一种碳量子点键合硅胶色谱固定相及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及高效液相色谱柱材料技术领域，尤其是一种碳量子点键合硅胶色谱固定相及其制备方法与应用。


背景技术：

2.高效液相色谱(hplc)法凭借着其较高的选择性与灵敏度等优点，已经成为目前应用最为广泛的分离技术之一，如在医药，食品，环境科学等领域都发挥着不可或缺的作用。根据液相色谱保留机制的不同，液相色谱固定相可分为反相色谱、正相色谱、亲水作用色谱、离子交换色谱以及体积排阻色谱等多种模式。然而，随着分离样品中成分的日益复杂，单一保留机理的液相色谱已无法满足人们的需求。如最经典、使用最广泛的反相色谱柱c18，虽然具有强大的分离能力，但是却在分离强极性化合物时存在一些不足。因此，具有多种保留机理的混合模式色谱柱固定相的合成、应用及其分离机制的研究对高效液相色谱具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题在于提供一种碳量子点键合硅胶色谱固定相。
4.本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的制备方法。
5.本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的应用。
6.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
7.一种碳量子点键合硅胶色谱固定相，包含硅球，以及在硅球表面修饰的硅烷偶联剂和碳量子点。
8.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相，为十八胺与丝氨酸衍生化碳量子点修饰的多孔硅胶sil-ser-ocds。
9.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相，是由下述方法获得的：
10.(1)十八胺和丝氨酸溶于乙醇中，混合，加热合成碳量子点ser-ocds；
11.(2)在氮气或氩气的保护下，将异氰酸基硅烷偶联剂与硅胶在有机溶剂中混匀，在100-150℃下加热搅拌12-48h，反应得到硅烷化硅胶；
12.(3)向步骤(2)中得到的产物硅烷化硅胶中加入碳量子点，在80-150℃下搅拌反应4-8h，反应产物用有机溶剂洗涤，干燥，得到碳量子点键合硅胶固定相，即sil-ser-ocds。
13.上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的制备方法，具体步骤如下：
14.(1)将十八胺和丝氨酸溶于色谱级乙醇中，混合，加热合成碳量子点ser-ocds，冷却至室温后将其离心，使用0.22μm滤膜过滤后，在-80℃下冻干20-50h；其中，所述十八胺、丝氨酸及色谱级乙醇的投料比按g/g/ml计为3.2-8.5：2.5-7.0：15-50；
15.(2)在氮气或氩气的保护下，将异氰酸基硅烷偶联剂与硅胶在甲苯、二甲苯或二氯
乙烷中混匀，在100-150℃下加热搅拌12-48h，洗涤干燥，得到硅烷化硅胶；其中，异氰酸基硅烷偶联剂与硅胶的质量比为1-1.5：1；
16.(3)向步骤(2)中得到的产物硅烷化硅胶中加入碳量子点，使氮气或氩气充满反应体系，在80-150℃下搅拌反应4-8h，反应产物用有机溶剂洗涤，干燥，得到碳量子点键合硅胶色谱固定相，即sil-ser-ocds；其中，所述硅烷化硅胶与碳量子点的质量比为5：1-4。
17.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的制备方法，所述步骤(1)中混合的方式为超声2分钟，和/或将混合液加入聚四氟乙烯内胆高压反应釜中。
18.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的制备方法，所述步骤(1)中加热条件为100-200℃，加热时间为4-12h。
19.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的制备方法，所述步骤(2)中洗涤所用溶剂为甲苯、二甲苯、n-n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯乙烷中的一种或多种。
20.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的制备方法，所述步骤(2)中异氰酸基硅烷偶联剂作为碳量子点与硅胶之间的“桥梁”，所述异氰酸基硅烷偶联剂为四异氰酸基硅烷、异氰酸丙基三乙氧基硅烷或异氰酸丙基三甲氧基硅烷。
21.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的制备方法，所述步骤(3)中有机溶剂(作为洗涤溶剂)为甲苯、n-n-二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或无水乙醇中的一种或多种。
22.上述碳量子点键合硅胶色谱固定相在高效液相色谱柱中对疏水与亲水性化合物进行分离的应用。
23.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的应用，作为填料装填的色谱柱中快速分离烷基苯类、多环芳烃类、核苷碱基类和磺胺类抗生素等疏水与亲水性物质。
24.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的应用，作为填料在反相色谱模式下，该色谱柱对烷基苯类和多环芳烃类化合物有较高的柱效和选择性；在亲水色谱模式下，对亲水性化合物核苷类、碱基类和磺胺类化合物能够实现有快速的有效分离，这弥补了传统c18色谱柱对于亲水性化合物保留效果较差的不足。
25.优选的，上述碳量子点键合硅胶色谱固定相的应用，分离过程中采用乙腈作为流动相，随着乙腈比例的增加，log k值呈线性增加。
26.有益效果：
27.上述碳量子点键合硅胶色谱固定相，十八胺与丝氨酸衍生化碳量子点中存在烷基链、羟基、羧基和氨基等极性和非极性基团，这使得混合模式液相色谱固定相sil-ser-ocds存在疏水和亲水作用，具有rplc/hilic两种模式，丰富了混合模式液相色谱固定相的种类。混合模式液相色谱固定相sil-ser-ocds稳定性强，可用于烷基苯类、多环芳烃类、磺胺类、核苷碱基类化合物等多种化合物的分离。
28.将该固定相填装于色谱柱，能够弥补单一保留机理的液相色谱在复杂样品分析的不足，具有较高的稳定性，原料来源广泛且低廉，分离速度快，分离选择性高，对于烷基苯、多环芳烃、核苷碱基类和磺胺类抗生素等物质具有出色的分离效果。
附图说明
29.图1为本发明中碳量子点键合硅胶固定相sil-ser-ocds的制备流程图。
30.图2为碳量子点ser-ocds的透射电镜图(a),平均粒径图(b)，全扫描xps光谱(c)以
及c1s(d)、n 1s(e)、o 1s(f)的高分辨率xps光谱图。
31.图3为裸硅胶(a)与sil-ser-ocds(b)的扫描电镜图。
32.图4为ser-ocds与sil-ser-ocds的红外图谱。
33.图5为固定相sil-ser-ocds的热重曲线。
34.图6为ser-ocds和sil-ser-ocds的接触角实验分析结果。
35.图7为碳量子点键合硅胶sil-ser-ocds色谱柱的硅羟基活性测试，出峰顺序依次为苯胺，苯酚，甲苯和乙苯。
36.图8为五种烷基苯类化合物(依次为甲苯，乙苯，丙苯，正丁苯和正戊苯)在(a)商用c18色谱柱和(b)碳量子点键合硅胶sil-ser-ocds色谱柱上的分离色谱图。
37.图9为在流动相中分别含有55％，60％和65％甲醇时，烷基苯中亚甲基数目对保留因子(k)的对数的影响。
38.图10为多环芳烃类化合物(依次为萘，芴，蒽和三联苯)在(a)商用c18色谱柱和(b)碳量子点键合硅胶sil-ser-ocds色谱柱上的分离色谱图。
39.图11为流动相中乙腈的含量对可可碱，腺嘌呤和胞嘧啶log k值的影响。
40.图12为五种核苷碱基类化合物(依次为胸腺嘧啶，尿苷，腺苷，胞苷和胞嘧啶)在(a)商用c18色谱柱和(b)碳量子点键合硅胶sil-ser-ocds色谱柱上的分离色谱图。
41.图13为流动相中乙腈比例对五种核苷碱基类化合物(胸腺嘧啶，尿苷，腺苷，胞苷和胞嘧啶)保留因子(k)的对数的影响。
42.图14为四种磺胺类化合物(依次为磺胺醋酰，磺胺嘧啶，磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶)在(a)商用c18色谱柱和(b)碳量子点键合硅胶sil-ser-ocds色谱柱上的分离色谱图。
43.图15为不同浓度的缓冲盐对四种磺胺类化合物保留效果的影响。
44.图16为柱温对核苷碱基类化合物(依次为胸腺嘧啶，胸苷，腺苷和腺嘌呤)保留效果的影响。
45.图17为sil-ser-ocds色谱柱的稳定性。
具体实施方式
46.实施例1
47.制备碳量子点键合硅胶色谱固定相，是一种十八胺与与丝氨酸衍生化碳量子点键合硅胶的色谱柱填料，为混合模式色谱固定相，其制备过程如图1所示：
48.1、碳量子点ser-ocds的合成
49.如图1-a所示，将5克十八胺和7克丝氨酸溶于20ml色谱乙醇中，然后将其转移至密封的聚四氟乙烯内胆高压釜中，在120℃下加热4h。然后将混合物取出，使用离心机在3500rpm的转速下，离心10min，取上清，得到棕黄色液体，通过0.22μm有机微孔滤膜过滤后，最后在-80℃下进行冷冻干燥24h得到纯化的ser-ocds。
50.2、sil-ser-ocds的合成
51.为了使碳点与硅胶键合，需要先除去硅胶中的结晶水。首先称取3g硅胶置于250ml圆底烧瓶中，加入80ml甲苯，加热，冷凝回流4h。过滤，放入烘箱，在120℃下，干燥4h。随后，如图1-b和1-c所示，向除水后的硅胶中加入5g异氰酸丙基三乙氧基硅烷和100ml甲苯，在氩
气的保护下，加热12h,其温度为100℃。之后分别用甲苯和n-n-二甲基甲酰胺进行洗涤，连续洗涤3次，80℃下干燥8h，得到硅烷化硅胶ser-ipts。接下来，称取5g sil-ipts和1g ser-ocds，加入100ml甲苯，在n2氛围下，加热温度130℃，冷凝回流7h，用甲苯、n-n-二甲基甲酰胺和丙酮各分别洗涤3次，放入100℃烘箱中，干燥4h，最终合成色谱填料sil-ser-ocds。
52.实施例2
53.称取3.2克十八胺和2.5克丝氨酸溶于15ml色谱乙醇中，然后将其转移至密封的聚四氟乙烯内胆高压釜中，在100℃下加热12h。使用离心机在3500rpm的转速下，将得到的产物离心10min，取上清，得到棕黄色液体，通过0.22μm有机微孔滤膜过滤后，最后在-80℃下进行冷冻干燥24h得到纯化的ser-ocds。
54.然后称取3g硅胶和3g异氰酸丙基三乙氧基硅烷，加入100ml甲苯，在氮气的保护下，加热48h,其温度为150℃。之后分别用甲苯和四氢呋喃进行洗涤，连续洗涤3次后，80℃下干燥8h，得到硅烷化硅胶ser-ipts。接着，将5g sil-ipts和4g ser-ocds，加入100ml甲苯中，在n2氛围下，加热温度150℃，冷凝回流4h。反应结束后，用甲苯、n-n-二甲基甲酰胺和甲醇各分别洗涤3次，100℃下干燥4h，最终合成色谱固定相sil-ser-ocds。
55.实施例3
56.为了合成碳量子点ser-ocds，首先称取8.5克十八胺和7.0克丝氨酸溶于50ml色谱乙醇中，然后将其转移至密封的聚四氟乙烯内胆高压釜中，在200℃下加热4h。然后在3500rpm的转速下，将得到的混合溶液离心10min，取上清，得到棕黄色液体，通过0.22μm有机微孔滤膜过滤后，最后在-80℃下进行冷冻干燥50h得到纯化的ser-ocds。
57.接着称取3g硅胶和4.5g异氰酸丙基三乙氧基硅烷，溶于100ml甲苯中。通入氮气，在100℃下，加热搅拌12h。分别用甲苯和n-n-二甲基甲酰胺对产物连续洗涤3次后，80℃下干燥8h，得到ser-ipts。然后称取5g sil-ipts和4g ser-ocds，加入100ml甲苯，在n2保护下，加热温度为80℃，反应时间为8h。之后用甲苯和无水乙醇各分别洗涤3次，100℃下干燥4h，得到固定相sil-ser-ocds。
58.实施例4
59.对实施例1合成的碳量子点键合硅胶色谱填料sil-ser-ocds进行表征，包括透射电子显微镜，扫描电子显微镜，比表面积测试，傅立叶红外光谱，x射线光电子能谱，接触角实验，热重分析以及元素分析以验证其是否成功合成，探究填料的特征性质。
60.如图2-a与图2-b所示，使用透射电镜(tem)对ser-ocds的形貌和尺寸进行表征。ser-ocds呈类球形，在水溶液中分散良好，自然光下为棕黄色，紫外灯照射下发出蓝色荧光，其直径在3-6nm之间，平均粒径约为4.3nm。通过x-射线光电子能谱(xps)对ser-ocds的化学结构和元素组成进行分析。在ser-ocds的xps谱图(图2-c)中，三个特征峰分别对应于c1s、n 1s和o1s。c 1s高分辨xps谱图(图2-d)在284和285.1ev存在三个峰，分别对应于c-c,c-n/c-o。n 1s谱图(图2-e)中397.9ev的峰可归属于c-n。在图2-f中观察到，o 1s的高分辨率能谱在531.6和532处有两个明显的峰，表明存在c-o和c＝o基团。硅胶的形貌为表面光滑的均一球体，利用扫描电镜(sem)，通过对比其被改性前后的形貌变化而说明固定相材料的修饰情况。如图3所示，裸硅胶表面光滑无修饰物，当被ser-ocds修饰后，硅球表面变得粗糙并出现了一些小团簇，因此，表明ser-ocds与ser-ocds改性硅胶成功合成。
61.通过ft-ir光谱(图4)深入探究ser-ocds与sil-ser-ocds的表面基团，在ser-ocds
的ft-ir图中，3340cm-1
处吸收峰归属于o-h的伸缩振动。1670cm-1
处的吸收峰归属于羧基中c＝o的伸缩振动。1570cm-1
处的峰对应于n-h的变形振动，2850/2920cm-1
位置的吸收峰分别属于c-h键的对称和不对称伸缩峰。谱图中出现722cm-1
处峰，证明在ser-ocds中亚甲基的数量至少为4。sil-ser-ocds谱图中，1100cm-1
处的吸收峰则为si-o键的伸缩振动，2940/2860cm-1
依然是来自于c-h键，1680cm-1
和3650cm-1
的峰分别归属于c＝o和n-h的伸缩振动，这表明ser-ocds被修饰到了硅胶上，推测为羟基与sil-ipts中的异氰酸酯基反应。基于以上分析，证明成功制备了带有烷基链、羧基、羟基和氨基等官能团的ser-ocds与sil-ser-ocds固定相。
62.分析图5描述的热重分析曲线(tga)，发现在250℃以下，sil-ser-ocds固定相的质量损失非常低，这表明sil-ser-ocds基质的热稳定性很高。有机元素分析法(ea)，可以通过测量有机材料的c，h，n等元素的含量来揭示所合成材料的性质变化。如表1所示，结果表明，ser-ocds中含有大量的c元素，sil-ipts中c和n元素含量为5.35％和1.48％，而最终的固定相填料sil-ser-ocds中c和n的含量增加到7.27％和1.52％，表明ser-ocds已成功键合到sil-ipts上。此外，通过接触角实验(ca)测量制备的固定相对水的润湿性。如图6所示，测试结果表明，ser-ocds，sil-ipts和sil-ser-ocds的接触角分别为92.1
°
，54.5
°
和85.8
°
，这表明sil-ser-ocds固定相可能拥有亲水和疏水两种性质。表2列出了该sil-ser-ocds固定相的比表面积测试bet数据，当ser-ocds修饰到了硅胶上后，其比表面积，孔容和孔径均减小，这表明硅胶的表面形态已经发生改变，推测这些功能化基团不仅包覆在硅球表面，纳米级的ser-ocds也进入了硅胶的多孔通道。
63.表1 ser-ocds，sil-ipts和sil-ser-ocds的元素分析结果
[0064][0065]
表2 ser-ocds和sil-ser-ocds的比表面积，孔容和孔径
[0066][0067]
实施例5
[0068]
研究所合成的十八胺与丝氨酸衍生化碳量子点键合硅胶色谱固定相在高效液相色谱柱中的应用。将合成的色谱填料sil-ser-ocds溶于四氢呋喃中，以甲醇为推进剂将浆液装于不锈钢柱中。
[0069]
1、硅羟基的活性测试实验
[0070]
选取甲醇/水(30/70,v/v)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃，得到色谱图如图7所示(其中1为苯胺，2为苯酚，3为甲苯，4为乙苯)。由于苯胺先于苯酚被洗脱下来，这表明还大部分硅醇基被完全遮盖。但由于烷基链的存在，固定相依然具备较强的疏水选择性。
[0071]
2、考察烷基苯类化合物在固定相上的保留机制
[0072]
选取甲醇/水(45/55，v/v)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃，得到色谱图如图8-b所示(1甲苯，2乙苯，3丙苯，4正丁苯和5正戊苯),同时选用商用c18色谱柱进行对比(图8-a)。根据这几种烷基苯的峰形，分离程度和保留时间，证明烷基苯类化合物在sil-ser-ocds色谱柱上峰形更好，柱效更高。
[0073]
在流动相中甲醇的比例分别为55％，60％和65％时，探究烷基苯中亚甲基数目对保留因子(k)的对数的影响，如图9所示，保留因子k的对数随着亚甲基数量的增加而线性增加，为典型的反相保留模式，证明sil-ser-ocds色谱柱具有和c18相似的保留行为。
[0074]
3、考察多环芳烃类化合物在固定相上的保留机制
[0075]
选取乙腈/水(55/45,v/v)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃，得到色谱图如图10-b所示(1萘，2芴，3蒽，4三联苯),同时选用商用c18色谱柱进行对比(图10-a)。多环芳烃类化合物在两种色谱柱上均能完全分离且峰形良好，但是sil-ser-ocds色谱柱完全分离更快，节约检测成本。
[0076]
4、考察sil-ser-ocds固定相在反相和亲水模式下的保留规律
[0077]
以可可碱、腺嘌呤和胞嘧啶为例，选取乙腈/水为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃。探究流动相中乙腈的含量对可可碱，腺嘌呤和胞嘧啶log k值的影响。如图11所示，曲线呈u型，在乙腈含量为50-60％范围内均出现最低值，这也表明该固定相在不同流动相条件下可以提供亲水和疏水双重作用。
[0078]
5、考察核苷碱基类化合物在固定相上的保留机制
[0079]
选取乙腈/水(97/3,v/v)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃，得到色谱图如图12-b所示(1胸腺嘧啶，2尿苷，3腺苷，4胞苷，5胞嘧啶),同时选用商用c18色谱柱进行对比(图12-a)。这几种强极性化合物可以在sil-ser-ocds色谱柱上实现良好分离，而在c18色谱柱上保留效果非常差。另外研究了流动相中乙腈比例对核苷碱基类化合物保留因子(k)的对数的影响，如图13所示，随着乙腈比例的增加，log k值也呈线性增加，这为典型的hilic保留模式，表明sil-ser-ocds色谱柱具有亲水作用，弥补了传统c18色谱柱的不足。
[0080]
6、考察磺胺类化合物在固定相上的保留机制
[0081]
选取乙腈/10mm乙酸铵水溶液(30/70，v/v,)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃，得到色谱图如图14-b所示(1磺胺醋酰，2磺胺嘧啶，3磺胺甲基嘧啶，4磺胺二甲基嘧啶)，同时选用商用c18色谱柱进行对比(图14-a)。结果表明sil-ser-ocds色谱柱对磺胺类抗生素可以完全分离，而传统c18色谱柱则出现前延和拖尾等问题。
[0082]
实施例6
[0083]
研究该混合模式下，流动相中缓冲盐浓度与柱温对合成的sil-ser-ocds色谱柱保留效果的影响。
[0084]
1、流动相中缓冲盐浓度的影响
[0085]
选取乙腈/乙酸铵水溶液(30/70，v/v,)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃，探究乙酸铵缓冲盐浓度(分别为30mm，40mm，50mm，60mm，70mm)对四种磺胺类抗生素的log k值的影响。通过观察流动相中盐含量的增加，log k的增大或减小可以验证固定相与分析物之间的离子作用为静电排斥或静电吸附。由图15可知，磺胺类化合物与固定相sil-ser-ocds之间的作用为静电排斥占主导，而盐的增加，减弱了这一离子作用。
[0086]
2、柱温的影响
[0087]
选取乙腈/水(30/70，v/v,)为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm，考察柱温在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃时，sil-ser-ocds色谱柱对胸腺嘧啶，胸苷，腺苷和腺嘌呤保留效果的影响，并使用范特霍夫方程(如下)深入探究其机理。如图16所示，ln k与温度1/t呈线性关系，这证明焓变和熵变值保持恒定，保留机制没有因为温度的改变而发生变化。同时，如表3所示，相关系数r2均大于0.98，四种核苷碱基的焓变均为负值，这证明其从流动相至固定相的过程为放热过程，且随柱温的增加，分析物的保留减弱。
[0088][0089]
表3范特霍夫方程计算得出的线性相关系数及δh参数
[0090][0091]
实施例7
[0092]
为了评价该sil-ser-ocds色谱柱的稳定性，监测多环芳烃类化合物萘，芴，蒽和三联苯在连续进样10次后，保留时间的波动情况，并用rsd(％)值进行评价。色谱条件为：乙腈/水(55/45,v/v)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为254nm，柱温为25℃。如图17所示，保留时间无明显变化，通过计算四种分析物的rsd分别为0.166％，0.171％，0.187％和0.210％，因此证明sil-ser-ocds色谱柱具有极好的稳定性。
[0093]
综上所述，通过研究流动相中乙腈比例对五种核苷碱基类化合物(胸腺嘧啶，尿苷，腺苷，胞苷和胞嘧啶)log k值的影响，发现随着乙腈比例的增加，log k值也呈线性增加，表明sil-ser-ocds色谱柱具有典型的亲水保留模式。
[0094]
通过研究缓冲盐的浓度以及柱温对保留时间的影响，结合范特霍夫方程，说明本色谱柱存在氢键，π-π共轭，静电排斥，分配作用以及疏水作用在内的多重保留机制。
[0095]
对五种烷基苯类化合物(甲苯，乙苯，丙苯，正丁苯和正戊苯)在sil-ser-ocds色谱柱上的色谱分离结果进行分析，五种化合物的理论塔板数均高于8700，尤其正丁苯的理论塔板数甚至高达124024，这表明sil-ser-ocds色谱柱具有超高柱效。
[0096]
通过监测多环芳烃类化合物萘，芴，蒽和三联苯在连续进样10次后，保留时间的波动情况，评价该sil-ser-ocds色谱柱的稳定性，并用rsd(％)值进行评价。发现保留时间无明显变化，通过计算四种分析物的rsd分别为0.166％，0.171％，0.187％和0.210％，因此证明sil-ser-ocds色谱柱具有极好的稳定性。
[0097]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。