检测水稻氮高效基因NRT1.1B的KASP分子标记及方法与流程

检测水稻氮高效基因nrt1.1b的kasp分子标记及方法
技术领域
1.本发明涉及一种检测水稻氮高效基因nrt1.1b的kasp分子标记及方法，属水稻育种技术领域。


背景技术：

2.从上世纪50年代以来，化肥在农业生产中逐渐开始推广使用，使农作物的单位面积产量大幅增加。化肥的施用对粮食增产起了巨大的作用。在我国，化肥的施用对粮食增产的贡献率在40％左右，其中以氮肥的贡献率最大。1961年我国的水稻单产为2079kg/hm2，2017年水稻单产增加到6909kg/hm2，但同时氮肥的施用量增加了28倍(王吕与崔月贞等)。氮肥的过量使用给农田土壤和环境带来了严重的负面影响，破坏了农田生态系统的稳定性，成为了农业可持续发展的一个不利因素(张璐与黄晶等,2020)。
3.籼稻和粳稻是亚洲栽培稻的两个亚种。籼稻适合种植于热带和亚热带地区，粳稻适合种植于温带、寒带以及我国云贵高原等地区。籼稻和粳稻由于长期适应不同生态条件，两者在形态生理特性方面出现了明显的差异。已有研究表明，籼稻的氮肥利用效率显著的高于粳稻(koutroubas and ntanos,2003；殷春渊与张庆等,2010)。因此，如何利用籼稻中的基因资源，来选育氮肥利用效率高的粳稻品种，是一个长期挑战粳稻育种工作者的难题。hu等(2015)的开创性的工作发现了水稻的氮利用效率与硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b相关(hu and wang et al.,2015)，为解决这一世界级难题打开了一条捷径。水稻生长过程中氮素的来源包括硝态氮和铵态氮。由于水稻根系周围存在根际硝化作用，灌溉水稻吸收的氮中有40％以硝态氮的形式被吸收(kronzucker and glass et al.,2000)。研究发现籼稻和粳稻中的硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b出现了分化。其中籼稻中的等位基因nrt1.1b
‑
indica可以增强水稻根系对硝酸盐的吸收以及硝酸盐从根到地上部分的转运，将nrt1.1b
‑
indica等位基因引入到粳稻品种可以提高粳稻品种对氮肥的利用效率，以及提高产量。基因序列比较发现nrt1.1b基因编码区第980位碱基在粳稻中是一个c，而在籼稻为t，从而使nrt1.1b基因编码的蛋白的第327位氨基酸在粳稻和籼稻中分别为苏氨酸和蛋氨酸。这个snp位点的差别赋予了籼稻更好的氮利用效率(hu and wang et al.,2015)。这一研究成果为氮高效水稻品种的选育提供了一个重要的基因资源。
4.为了开展氮高效粳稻品种的分子标记辅助育种工作，根据nrt1.1b基因编码区第980位snp位点，两个不同的育种团队分别用四引物扩增受阻突变体系pcr(tera
‑
primer amplification refractory mutation system
‑
pcr,arms
‑
pcr)技术和等位基因特异pcr(allele
‑
specific pcr，as
‑
pcr)技术设计了nrt1.1b基因的功能性分子标记(田孟祥与余本勋等,2016；方琳与陶亚军等,2020)。此外，根据籼稻和粳稻nrt1.1b基因的内含子序列的比较，发现了6个indel位点，根据这些indel位点设计的indel标记，也可以进行nrt1.1b基因型的鉴定(李军与李白,2016)。
5.竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr,kasp)是一种一步法的基因型鉴定技术，通过荧光信号判断目标位点的基因型。由于kasp标记具有省时省
力，费用低廉等特点，逐步成为了分子标记辅助育种中常用的标记类型(steele and quinton
‑
tulloch et al.,2018；牛付安与周继华等,2019)。本研究根据nrt1.1b基因中的功能性snp位点开发了一个kasp分子标记nrt1.1b
‑
kasp，可以准确地鉴定出nrt1.1b的基因型，为氮高效水稻新品种的分子标记辅助选择育种打下了基础。


技术实现要素：

6.本发明的目的是开发一个检测水稻氮高效基因nrt1.1b的kasp分子标记并应用于分子标记辅助选择育种，降低对大量样本进行nrt1.1b基因分子标记辅助选择的成本，提高育种效率。
7.为实现本发明目的，本发明提供了一种检测水稻氮高效基因nrt1.1b的kasp分子标记(nrt1.1b
‑
kasp)，其特征在于，所述nrt1.1b
‑
kasp分子标记的引物序列为：
8.indica
‑
allele
‑
f：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattcagcctccacttgctcgcca
‑3’
；
9.japonica
‑
allele
‑
f：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctagcctccacttgctcgccg
‑3’
；
10.common
‑
r：5
’‑
tcctggaccatgcggcgatcat
‑3’
。
11.另一方面，基于所述的kasp分子标记，本发明提供了检测水稻氮高效基因nrt1.1b的方法，包括以下步骤：
12.1)提取水稻待测样本的dna；
13.2)采用nrt1.1b
‑
kasp分子标记对待测样本的基因组dna进行目标序列的pcr扩增；所述nrt1.1b
‑
kasp分子标记的引物序列为：
14.indica
‑
allele
‑
f：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattcagcctccacttgctcgcca
‑3’
；
15.japonica
‑
allele
‑
f：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctagcctccacttgctcgccg
‑3’
；
16.common
‑
r：5
’‑
tcctggaccatgcggcgatcat
‑3’
；
17.3)对扩增后的样品进行基因分型检测，根据基因分型的结果判断样本材料中是否具有氮高效基因nrt1.1b。
18.所述indica
‑
allele
‑
f的5'端为hex荧光信号标签，hex荧光信号标签序列为5'
‑
hex
‑
gaaggtcggagtcaacggatt
‑
3'；所述japonica
‑
allele
‑
f的5'端为fam荧光信号标签，fam标签序列为：5'
‑
fam
‑
gaaggtgaccaagttcatgct
‑
3'。
19.优选地，步骤2中pcr扩增反应体系为10μl，包括2
×
kasp master mix 5μl，kasp primer mix 0.14μl，模板dna 1.0μl，ddh2o 3.86μl。
20.优选地，步骤2中pcr扩增反应程序如下：94℃预变性15min；94℃变性20s；61
‑
55℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。
21.优选地，步骤3中基因分型的方法是pcr扩增反应结束后，采用pherastar plus酶标仪检测pcr产物，然后将数据导入klustercaller数据处理软件进行分析。根据颜色分类，聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的nrt1.1b
‑
japonica等位基因型，聚合在接近y轴上的显示红色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的nrt1.1b
‑
indica等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为杂合型。左下角显示黑色的样本为空白对照。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的检测水稻氮高效基因nrt1.1b的kasp分子标记(nrt1.1b
‑
kasp)，是根据nrt1.1b基因编码区第980位的snp位点设
primer mix 0.14μl，模板dna 1μl，ddh2o 3.86μl。
42.pcr反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s；61
‑
55℃退火延伸60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。
43.(2)kasp分子标记nrt1.1b
‑
kasp的基因分型
44.反应结束后，采用pherastar plus酶标仪检测pcr产物，然后将数据导入klustercaller软件进行聚类分析。如图1所示，根据检测的两种荧光的颜色分类，聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的nrt1.1b
‑
japonica等位基因型，聚合在接近y轴上的显示红色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的nrt1.1b
‑
indica等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为杂合型。
45.基因分型结果显示，在bc4f2代群体中有14个单株基因型与供体亲本
‘
9311’相同，携带nrt1.1n
‑
indica等位基因，34个单株为杂合子，17个单株与轮回亲本
‘
繁14’基因型相同，携带nrt1.1n
‑
japonic等位基因。
46.5、bc4f2个体nrt1.1b基因型的测序验证
47.为了验证nrt1.1b
‑
kasp标记的准确性，对65个bc4f2样品进行pcr扩增，然后进行测序。在nrt1.1b基因编码区第980位snp位点处是碱基c时，则nrt1.1b的基因型为nrt1.1b
‑
japonica，snp位点处是碱基t时，则nrt1.1b的基因型为nrt1.1b
‑
indica，snp位点处是出现双峰的则是杂合子。对测序结果序列进行比对后发现，在65个bc4f2个体的dna样品中，17份样品显示基因型与
‘
繁14’相同，34份样品显示杂合基因型，14份样品显示与
‘
9311’基因型相同，测序分析的结果与nrt1.1b
‑
kasp标记基因分型的结果完全一致(图2,表1)。这一结果说明了nrt1.1b
‑
kasp标记能准确的在群体中筛选出携带氮高效nrt1.1b
‑
indica等位基因的个体。
48.表1 nrt1.1b
‑
kasp标记dna测序基因分型结果的对比
[0049][0050][0051]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和
原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。