一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒及方法与流程

一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒及方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒及方法。


背景技术：

2.80％的前列腺癌患者是65岁以上的男性，严重地威胁了男性的健康。前列腺癌全球范围内是男性中发病率第六位的的实体肿瘤，死亡率居第九位，在美国，前列腺癌尤为常见，而在亚洲国家发病率却不高，但近年来随着社会老龄化有逐年升高的趋势，据统计，2018年有近130万的新发病例和35.9万的死亡病例，前列腺特异性抗原(psa)等生物学标志物作为诊断前列腺癌的应用最广的早期诊断标准，有效的降低了前列癌的死亡率，所以前列腺癌诊疗的发展将越来越重要，随着科技的不断发展，人们对于前列腺癌pca3分数检测的试剂盒的制造工艺要求也越来越高。
3.现有的前列腺癌pca3分数检测的试剂盒在使用时存在一定的弊端，虽然psa在前列腺特异表达但并不是在前列腺癌中特异表达，并且还存在4～10ng/ml的灰区，不能区分前列腺癌与前列腺炎、良性前列腺增生，因此在诊断前列腺癌中需要更多的生物学标志物，如前列癌筛查诊断阶段，需要敏感度及特异性更高的生物学标志物来鉴别患者以导向更为明确的诊断及后续措施，对于活检证实的前列腺癌患者，需要生物学标志物来进行分级以指导手术或系统性治疗；对于前列腺癌长期管理患者，需要生物学标志物监测疾病进程并辅助系统性治疗决策，同时各类组学技术的发展，使得更多的候选标志物出现，前列腺癌基因3(pca3)是一种尿检分子标志物，是前列腺特异性蛋白，在其他组织及肿瘤中均不表达，但在前列腺肿瘤细胞上过度表达，相比于psa能更好地区分前列腺癌与前列腺炎、良性前列腺增生，与psa不同，pca3与前列腺大小及5-α还原酶抑制剂的使用也无关，pca3大于60，前列腺癌可能性上升，小于20可以作为阴性排查，有助于临床上前列腺癌症病人的早期诊断，用于指导治疗决策并加速前列腺癌精准医学的发展，为此，我们提出一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒及方法。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒及方法，进一步提高前列腺癌pca3基因检测试剂盒的稳定性、灵敏度、准确度等性能，可以有效解决背景技术中的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒，包括引物、探针、荧光定量反应预混液、阳性对照与空白对照，所述引物核苷酸序列如下所示：
8.pca3-f：5'-ggtgggaaggacctgatgatac-3'；
9.pca3-r：5'-gggcgaggctcatcgat-3'；
10.所述探针的核苷酸序列如下所示：
11.pca3-fam-p：5'-agaaatgcccggccgccatc-3'。
12.作为本技术一种优选的技术方案，所述探针5'标记的荧光基团为fam、vic、texas red中的至少一种，探针3'标记的淬灭基团为tamra、bhq中的至少一种。
13.一种前列腺癌pca3分数检测的方法，包括以下操作步骤：
14.s1：使用商业化rna保存液保存样品；
15.s2：trizol法提取样品的rna；
16.s3：以提取样品的rna为模板，将rna逆转录为cdna；
17.s4：用pca3-f、pca3-r、探针、psa内参基因引物psa-f、psa-r以及psa内参基因探针psa-fam-p进行定量pcr扩增反应获得扩增产物；
18.s5：对扩增产物进行扩增曲线分析，得到基因的ct值，并代入公式得到pca3分数＝2^[ct(psa)-ct(pca3)]
×
100；
[0019]
s6：若pca3分数若大于31说明pca3基因上调表达，若pca3分数若低于31说明pca3基因下调表达；若pca3分数若等于31说明pca3基因正常表达。
[0020]
作为本技术一种优选的技术方案，所述s1步骤中样本采集的具体方案和操作为：
[0021]
a1：选取男性前列腺癌患者(实验组)和男性非前列腺癌患者(对照组，镜下白细胞》10)的尿液，每个收集10ml；
[0022]
a2：3500rpm离心10min后收集细胞/沉渣，弃去上清；
[0023]
a3：将细胞/沉渣等用pbs洗涤一次，离心后弃去上清；
[0024]
a4：再用少量的pbs重悬，然后加入2倍体积(～1ml)的rna followall保存溶液，装入2ml离心管中；
[0025]
a5：在4℃环境下可保存和运输1个月。
[0026]
作为本技术一种优选的技术方案，所述s2步骤中rna提取的具体操作为：
[0027]
b1：用冰冷的pbs轻轻漂洗细胞单层(两次)；
[0028]
b2：加入1ml trizol裂解细胞为均质样品，室温孵育5min；
[0029]
b3：反复吸打，收集到rnase free tube中；
[0030]
b4：加入200ul的氯仿，votex 15s；
[0031]
b5：室温孵育3min；
[0032]
b6：4℃12000g转15min(可适当延长)；
[0033]
b7：吸取上层液500ul加入一个新的tube中；
[0034]
b8：加入500ul的异丙醇混匀；
[0035]
b9：孵育10min在室温4℃12000g离心10min；
[0036]
b10：吸走上清液，加入1ml 75％乙醇洗一下(votex 10s)；
[0037]
b11：4℃7500g离心5min，弃去酒精；
[0038]
b12：重复洗一下，尽可能吸干净，后37℃放置30min让酒精和水挥发干净，晾干rna；
[0039]
b13：depc水20ul(细胞房分装depc水)(测浓度尽可能使浓度集中在500-1000ng/ul)，反复吸打或votex 10s或37℃孵育10min,溶解沉淀块，-80℃保存。
[0040]
作为本技术一种优选的技术方案，所述s3步骤中逆转录的具体操作为：
[0041]
c1：配制逆转录体系(在冰上进行)；
[0042]
c2：轻柔混匀后进行逆转录反应，条件如下：37℃15min，85℃5sec，4℃。
[0043]
作为本技术一种优选的技术方案，所述s4步骤中psa内参基因引物核苷酸序列为：psa-f：agaagcattcccaaccctgg；
[0044]
psa-r：gcaagatcacgcttttgttcct。
[0045]
作为本技术一种优选的技术方案，所述s4步骤中用2xtaq pcr mix产品，以逆转录的cdna为模板扩增，反应体系为25μl，反应结束后，取5μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0046]
(三)有益效果
[0047]
与现有技术相比，本发明提供了一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒及方法，具备以下有益效果：该一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒及方法，进一步提高前列腺癌pca3基因检测试剂盒的稳定性、灵敏度、准确度等性能，包括引物、探针、荧光定量反应预混液、阳性对照与空白对照，使用商业化rna保存液保存样品，trizol法提取样品的rna，以提取样品的rna为模板，将rna逆转录为cdna，用pca3-f、pca3-r、探针、psa内参基因引物psa-f、psa-r以及psa内参基因探针psa-fam-p进行定量pcr扩增反应获得扩增产物，对扩增产物进行扩增曲线分析，得到基因的ct值，并代入公式得到pca3分数＝2^[ct(psa)-ct(pca3)]
×
100，若pca3分数若大于31说明pca3基因上调表达，若pca3分数若低于31说明pca3基因下调表达；若pca3分数若等于31说明pca3基因正常表达，整个前列腺癌pca3分数检测的试剂盒结构简单，操作方便，使用的效果相对于传统方式更好。
附图说明
[0048]
图1为本发明一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒及方法的细胞系pca3、psa表达扩增曲线示意图。
具体实施方式
[0049]
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0050]
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0051]
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可
以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0052]
如图1所示，一种前列腺癌pca3分数检测的试剂盒，包括引物、探针、荧光定量反应预混液、阳性对照与空白对照，引物核苷酸序列如下所示：
[0053]
pca3-f：5'-ggtgggaaggacctgatgatac-3'；
[0054]
pca3-r：5'-gggcgaggctcatcgat-3'；
[0055]
探针的核苷酸序列如下所示：
[0056]
pca3-fam-p：5'-agaaatgcccggccgccatc-3'。
[0057]
进一步的，探针5'标记的荧光基团为fam、vic、texas red中的至少一种，探针3'标记的淬灭基团为tamra、bhq中的至少一种。
[0058]
一种前列腺癌pca3分数检测的方法，包括以下操作步骤：
[0059]
s1：使用商业化rna保存液保存样品；
[0060]
s2：trizol法提取样品的rna；
[0061]
s3：以提取样品的rna为模板，将rna逆转录为cdna；
[0062]
s4：用pca3-f、pca3-r、探针、psa内参基因引物psa-f、psa-r以及psa内参基因探针psa-fam-p进行定量pcr扩增反应获得扩增产物；
[0063]
s5：对扩增产物进行扩增曲线分析，得到基因的ct值，并代入公式得到pca3分数＝2^[ct(psa)-ct(pca3)]
×
100；
[0064]
s6：若pca3分数若大于31说明pca3基因上调表达，若pca3分数若低于31说明pca3基因下调表达；若pca3分数若等于31说明pca3基因正常表达。
[0065]
进一步的，s1步骤中样本采集的具体方案和操作为：
[0066]
a1：选取男性前列腺癌患者(实验组)和男性非前列腺癌患者(对照组，镜下白细胞》10)的尿液，每个收集10ml；
[0067]
a2：3500rpm离心10min后收集细胞/沉渣，弃去上清；
[0068]
a3：将细胞/沉渣等用pbs洗涤一次，离心后弃去上清；
[0069]
a4：再用少量的pbs重悬，然后加入2倍体积(～1ml)的rna followall保存溶液，装入2ml离心管中；
[0070]
a5：在4℃环境下可保存和运输1个月。
[0071]
进一步的，s2步骤中rna提取的具体操作为：
[0072]
b1：用冰冷的pbs轻轻漂洗细胞单层(两次)；
[0073]
b2：加入1ml trizol裂解细胞为均质样品，室温孵育5min；
[0074]
b3：反复吸打，收集到rnase free tube中；
[0075]
b4：加入200ul的氯仿，votex 15s；
[0076]
b5：室温孵育3min；
[0077]
b6：4℃12000g转15min(可适当延长)；
[0078]
b7：吸取上层液500ul加入一个新的tube中；
[0079]
b8：加入500ul的异丙醇混匀；
[0080]
b9：孵育10min在室温4℃12000g离心10min；
[0081]
b10：吸走上清液，加入1ml 75％乙醇洗一下(votex 10s)；
[0082]
b11：4℃7500g离心5min，弃去酒精；
[0083]
b12：重复洗一下，尽可能吸干净，后37℃放置30min让酒精和水挥发干净，晾干rna；
[0084]
b13：depc水20ul(细胞房分装depc水)(测浓度尽可能使浓度集中在500-1000ng/ul)，反复吸打或votex 10s或37℃孵育10min,溶解沉淀块，-80℃保存。
[0085]
进一步的，s3步骤中逆转录的具体操作为：
[0086]
c1：配制逆转录体系(在冰上进行)；
[0087]
c2：轻柔混匀后进行逆转录反应，条件如下：37℃15min，85℃5sec，4℃。
[0088]
进一步的，s4步骤中psa内参基因引物核苷酸序列为：psa-f：agaagcattcccaaccctgg；
[0089]
psa-r：gcaagatcacgcttttgttcct。
[0090]
进一步的，s4步骤中用2xtaq pcr mix产品，以逆转录的cdna为模板扩增，反应体系为25μl，反应结束后，取5μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0091]
实施例：
[0092]
临床标本
[0093]
尿液标本
[0094]
1.选取男性前列腺癌患者(实验组)和男性非前列腺癌患者(对照组，镜下白细胞》10)的尿液，每个收集10ml；
[0095]
2.3500rpm离心10min收集细胞/沉渣，弃去上清；
[0096]
3.将细胞/沉渣等用pbs洗涤一次；
[0097]
4.用少量的pbs重悬细胞/沉渣至新的1.5ml无rnase的ep管中，即可立即用来抽提rna；或加入2倍体积的rna保存液[1]进行保存。
[0098]
注：
[0099]
[1]rna保存液说明：rnafollowall(组织rna、蛋白质和dna保存液)是一种液体的，安全无毒的组织保存制剂，其可迅速渗入到组织内，稳定和保护细胞的rna、蛋白质和dna于原位。组织样品在rnafollowall中保存，不会引起rna、蛋白质和dna的降解，可不用立即处理样品或将样品冷冻在液氮。保存在该试剂中的样品，可在室温保存1周，或-20℃/-80℃长期保存，且反复冻融不会显著影响其中rna、蛋白质和dna的品质。
[0100]
pca3阳性表达的细胞系
[0101]
1.细胞系名称：lncap clone fgc前列腺癌细胞系；
[0102]
2.pca3表达：阳性(ct值＜40)。扩增产物有3种，长度分别为427/262/127bp，主要为262bp；
[0103]
3.psa表达：阳性。扩增产物长度129bp。
[0104]
rna提取
[0105]
trizol法
[0106]
1.用冰冷的pbs轻轻漂洗细胞/沉渣(两次)；
[0107]
2.加入1ml trizol，剧烈摇晃，使样品均质，室温孵育5min；
[0108]
3.加入200ul的氯仿，votex 15s；
[0109]
4.孕育3min室温；
[0110]
5. 4℃12000g离心15min(可适当延长)；
[0111]
6.吸取上层液500ul加入一个新的无rnase ep管中；
[0112]
7.加入500ul的异丙醇混匀；
[0113]
8.室温孵育10min后，4℃12000g离心10min；
[0114]
9.吸去上清液，加入1ml 75％乙醇洗涤一遍(votex 10s)；
[0115]
10. 4℃7500g离心5min，吸去上清液；
[0116]
11.重复洗涤一次；
[0117]
12.尽可能吸去上清，37℃放置～30min让酒精和水挥发干净，晾干rna；
[0118]
13.用depc水20μl(使rna浓度集中在500-1000ng/μl)，反复吹打或votex 10s或37℃孵育10min，溶解沉淀块；
[0119]
14.根据厂家说明书，使用invitrogen qubit 4荧光计定量rna浓度；
[0120]
15.rna样本于-80'c保存。
[0121]
cdna逆转录
[0122]
根据厂家说明书，使用promega goscript
tm reverse transcription mix,random primers试剂盒进行逆转录，具体为：
[0123]
1.在冰上溶解逆转录试剂，轻柔混匀并快速离心，放冰上待用；
[0124]
2.对每个反应按下表配置10μl逆转录goscript
tm reverse transcription mix，轻柔混匀试剂。全程冰上操作；
[0125]
成分体积nuclease-free water4μlgoscript
tm reaction buffer,random primer4μlgoscript
tm enzyme mix2μl总体积10μl
[0126]
3.轻柔吹打混匀逆转录mix；
[0127]
4.对每个反应，在10μl逆转录mix中加入至多10μl rna样本，如下表所示。全程冰上操作；
[0128][0129]
5.轻柔吹打混匀，密封样本反应管/孔；
[0130]
6.按下表反应程序孵育样本管
[0131]
步骤温度时间循环数anneal primer25℃5minutes1cycleextension42℃60minutes1cycleinactivation70℃15minutes1cyclehold4℃∞1cycle
[0132]
7.反应产物保存于4℃可立即用于后续分析，或于
–
20℃长期保存。
[0133]
pca3和psa表达分析
[0134]
引物序列
[0135][0136]
普通pcr
[0137]
根据厂家说明书，使用tiangen 2xtaq pcr mix进行pcr扩增
[0138]
1.用2xtaq pcr mix产品，以逆转录的cdna为模板扩增，反应体系为25μl，按下表配置：
[0139][0140]
2.pcr反应循环的设置：
[0141][0142][0143]
3.结果检测：反应结束后，取5μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0144]
琼脂糖凝胶电泳
[0145]
1.配置电泳液：取一个干净的1l量杯，加入980ml ddh2o，再加入20ml 50x buffer，混匀配制成1l 1x buffer，待用；
[0146]
2.制备2％凝胶：称取2g琼脂糖放入一干净烧杯中，倒入100ml 1x buffer，多次加热使琼脂糖完全溶解(避免沸腾)，期间不停摇匀。加入10ul核酸染料并将溶液摇匀至均一状态。待溶液温度降至约50℃时，倒入凝胶板中，插入加样孔梳，冷却至凝固；
[0147]
3.将剩余的电泳液倒入电泳槽中，放入凝固的凝胶，电泳液面需没过凝胶；
[0148]
4.加样：将5μl pcr产物与1μl 6x loading buffer混匀后，加入凝胶加样孔中。同时加入dna marker；
[0149]
5.电泳：电压100v，电泳时间50min；
[0150]
6.计算机拍照并保存胶图。
[0151]
荧光定量pcr
[0152]
根据厂家说明书，使用tiangen fastfire qpcr premix(sybr green)进行real-time pcr扩增：
[0153]
1.在室温下溶解fastfire qpcr premix(如果保存在-20℃)，rox reference dye，模板，引物和rnase-free ddh2o，并彻底混匀。
[0154]
2.按下表进行real-time pcr反应液的配制，全程冰上操作
[0155][0156]
3.在abi 7500上按下表设置两步法pcr反应程序：
[0157][0158]
4.盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底；
[0159]
5.将反应体系置于荧光定量pcr仪中，开始反应；
[0160]
6.结果分析。
[0161]
pca3评分
[0162]
pca3评分计算公式为：pca3 mrna拷贝数/psa mrna拷贝数x1000＝2
ct(psa)-ct(pca3)
x1000。
[0163]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二(一号、二号)等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0164]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术
人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。