基供体，催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的最适反应条件。设计8个平行反应ph梯度：3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7，其中每组均设有3个平行样品。其中ph 3-5.5为10mm的柠檬酸盐缓冲液，ph 6-7为20mm的磷酸盐缓冲液。取1.5ml ep管，建立100μl反应体系，具体反应体系和终止方法参照实施例4，反应2h。利用hplc-uv测定254nm波长下的产物1a的峰面积，hplc条件参考表1。通过葛根素6
″‑
o-乙酸酯标准曲线计算产物浓度，将最适ph条件下3个平行反应的转化率平均值定义为100％，以此计算其他ph条件下各组的相对值。如图7所示，以乙酰辅酶a为酰基供体，mat催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的最适ph为4.0。该反应的ph范围较窄，仅在ph3.5-4.5之间具有较强的催化活性，略超出此范围，活性立即大幅度下降，故需严格控制该反应的ph条件以保持mat的高活性。
[0075]
2、最适温度的确定
[0076]
设计了7个平行反应温度梯度：20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，其中每组均设有3个平行样品。取1.5ml ep管，建立100μl反应体系，具体反应体系和终止方法参照实施例4，反应2h。利用hplc-uv测定254nm波长下的产物1a的峰面积，hplc条件参考表1。同样
通过葛根素6
″‑
o-乙酸酯标准曲线计算产物浓度，数据处理方法同最适ph的测定过程。如图8所示，mta催化葛根素乙酰化的最适反应温度为40℃。mat乙酰化活性的温度适应范围较广，当温度高达80℃时，反应效率仍维持在最佳温度条件下的60％左右。
[0077]
实施例9以双醋瑞因为酰基供体合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯最适反应条件的测定
[0078]
1、最适ph的确定
[0079]
以双醋瑞因为酰基供体，测定mat催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的最适反应条件。具体反应体系同实施例5，设计10个平行反应ph梯度：3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9，每组均设有3个平行样品。通过葛根素6
″‑
o-乙酸酯标准曲线计算产物浓度，数据处理方法参考实施例8。如图9所示，mat在ph 5.5-6.0的条件下发挥最高活性。该反应方法也具有较强的ph敏感度，反应时须严格控制反应体系的ph值。
[0080]
2、最适温度的确定
[0081]
以双醋瑞因为酰基供体，在ph 5.5，10mm的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中测试mat合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的最适温度。设置7个温度梯度：20、30、40、50、60、70、80℃，具体反应体系同实施例5。如图10所示，mat的最适反应温度为50℃。相比于较低的温度(20-40℃)，当温度高于50℃时，产物的转化率发生骤降。
[0082]
实施例10酶促动力学参数的测定
[0083]
在最适ph和温度下，分别以乙酰辅酶a和双醋瑞因为酰基供体，对mat催化合成葛根素6
″‑
o-乙酸酯的酶促动力学参数进行测定(表4)。结果显示mat对双醋瑞因的km显著低于乙酰辅酶a，说明mat对酰基供体双醋瑞因的亲和力高于乙酰辅酶a。
[0084]
表4 mat催化葛根素6
″‑
o-乙酸酯合成的酶促动力学参数
[0085][0086]
实施例11 mat的丙氨酸突变
[0087]
1、mat丙氨酸突变体的构建
[0088]
为进一步提高葛根素6
″‑
o-乙酸酯的转化效率，通过定向进化的方法筛选活性提高的mat突变体。首先，对mat活性中心周围的5个候选关键位点进行丙氨酸扫描。利用fast mutageneis system(transgen公司)试剂盒进行定点突变。根据试剂盒中的说明进行引物设计，每条引物均包含突变位点，5
′
端重叠区和3
′
端延伸区。质粒pet28a-mat为模板，以突变引物(seq id no.15-seq id no.60)为特异性引物，通过如下程序和体系进行pcr，50μl体系中含模板pet28a-mat 1μl，10μm的引物fet28amat和ret28amat各1μl，2
×
transstart fastpfu pcr supermix 25μl，dd h2o补足。pcr程序：94℃预变性5min；94℃变性20s，55-60℃退火20s，72℃延伸3min，共20个循环；72℃终延伸10min，4℃保温。pcr产物经dmt去甲基消化酶消化。菌落pcr筛选后，进行测序验证并获得相应突变体。
[0089]
2、mat丙氨酸突变体的催化效率比较
[0090]
对m101a，e125a，f81a，n83a和w137a突变体催化合成葛根素6
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o-乙酸酯的效率进行比较。在最佳反应条件下，以葛根素为受体底物，分别在体系中添加等量的乙酰辅酶a或
双醋瑞因，具体反应体系参考实施例4和5。结果如图11和图12所示，与野生型mat相比，mat-e125a的催化活性明显上升，而其他4个突变体的活性则呈现出不同程度下降。以上实验数据表明，在本发明开发的两种葛根素6
″‑
o-乙酸酯酶促合成方法中，mat-e125a对其反应效率均具有促进作用。
[0091]
3、mat 125位饱和突变体的催化效率比较
[0092]
进一步测定mat 125位谷氨酸及其19个饱和突变体催化合成葛根素6
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o-乙酸酯的效率。以乙酰辅酶a为酰基供体，从中筛选出16个活性有所提高的突变体(图13)。与野生型mat对葛根素6
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o-乙酸酯的转化效率(29.62％)相比，突变体mat-e125n，mat-e125t，mat-e125p对葛根素6
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o-乙酸酯的转化率分别提升至68.53％，57.37％，56.41％。
[0093]
此外，以双醋瑞因为酰基供体，还筛选出11个呈现出更高活性的突变体(图14)。野生型mat催化合成葛根素6
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o-乙酸酯的效率为68.10％，经过定向进化，mat-e125v，mat-e125m，mat-e125r对葛根素6
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o-乙酸酯的转化率分别提升至94.03％，92.81％，92.18％。
[0094]
以上结果表明，在mat及其突变体催化合成葛根素6
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o-乙酸酯的过程中，以双醋瑞因为酰基供体的催化效率显著高于乙酰辅酶a。由于双醋瑞因可提供双倍的乙酰基供体且其价格低于乙酰辅酶a，因此以双醋瑞因为酰基供体酶促合成葛根素6
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o-乙酸酯的方法占据显著优势。