Synaptotagmin-11mRNA作为帕金森综合征标志物及其用途的制作方法

synaptotagmin-11 mrna作为帕金森综合征标志物及其用途
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及synaptotagmin-11 mrna作为帕 金森综合症标志物及其用途。


背景技术：

2.帕金森病(parkinson’s diseases,pd)是第二大神经退行性疾病，65岁以 上人群发病率1.7％以上，80岁以上发病率达10％，该病首次命名至今已有 200多年历史，但至今尚无特异高效的检测试剂盒、也没有临床根治方法。
3.pd在临床上的主要表现为运动迟缓、肌肉僵直、静止性震颤和姿势步 态失稳等运动障碍，且伴有抑郁、痴呆、睡眠障碍、嗅觉失敏、疼痛、尿 失禁、便秘等一系列非运动障碍，是严重影响人类健康，给社会和家庭带 来沉重负担的一种多巴胺(dopamine,da)神经元特异性退行性病变。pd 的非运动症状可早于运动症状10-15年出现，但运动症状与da神经元凋亡 则是目前pd临床诊断的金标准。然而，临床上运动症状出现时da神经元 的凋亡与缺失已高达60％以上，因神经元不可再生，导致pd目前尚无有效 的根治方案，目前临床的主要治疗策略也仅局限于da的替代性治疗药物或 深部脑刺激等姑息性治疗方案。目前，寻找早期高效诊断标志物，利用帕 金森病10余年窗口期，在da神经元死亡前进行保护或预防性治疗，成为 pd预防和根治的重要策略，也是达到pd治未病、迟发病或终生不发病终极 目标的关键所在。因此，pd的病理机制及其诊断标志物研究一直都是本领 域最基础、最重要、最核心的研究内容之一，根据medline数据库，目前 国际学术界已发表约12万篇pd相关文献。在美国国立卫生署历年(24年) 来已批准的项目中，pd研究约2.2万项。然而，目前仍未出现pd早期诊断 标志物，尤其是外周血单一标志物的相关报道与临床应用。pd早期诊断标 志物的发现和应用一直都是本领域200多年以来悬而未决的关键科学问题 与医学难题。
4.帕金森病最初被认为是散发性疾病，随着全基因组关联分析(gwas)及 全基因组、全外显子测序等技术的出现，人们发现了包括park1(snca)、 park2(parkin)、park6(pink1),park7(dj-1)和park8(lrrk2)在内的大量 pd关联/致病基因，由此奠定了帕金森病的遗传机制。然而，目前已知所有 家族遗传性(基因突变)pd仅占全部pd病例的5-10％(数据来自参考文 献nat rev neurosci 2017,18:251-259；trend neurosci 2014,37(6):316-324； mol cell probes 2016,30:386-396；trend biochem sci 2015,40(4):200-210； neurodegenerative dis 2007,4:424
–
427)，基因突变或遗传因素作为pd的诊 断标志严重受限。因此，本领域形成的广泛共识(比如文献nat rev disprimers 2017,3,17013；lancet 2015(386):896-912；parkinsonism relat disord 2016 s1:s106-110中记载)是遗传因素、尤其是单基因遗传因素不可能作 为pd病理进程的广谱性临床诊断标志物，且目前为止也并未发现能够有效 指征pd病理进程的单一临床诊断标志物。


技术实现要素：

5.第一方面：本发明提供如下任一所述应用：
6.1)检测突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片段含量的物 质在制备诊断或者辅助诊断待测人是否患有帕金森综合征产品中的应用；
7.2)检测突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片段含量的物 质在制备筛查或辅助筛查待测人是否患有帕金森综合征产品中的应用；
8.3)检测突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片段含量的物 质在诊断或者辅助诊断待测人是否患有帕金森综合征中的应用；
9.4)检测突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片段含量的物 质在筛查或辅助筛查待测人是否患有帕金森综合征中的应用。
10.第二方面：如下任一所述应用：
11.1)突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片段作为标志物在 诊断或辅助诊断待测人是否患有帕金森综合征中的应用；
12.2)突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片段作为标志物在 筛查或辅助筛查待测人是否患有帕金森综合征中的应用。
13.待测人候选为帕金森综合症患者、帕金森综合症疑似患者、帕金森综 合症高风险人群或帕金森综合症患者直系亲属；帕金森综合症患者为散发 性帕金森综合症患者或家族遗传性帕金森综合症患者。
14.第三方面：本发明提供一种诊断或辅助诊断、筛查或辅助筛查待测人 是否患有帕金森综合征的产品，所述产品基于生物样品中突触结合蛋白 synaptotagmin-11 mrna或mrna片段的表达量，诊断或辅助诊断、筛查 或辅助筛查待测人是否患有帕金森综合征；可选的，生物样品来自待测人；
15.可选的，所述产品为试剂盒；可选的，所述试剂盒包括特异性检测 synaptotagmin-11 mrna表达水平的试剂；
16.可选的，所述试剂包括pcr反应缓冲液或核酸分子杂交缓冲液；进一步 的，包括突触结合蛋白synaptotagmin-11基因或synaptotagmin-11 mrna的特 异性序列，或含有这些特异性序列的分子探针。
17.可选的，所述核酸分子为单链或双链的dna片段或rna片段；
18.可选的，所述dna片段或rna片段含有与synaptotagmin-11基因或 synaptotagmin-11 mrna相同、相似或互补的编码序列；
19.可选的，所述dna片段或rna片段可经同位素、辣根过氧化物酶、胶 体金、荧光探针等修饰，或未经修饰。
20.第四方面：本发明提供一种诊断或筛查帕金森综合征的系统，包括：
21.获得装置，所述获得装置用于获得生物样品中突触结合蛋白 synaptotagmin-11 mrna或mrna片段的表达量；
22.判断装置，所述判断装置与所述获得装置相连或进行无线连接，所述 判断装置用于基于所述生物样品中突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna 或mrna片段的表达量，诊断或筛查帕金森综合征。
23.可选的，所述判断装置进一步包括：
24.所述生物样品中突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna的表达量高于 正常样本中突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna的表达量，是对应待测 人患有帕金森综合征的指
示；所述生物样品为人中脑组织或体液；可选的， 所述体液选自血液、脑积液和尿液中的一种或几种；
25.第五方面：一种用于诊断或治疗帕金森综合征的生物标志物，所述标 志物为突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片段；
26.可选的，所述突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片段为 人中脑组织或体液中的突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna或mrna片 段；
27.第六方面：一种帕金森综合征动物模型，与野生型动物相比，所述帕 金森综合征动物模型中脑或体液中突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna 或mrna片段含量升高。
28.可选的，所述动物包括选自小鼠、大鼠或者灵长类动物中的至少一种。
29.第七方面：一种筛选用于治疗帕金森综合征的药物的方法，其特征在 于，包括：将候选药物施用于上述的动物模型；
30.筛选使得突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna水平或 synaptotagmin-11表达量下降或使其活性降低的候选药物，作为所述用于治 疗治疗帕金森综合征的药物。
31.第八方面：下调、敲除或突变突触结合蛋白synaptotagmin-11的物质 在制备帕金森综合征药物中的应用；
32.所述药物的功能为如下任意一种：
33.1)所述药物使突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna的表达水平降低；
34.2)所述药物使突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna在核糖体上的翻 译过程受阻；
35.3)所述药物降低或阻断突触结合蛋白synaptotagmin-11的生理功能；
36.4)用于治疗帕金森病综合征。
37.可选的，所述使突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna表达水平降低的 方式为如下任意一种或几种：降低或阻断突触结合蛋白synaptotagmin-11编 码基因的转录水平；导致突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna的成熟、加 工及转运过程异常；增加突触结合蛋白synaptotagmin-11 mrna降解速度； 导致突触结合蛋白synaptotagmin-11基因突变；
38.可选的，所述药物降低或阻断突触结合蛋白synaptotagmin-11的生理功 能具体为所述药物降低或阻断突触结合蛋白synaptotagmin-11对多巴胺分泌 的抑制作用，或可通过加速胞吞、加速囊泡循环等方式增加多巴胺分泌。
39.可选的，所述帕金森综合征的患者为具有家族遗传史，或散发性帕金 森综合症患者。
40.第九方面：一种治疗帕金森综合征的产品，包括下调、敲除或突变突 触结合蛋白synaptotagmin-11基因，降低其mrna表达水平或蛋白生理功能 的物质。
41.可选的，所述突触结合蛋白synaptotagmin-11为人中脑组织或体液中的 突触结合蛋白synaptotagmin-11。
42.可选的，所述体液选自血液、脑积液和尿液中的一种或几种。所述血 液为离体血液；人中脑组织为离体人脑组织。
43.可选的，适用人候选为帕金森综合症患者。
44.本发明技术方案，具有如下优点：
45.发明人通过研究，出乎意料地发现外周血突触结合蛋白 synaptotagmin-11
(syt11)可作为理想的pd病人的单一诊断标志物。现有 技术中已经公开了syt11是胞吞作用的重要刹车蛋白(embo rep 2016, 17(1):47-63)，并进一步公开了syt11可作为parkin的底物介导parkin相关 pd的病理进程(nat commun 2018,9:81)。众所周知，parkin突变被认为是 与家族性pd密切相关，且其导致pd的占比很低(《2％，由此推测，parkin 及其底物不可能作为pd的广谱性诊断标志物)。出乎意料地，本发明发现， 散发性及具有家族遗传史的pd病人竟然均出现外周血syt11表达水平显著 上调，且50％以上的pd患者外周血syt11表达水平出现高幅上调(是对照 组均值的1.75倍以上，在对照组95％分位线以上)，这一比例远高于目前已 知所有遗传性pd病人比例的总和(5-10％)，且93％以上syt11高表达人群 均为pd患者。更为重要的是，发明人在mptp、6-ohda、鱼藤酮等小鼠 pd模型中均发现，syt11表达上调起始于pd的最早期阶段(造模成功需 2-3周，syt11表达上调在造模12-24小时以内就已开始出现)。这些突破性 进展表明syt11是迄今已知上百种pd遗传相关基因中唯一可作为pd临床 诊断，尤其是早期诊断，的单一靶标标志物，也是迄今最为理想的pd临床 检测标志物。
46.发明人早期研究成果表明parkin缺失将通过引起syt11蛋白降解异常进 而导致syt11在中脑多巴胺神经元表达上调，这是介导parkin相关pd病理 进程的关键所在。但在大脑的另一重要脑区海马神经元中并未检测到syt11 表达变化，基于这些发现，本领域技术人员一般认为syt11的表达上调具有 组织特异性，外周血syt11应不能反映pd病人脑组织的病理变化。同时， 已知parkin有十几种不同的底物，parkin失活导致这些底物在da神经元表 达上调，但无任何一个已知底物可以作为外周血标志物用于pd的独立检测 指标。进一步，我们早期研究表明parkin通过介导syt11蛋白酶体依赖性的 降解过程调控syt11蛋白水平，但pd病人与pd小鼠模型中syt11 mrna 及蛋白水平均发生显著上调，表明syt11存在重要的parkin非依赖性的调控 机制，而这可能是导致syt11在pd病人/动物模型中高表达的全新机制。因 此，pd病人外周血中syt11 mrna及其蛋白表达上调实属意外发现。更为 意外的是，syt11不仅是pakrin底物中唯一一个可用于pd诊断的外周血标 志物，且其高表达比例(》50％)远远超出parkin自身所占pd的比例(《2％， neurology 2001,57:359-362；parkinsonism and related disorders 2012,18: s66-70)，甚至远远超出所有遗传性pd占全部pd病例的比例总和(《10％)， 且其表达上调早在pd早期阶段就已出现。因此，以syt11为标志物进行遗 传性及散发性pd病人的早期检测，无论其适用范围(50％以上pd患者的 早期筛查、临床诊断、分型分析和老年人常规体检)，还是其检测效力(阳 性正确率93％以上、比临床诊断早5-10年)，都取得了出乎意料的效果。
47.综上，pd的早期诊断是本领域长期以来一直希望解决但从未解决的世 界性重大科学问题与医学难题，发明人出乎意料地发现中脑组织及外周血 syt11高表达是散发性及家族遗传性pd的重要标志，syt11基因及其蛋白表 达水平是迄今最理想的pd临床诊断，尤其是早期临床诊断的重要依据。
附图说明
48.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的
前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。
49.图1为实施例1中pd病人和对照人群外周血中syt11的表达水平； 其中图1a中显示了对照(ctrl)和随机性pd病人外周血syt11表达水平的 western blot部分代表性条带，图1b是对照(ctrl，n＝45)和pd病人(n＝53)外周血syt11表达水平的统计分析；
50.图2为实施例2中mptp诱导pd小鼠模型脑组织中syt11蛋白表达上 调的统计分析；
51.图2a为中脑多巴胺神经元(snc、vta)在脑区的主要投射区域(纹 状体、前额叶等)模式图；
52.图2b为用旷场来评估小鼠的运动能力，验证mptp小鼠pd造模成功 (saline为生理盐水对照组)；图2b纵坐标duration time(运动持续时间)、 max speed(运动最大速度)和distance(活动路程)；
53.图2c和图2d分别为mptp注射不同时间(12小时、1天、5天、9天、 21天)后纹状体和黑质区syt11蛋白表达水平的统计分析；图2c和图2d中纵坐标为sy11表达(相对于ctrl的倍数)；
54.图3为实施例3中mptp诱导的pd小鼠(n＝7)与对照鼠(n＝8) 海马神经元syt11蛋白表达水平；
55.图4为实施例4中mptp诱导pd小鼠模型血液中syt11表达水平的 统计分析；其中图4左图为mptp诱导5天后，pd小鼠(n＝7)和对照鼠 (n＝6)中syt11蛋白表达水平变化；图右图为mptp注射不同时间后， 外周血中syt11 mrna的转录水平变化(每条件每组，n＝7)；
56.图5为实施例5中在da神经元中特异性敲除syt11可显著逆转pd病 理进程的结果图；
57.其中图5a为实施例5的实验流程图；图5b为syt11敲除鼠(cko)与 对照鼠(dat-cre)在mptp注射过程及之后的死亡率统计分析，syt11 cko 鼠死亡率大幅降低；图5c为旷场实验测试焦虑样行为中小鼠在旷场中央和 边缘的时间；图5d为旷场实验中mptp处理后小鼠的运动最大速度和运动 路程；
58.图5e为吊线(吊环)实验中mptp处理后小鼠在铜线上的持续时间；
59.图5f为滚轮实验中mptp处理后小鼠在滚轮上的持续时间；
60.图5g为步态实验中mptp处理后小鼠前后脚掌的重叠情况；range of stride length即步幅范围；
61.图6为实施例6中的6-ohda诱导pd小鼠模型中syt11的表达水平统 计分析；
62.图6a-b为6-ohda诱导pd鼠(n＝7)和对照鼠(n＝8)黑质区(snc) 及纹状体区(striatum)syt11蛋白的表达水平；
63.图6c为海马体(hippo)中syt11蛋白的表达水平(每条件每组，n＝7)；
64.图7实施例7中的鱼藤酮诱导pd小鼠模型血液中syt11表达水平的统 计分析；
65.图7a为鱼藤酮诱导pd小鼠(rot)与对照鼠(ctrl)外周血中syt11 蛋白表达水平的部分代表性western blot条带图；
66.图7b为鱼藤酮注射不同时间后外周血中syt11蛋白的表达水平统计图 (每条件每组，n＝6)；
67.图7c为鱼藤酮注射不同时间后，pd小鼠(rotenone，n＝5)与对照鼠 (ctrl，n＝4)外周血中syt11 mrna的转录水平变化；
68.图8为实施例8中小鼠模型中parkin敲低对其底物paris和aimp2表 达水平影响图；
69.图8a为野生型(wt)小鼠单侧parkin敲除后，左右两侧parkin、paris 和aimp2的表达水平；
70.图8b-d分别为parkin、paris和aimp2的表达水平统计图，contra为 未注射病毒的对照侧，kd为注射侧(n＝4)；
71.图8e-h分别为为syt11敲除鼠(cko)单侧parkin敲除对paris和aimp2 表达水平的影响图，kd为注射侧(n＝4)。
具体实施方式
72.下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发 明的解释而不是限定。
73.除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品， 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所用到的核酸电泳、 western blot、real time pcr等操作均按常规方案进行。
74.dat-cre鼠、syt11 flox鼠、shrna慢病毒均在wang c,kang x, zhou l,et al.synaptotagmin-11 is a critical mediator of parkin-linkedneurotoxicity and parkinson's disease-like pathology[j].naturecommunications,2018,9(1):81.公开过。
[0075]
ip细胞裂解液：含2％(体积比)的cocktail(539134,calbiochem)和1％ (体积比)pmsf。
[0076]
实施例1.帕金森病人外周血syt11表达水平显著升高
[0077]
1.外周血syt11蛋白的提取
[0078]
取5μl人血液样本(10μl鼠血加入90μl ip)加入至95μl ip细胞裂 解液中，匀浆后，12000g 4℃离心15min，取上清，加1/4上清体积的5x sds-page上样缓冲液，95-100℃煮沸10min，即得蛋白样品，用于westernblot分析。
[0079]
2.western杂交：将所得蛋白溶液进行电泳，并电转至pvdf膜，用含 5％脱脂奶粉的tbst溶液室温封闭1-1.5h，洗膜3次，在含syt11一抗 (sysy，270 003)的2％bsa tbst溶液中4℃孵育过夜，用tbst洗膜 5次后再与相应二抗(111-035-003兔抗、115-035-003鼠抗，jacksonimmunoresearch)室温孵育1.5-2h，tbts洗膜5次后在clinx chemicapture 成像系统中进行扫描。结果如图1所示，pd病人外周血中syt11蛋白表达 水平比对照组(正常人)显著上调(***p《0.001)；图1中的pd病人为随 机选取的pd病人，共53例(27例表现出syt11显著上调)，其中6例具有 家族遗传史(4例出现syt11表达上调)，47例为散发性帕金森病患者(23 例出现syt11表达上调)；pd病人外周血为临床确诊为帕金森综合征患者的 外周血，由西安交通大学第一附属医院、大连市人民医院、邢台市人民医 院提供，且患者知情。45例正常人为来自常规体检人群，无帕金森病。以 对照组(ctrl)的上95％作为分位线，超过50％的pd病人syt11蛋白表达 显著升高，这一数值远远高于其他所有遗传因素总和(5-10％)，且超过93％ 的syt11表达上调人群均是pd患者，表明syt11是迄今为止已知上百种pd 遗传相关基因中最为理想的外周血pd临床检测标志物。
[0080]
实施例2.mptp诱导pd小鼠模型多巴胺神经元syt11表达显著上调
[0081]
1.pd小鼠造模
[0082]
以25mg/kg/天腹腔注射mptp，连续5天注射制作小鼠pd模型。
[0083]
2.旷场实验
[0084]
将实验动物从饲养笼中轻轻取出，并迅速放置于旷场实验装置(50cm х50cmх40cm)的中央区域，使用anymaze分析软件自动记录动物在旷 场内的活动，实验时间为30min。软件自动统计实验动物的活动路程、平 均速度、最大速度等，用以指征小鼠的运动能力。结果(见图2b)表明， 与注射生理盐水组(saline)相比，注射mptp组无论在运动持续时间、运 动最大速度和活动路程均有显著性降低，表明pd小鼠造模成功。同时，采 用软件自动统计实验动物在中央区域(20cmх20cm)的停留时间和进入 次数，和外围区域(离箱壁5cm的位置)的停留时间和进入次数，用以指 征小鼠的焦虑状况。
[0085]
3.脑组织蛋白提取
[0086]
实验鼠麻醉后，用20ml冰冷的人工脑脊液进行心脏灌流，迅速断头取 出脑组织，并在leica vt1200s切片机上将海马、纹状体和黑质切成300μm 厚的脑组织水平切片，将脑切片进行组织匀浆，匀浆后的组织在4℃以12000 g离心15min。取上清，加1/4上清体积的5x sds-page上样缓冲液， 95-100℃煮沸10min，即得蛋白样品，用于western blot分析。结果表明， 无论是多巴胺神经元胞体区(黑质区，snc，图2d)还是其投射区(纹状 体区，striatum，图2c)，mptp注射组syt11蛋白的表达水平均显著上调。 更为重要的是，首次注射mptp 12h后在纹状体中就能检测到syt11蛋白表 达显著增加(p《0.05)，在黑质区注射1天后也能检测到syt11蛋白表达显 著增加(p《0.05)，采用mptp制作pd小鼠模型需要2周时间才能造模成 功，而syt11表达在mptp首次注射当天既已显著上调，表明syt11蛋白表 达上调是pd的一个极早期事件。
[0087]
实施例3.mptp诱导pd小鼠模型海马神经元syt11表达水平未见明 显异常
[0088]
小鼠(对照组，和mptp造模小鼠)麻醉后分离海马组织，提取总蛋 白进行western blot分析，结果如图3所示，直至mptp造模的第21天(从 首次注射mptp的第1天开始计)，海马组织中也未检测到syt11表达出现 差异，表明mptp能够特异导致黑质和纹状体(与pd相关的脑核团)中 syt11的表达上调。
[0089]
实施例4.mptp诱导的pd小鼠模型外周血syt11蛋白表达与转录水 平显著升高
[0090]
1.小鼠外周血syt11蛋白表达水平的western blot方法如实施例1所示。 结果表明，mptp诱导5天后，pd组小鼠外周血中syt11蛋白的表达水平 显著升高(图4左图)。这些结果表明，尽管大脑组织中syt11的表达上调 具有脑区特异性，但外周血syt11的表达水平可能是pd病理进程的重要标 志。
[0091]
2.小鼠血液中syt11 mrna的转录水平
[0092]
(1)血液裂解：将0.25ml血液样品移至离心管中，添加0.75ml rnaisoblood(9112，takara)。用移液枪上下反复吸打20次直至细胞完全裂解。
[0093]
(2)rna提取：在匀浆裂解液中加入氯仿(0.2ml)，混合至溶液乳 化呈乳白色，室温静置5min。12000g、4℃离心15min，取上清，向上清 中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，4℃静置30min。12000g、4℃离心10min，试管底部会出现rna沉淀。弃上清，加入等量 75％(v/v)乙醇振荡清洗，7500g、4℃离心5min，弃上清。室温干燥沉淀， 加入适
量rnase-free水溶解沉淀。
[0094]
(3)反转录：使用含有oligo dt primer的反转录试剂盒(rr047a, takara)，加入rna模板，42℃2-5min去除基因组dna，然后使用pcr 扩增仪，37℃15min，85℃5s进行反转录。
[0095]
(4)syt11定量：应用cfx96 real-time pcr detection sysytem进行检 测，配置10μl pcr反应液，tb green(takara，rr820)5μl，syt11 引物(genbank编号：229521)各0.4μl，cdna模板40ng，灭菌水3.4 μl。real time pcr扩增结果如图4右图所示，与生理盐水组相比，注射mptp 12h后，血液中syt11 mrna的转录水平显著升高(p《0.01)，第五天后， 转录水平升高更显著(p《0.001)，而且这种升高至少持续21天。这些结果 表明，外周血syt11的转录与表达水平均起始于pd病理进程的早期阶段， 可作为pd早期临床诊断的理想标志物。
[0096]
实施例5.syt11敲除逆转mptp诱导的pd行为学变化
[0097]
1.syt11敲除提高mptp-pd小鼠的存活率
[0098]
以dat-cre鼠与syt11 flox鼠交配产生多巴胺神经元特异性syt11敲除 鼠(syt11 cko)。以6月龄syt11 cko小鼠和dat-cre对照鼠为实验对象， 连续5天腹腔注射mptp(25mg/kg)制作pd小鼠模型。结果表明，与 dat-cre对照鼠相比，连续5天mptp过程后，syt11 cko鼠的死亡率大大 减低(图5a-b)，说明敲除syt11可以降低mptp的毒性作用，对小鼠存活 具有保护作用。
[0099]
2.syt11敲除缓解mptp-pd小鼠的焦虑样行为
[0100]
旷场实验测试焦虑样行为如实施例2所述。结果如图5c所示，结果表 明，mptp注射后对照鼠的确出现了pd样的焦虑样症状，而syt11-cko小 鼠到旷场中心的探索时间显著高于对照鼠，在旷场边缘的时间则显著缩短 (图5c)，说明syt11敲除可以缓解mptp-pd小鼠的焦虑样行为。
[0101]
3.syt11敲除逆转mptp-pd小鼠的运动行为
[0102]
(1)旷场实验如实施例2所述。结果如图5d所示，与dat-cre对照 鼠相比，syt11 cko鼠无论是在最大运动速度(max speed)还是在运动路 程(total distance)上都有显著提高(p《0.05)。
[0103]
(2)吊线实验：在一个大的填满垫料的饲养盒上方60cm处悬挂一条 紧绷的铜线。将小鼠轻轻放置在铜线上，小鼠会保持一个倒挂姿势，在小 鼠力量不足时会选择跳入饲养盒内，记录保持在铜线上的时间可以反应小 鼠的运动能力。结果如图5e所示，与dat-cre对照鼠相比，syt11 cko小 鼠在铜线的持续时间(duration time)显著增加(p《0.001)。
[0104]
(3)滚轮实验：将转棒式疲劳仪(ugo basile)设置起始速度为5rpm， 并在5min后加速直至终速度为40rpm。抓住小鼠的尾巴，放置于疲劳仪 上，背对观察者，并确保小鼠不会转向。在小鼠适应30s后启动加速，记 录小鼠从疲劳仪上掉下的时间和转速。本实验通过4天的训练，每天连续 训练三次，在第五天时进行正式实验，记录掉落时间和转速(超过5min 不掉落以5min为最大值)。结果参见图5f所示，与dat-cre小鼠相比，syt11 cko小鼠在滚轮上的持续时间显著增加(p《0.001)。
[0105]
(4)步态分析：在小鼠的前后脚掌分别涂上红、黑两种无毒颜料，实 验小鼠每天在长100cm，宽10cm和高10cm的跑道上训练跑步三次，连 续三天训练后进行步态实验与分析，统计步间距与前后脚掌的重叠情况(掌 心距离)，以评估小鼠步伐的稳定性。结果如图5g所
示，与dat-cre对照 鼠相比，syt11 cko鼠前后脚掌步间距的差异波动变化显著降低、前后脚掌 重叠度增加。
[0106]
以上结果表明，多巴胺神经元及外周血中syt11表达上调是帕金森病早 期重要的致病机制之一。syt11表达上调不仅可作为pd重要的早期诊断标 志物，靶向syt11还可全面逆转pd相关的运动症状与非运动症状，是pd 治疗的有效药物靶点。
[0107]
实施例6. 6-ohda(6-羟基多巴胺)诱导的pd小鼠模型syt11表达水平显 著升高
[0108]
1.6-ohda脑立体定位定向注射，制作单侧pd小鼠模型。
[0109]
小鼠腹腔注射1.5g/kg乌拉坦进行麻醉，采用加热毯维持其体温在37 ℃，同时使用氧气面罩提供氧气保持小鼠状态良好。将小鼠固定在脑立体定 位仪上，保持前、后囟点在同一平面。利用坐标(ap:-2.1mm，ml:1.1mm) 找到前脑内侧束(mfb)所在的平面位置，利用颅骨钻打孔，将安装32g 针头的注射器以颅骨为平面插入脑中-4.3mm位置。6-ohda注射剂量为2.5 μg/只。
[0110]
2.western blot分析
[0111]
western blot分析如实施例1所述。结果表明，与未注射6-ohda的对 照侧相比，6-ohda注射侧的syt11表达无论是在黑质(图6a)还是在纹 状体(图6b)都有非常显著的升高(p《0.001)，而在海马(图6c)处两侧 未见显著性的差异，表明syt11表达上调同样适用于6-ohda制作的pd小 鼠模型，提示syt11表达上调是散发性pd共同的病理机制。
[0112]
实施例7.鱼藤酮诱导的pd小鼠模型外周血syt11表达水平显著升高
[0113]
以30mg/kg鱼藤酮灌胃给药，连续21天灌胃制作小鼠pd模型。取10 μl小鼠血液样本加入90μl ip细胞裂解液中提取总蛋白，用于western blot 分析。结果如图7a-b所示，鱼藤酮灌胃当天即可检测到外周血syt11表达 上调，且这种上调水平可持续到pd小鼠模型建成。同时，syt11 mrna转 录水平也表现出类似的上调趋势，进一步证明syt11表达上调是pd共同的 病理机制，外周血syt11 mrna与syt11蛋白是pd早期筛查和临床诊断的 理想标志物。
[0114]
实施例8.parkin的重要底物paris和aimp2在pd小鼠模型中表达 水平未见明显异常
[0115]
发明人前期的工作(现有技术)表明syt11是parkin的底物，但parkin 的底物众多，然而，大多数底物都不能证明可以介导pd的病理进程。因此， 除syt11之外，本实施例又进一步检测了parkin的另外两个底物paris和 aimp2是否在pd的病理进程中也会出现表达上调。
[0116]
1.parkin shrna病毒注射
[0117]
小鼠腹腔注射1.5g/kg乌拉坦进行麻醉，采用加热毯维持其体温在37
°
c，同时使用氧气面罩提供氧气保持小鼠状态良好。将小鼠固定在脑立体定 位仪上，保持前、后囟点在同一平面。利用坐标(ap:-3mm，ml:1.25mm) 找到黑质所在的平面位置，利用颅骨钻打孔，将安装32g针头的注射器以 颅骨为平面插入脑中4mm，以100nl/min的速度缓慢注入1μl parkin shrna 慢病毒浓缩液(滴度：10
8-109/ml)，注射结束后停留15-20min，缓慢拔出 注射器，缝合头皮后，小鼠置于37c加热毯上复苏。
[0118]
2.western杂交
[0119]
结果如图8所示，本实施例发现野生型(wt)小鼠单侧parkin敲低(kd) 后，parkin
的表达水平显著降低，但paris和aimp2表达在两侧没有出现 差别(图8a-d)，表明parkin敲低后的pd模型中没有影响paris和aimp2 的表达。为进一步检测syt11对这两个底物的表达是否有影响，本实施例进 一步在syt11 cko鼠上重复该实验，发现单侧parkin敲低后，paris和 aimp2表达水平在两侧脑区仍未出现差异(图8e-h)，表明parkin敲低的 pd模型中syt11的表达对paris和aimp2表达也未产生影响。这些结果 表明，与其他parkin底物不同，syt11是目前已知唯一可用于pd早期筛选 与诊断的单一标志物。
[0120]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。