曲霉菌株Ⅳ-1-1及其在农药降解中的应用

曲霉菌株
ⅳ‑
1-1及其在农药降解中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种能够降解农药的菌株及其应用，具体涉及一种曲霉菌及其在降解敌草隆和吡虫啉中的应用。


背景技术：

2.敌草隆(diuron)是一种选择性除草剂，难溶于水，也不易溶于大多数有机溶剂，在空气中化学性质稳定，遇强酸强碱易被分解，对包括鱼类在内的水生生物有毒，被认为是一种潜在的水污染物。此外，敌草隆可引起人体肾脏疾病、溶血性贫血、代偿性造血和内分泌失调，被列为潜在致癌物，属于欧盟内分泌干扰优先排序的第2类。
3.吡虫啉(imidacloprid)是一种硝基亚甲基类内吸杀虫剂，作为最常用的新烟碱类农药，在蔬菜、水果中应用较多。然而吡虫啉较高的持久性也增加了其在食物中的残留风险，除此以外，吡虫啉等新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的急性毒性为高度或剧毒，且具有亚致死效应。
4.当前，我国对于农药残留的降解方法中，生物修复是一种环境友好、高效、快速、前景广阔的修复手段，非常适合对不同环境中的污染物进行修复。在生物修复中，利用微生物活性对有机污染物(如有机农药)进行修复和分解是环境修复中的有效手段。它可以将农药进行生物修复和分解，使其转化为简单无机物，并且具有安全、高效、快速、廉价、无二次污染的特点。而分离筛选出具有降解作用的菌株将有利于解决农药残留问题，提高农产品质量，促进农业发展。然而，目前降解敌草隆和吡虫啉的微生物菌种研究甚少。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明旨在提供一种对敌草隆和吡虫啉具有降解作用的菌株。该菌株能有效降解农药敌草隆和吡虫啉，为敌草隆和吡虫啉残留问题的解决奠定基础，能够改善土壤和水等的环境。
6.为实现上述目的，本发明提供了曲霉(aspergillus sp.)菌株iv-1-1，其具体保藏说明如下。
7.菌种名称：曲霉
8.拉丁名：aspergillus sp.
9.菌株编号：iv-1-1
10.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
11.保藏机构简称：cgmcc
12.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
13.保藏日期：2021年9月24日
14.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.23263
15.首先，本发明自敌草隆污染土壤中，通过梯度稀释、平板划线等方法，分离纯化出单一微生物菌株，用于后续筛选，将单一微生物菌株分别接种至培养基中，28℃，180r/min
摇床内振荡培养，此为实验组，并设置自身对照组和标准对照组。待菌株生长至对数生长期，分别向实验组以及标准对照组加入敌草隆和吡虫啉，浓度为50mg/l， 28℃，180r/min分别取样进行薄层分析观察其对农药的降解效果，选取具有降解效果的菌株编号为iv-1-1，作为下一步研究对象。
16.进一步地，本发明对于筛选出的菌株iv-1-1进行了形态学与分子生物学鉴定，具体包含：
17.1)形态学鉴定
18.将菌株iv-1-1分别接种到商用马丁培养基、马铃薯培养基、察氏培养基固体平板上28℃培养5d，观察其菌落形态。
19.2)分子生物学鉴定
20.提取菌株基因组dna，以提取的基因组为模板进行pcr扩增、测序。将菌株测得的its序列在ncbi数据库中利用blast进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用mage 7.0软件构建系统发育树及分析进化关系。其中，pcr扩增时所选用的引物为：
21.its1(5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3')；
22.its4(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')。
23.除此之外，本发明还进一步对iv-1-1的生长曲线，降解中间产物及降解能力进行了具体测定。
24.1)生长曲线测定
25.接种纯化的菌株iv-1-1于商用马丁真菌培养基中，设置3组平行，通过干重法测量生长曲线。
26.2)转化产物
27.利用hplc-q-tof对敌草隆和吡虫的降解产生的中间产物进行定性分析。
28.3)降解能力测定
29.通过在菌株iv-1-1中添加敌草隆、吡虫啉，并且定时取样，然后进行hplc-dad测定，通过敌草隆、吡虫啉的含量测定来确定iv-1-1 对敌草隆、吡虫啉的降解效率。
30.基于上述测定结果，本发明还提供了：
31.(1)所述菌株或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在降解敌草隆和吡虫啉中的应用。
32.(2)所述菌株或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在降低敌草隆和吡虫啉使用后的残留量中的应用。
33.(3)所述菌株或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在制备降解敌草隆和吡虫啉产品中的应用。
34.(4)降解敌草隆和吡虫啉的产品，包括所述菌株或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂。
35.基于上述技术方案，本发明筛选出的具有敌草隆、吡虫啉降解作用的曲霉aspergillus sp.iv-1-1，可用于农药敌草隆和吡虫啉的降解，有助于解决农业生产中敌草隆和吡虫啉残留的问题，同时提高了农产品质量安全。
附图说明
36.图1为曲霉菌株iv-1-1的菌落形态特征图。在图1中，a1是曲霉菌株
ⅳ‑
1-1在马丁培养基上培养5d的菌落形态图(正面)；a2是曲霉菌株
ⅳ‑
1-1在马丁培养基上培养5d的菌落形态图(反面)；b1是曲霉菌株
ⅳ‑
1-1在马铃薯培养基上培养5d的菌落形态图(正面)； b2是曲霉菌株
ⅳ‑
1-1在马铃薯培养基上培养5d的菌落形态图(反面)； c1是曲霉菌株
ⅳ‑
1-1在察氏培养基上培养5d的菌落形态图(正面)；c2是曲霉菌株
ⅳ‑
1-1在察氏培养基上培养5d的菌落形态图(反面)； d是曲霉菌株
ⅳ‑
1-1在光学显微镜下的形态图。
37.图2为曲霉菌株iv-1-1的its系统发育树。
38.图3为曲霉菌株iv-1-1的生长曲线图。
39.图4为曲霉菌株iv-1-1降解敌草隆液质图。
40.图5为曲霉菌株iv-1-1降解敌草隆产物1液质图。
41.图6为曲霉菌株iv-1-1降解敌草隆产物2液质图。
42.图7为曲霉菌株iv-1-1降解吡虫啉液质图。
43.图8为曲霉菌株iv-1-1降解吡虫啉产物1液质图。
44.图9为曲霉菌株iv-1-1降解吡虫啉产物2液质图。
45.图10为曲霉菌株iv-1-1对敌草隆的降解实验结果。
46.图11为曲霉菌株iv-1-1对吡虫啉的降解实验结果。
具体实施方式
47.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的解释说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
48.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
49.实施例1
50.本实施例为菌株iv-1-1的分离、纯化与筛选方法。
51.本实施例中所涉及的商用马丁培养基，其组分包括蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000ml，ph＝7.0。固体培养基：每1l加入15.0g琼脂粉。
52.1、菌株的分离与纯化
53.于2020年6月在位于宁夏回族自治区银川市西夏区一块枸杞田内采集农药污染土壤，其经度为106
°
08、纬度38
°
38。使用的农药种类为吡虫啉、敌草隆。具体试验步骤如下：
54.1)将土壤样品取1g于10ml无菌水中充分混匀
55.2)待溶液静置澄清后，取上清液采用梯度稀释法分别稀释至10-1
、 10-2
、10-3
、10-4
、10-5
等梯度。
56.3)均匀涂布于商用马丁固体培养基中，28℃培养。
57.4)平板划线分离法进行纯化，得到多个单一纯化微生物菌株。
58.2、敌草隆和吡虫啉降解菌的筛选
59.1)配置商用马丁液体培养基(不添加琼脂)，250ml三角瓶中含150ml培养基。
60.2)将单一纯化的多个菌株接种至培养基中，28℃，180r/min下摇床振荡培养至对数生长期。
61.3)分别加入浓度为50mg/l的底物敌草隆、吡虫啉，同条件培养至5d、7d、9d。
62.4)分别取样并进行薄层检测，分析结果。
63.同时，设置标准对照组：向等量液体培养基中分别加入敌草隆、吡虫啉(浓度为50mg/l)；自身对照组：将上述多个菌株接种至等量液体培养基，培养方法与上述培养方法相同，但不加入敌草隆、吡虫啉。
64.通过自身对照组排除菌的自身次级代谢干扰而影响薄层分析结果；标准对照组排出培养基对化合物敌草隆的干扰。根据薄层信息，观察不同菌对农药敌草隆和吡虫啉的降解，选取降解效果明显的菌株作为下一步研究对象。获得一株对敌草隆和吡虫啉具有降解效果的菌株，编号为iv-1-1。
65.实施例2
66.本实施例为菌株iv-1-1的鉴定，包括菌落形态与菌株分子生物学鉴定方法。
67.本实施例中所涉及的马铃薯培养基，其组分包括马铃薯浸出粉 12.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，ph 5.6
±
0.2。察氏培养基，其组分包括硝酸钠3.0g、磷酸氢二钾1.0g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30.0g、琼脂15.0g，蒸馏水 1000ml。马丁培养基其组分同实施例1。
68.1、菌落形态的鉴定
69.将实施例1中筛选得到的菌株iv-1-1接种于马丁、马铃薯、察氏培养基上，于28℃下培养5d，观察菌落形态，并利用插片法观察菌株在光学显微镜下的形态如附图1。
70.经观察发现，菌株iv-1-1在商用马丁培养基上，生长速度快，菌落为黄色粉末状同心圆形，干燥，中心有褶皱凸起，边缘平整，菌落背面呈同心圆形，中间有褶皱，颜色发黄，生长5d时菌落直径可达60mm。在马铃薯培养基上，生长速度较快，菌落呈黄色粉末褶皱状圆形，干燥，菌落边缘平整呈白色，菌落背面颜色暗黄，生长5d时菌落直径可达61.3mm。在察氏培养基上，生长速度较快，菌落呈黄色粉末同心圆形，干燥，菌落边缘平整，颜色较浅，菌落背面颜色暗黄，生长5d时菌落直径可达56.7mm。在显微镜下，营养菌丝有分隔，气生菌丝部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端膨大，表面有成串的分生孢子。
71.2、分子生物学鉴定
72.1)将iv-1-1菌株接入液体商用马丁培养基中，28℃，180r/min，摇床培养3d。
73.2)离心后取少量菌体，《真菌基因组dna提取试剂盒》(无锡百泰克生物技术有限公司，货号：b004009020)提取iv-1-1基因组 dna，提取步骤参照真菌基因组dna提取试剂盒说明书。
74.3)以iv-1-1基因组dna为模板，采用引物its1和its4进行 pcr扩增。
75.选用真菌引物序列如下：
76.its1(5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3')；
77.its4(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')。
78.pcr扩增反应体系(50μl)包括：5
×
buffer 10μl；dntp 4μl；正向引物(10μm)1μl；反向引物(10μm)1μl；prime star 0.5 μl；模板(1μm)1μl；ddh2o 32.5μl。
79.pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min。
80.4)将扩增产物(即iv-1-1的its)送交北京优吉科技有限公司进行测序。
81.5)将所得序列与ncbi核酸数据库用blast进行同源性比对分析，挑选部分相似性高的菌株与iv-1-1菌株进行系统发育分析，用 mega7.0软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。系统发育树如附图2所示。
82.最终根据形态学特征，同源性远近以及系统发育树，确定iv-1-1 为曲霉(aspergillus sp.)。
83.实施例3
84.本实施例主要对iv-1-1进行了降解测定，包括对其生长曲线的测定，降解产物的测定以及降解率的测定。
85.本实施例中所涉及的马丁培养基其组分同实施例1。
86.1、生长曲线测定
87.1)将菌株单菌落接种于装有150ml液体马丁培养基的三角瓶中，于28℃，180r/min的摇床中振荡活化培养。
88.2)再以2％的接种量接种于27瓶装有150ml液体马丁培养基的三角瓶中，从培养时间的第48h(即2d)起每隔24h取出3个三角瓶，保留菌丝体，60℃烘干至恒重后称量并计算平均值，通过干重法测量生长曲线见附图3。
89.生长曲线显示iv-1-1菌前7天为对数生长期，第7天达到最大值， 7天以后为衰亡期，故iv-1-1的最适培养时间为7天。
90.2、降解产物
91.1)将纯化培养的菌株iv-1-1接种于150ml的液体商用马丁培养基中，28℃，180r/min振荡培养，至对数生长期。
92.2)分别加入底物敌草隆和吡虫啉，浓度为100mg/l，同条件继续培养5d。
93.3)将发酵液过ods c18小柱得到检测样品。采用液相色谱质谱联用仪测定菌株的降解产物情况。
94.所用仪器为：agilent 1200-6530hplc-q-tof液相色谱质谱联用仪(美国agilent)。
95.hplc条件：色谱柱capcellpak c18aq(250mm
×
4.6mm， 5.0μm)；流动相：乙腈(a)-水(b)，梯度洗脱(0～40min，10％～70％a)；流速：1.0ml/min；柱温：20℃；进样体积：5μl。
96.ms条件：飞行时间质谱采用电喷雾负离子模式：毛细管电压 4.5kv，喷雾器压力2.0bar，干燥气体(n2)流速4.0l/min，干燥气体温度180℃，四级杆离子能量3.0ev，离子传输时间80μs，前脉冲存储时间5μs，碰撞气体氩气，碰撞能量30ev。质谱测定数据采用全扫描模式采集，采集范围100～2000m/z。
97.通过液质数据得知菌株iv-1-1对敌草隆见附图4和吡虫啉见附图 7的降解产物。菌株iv-1-1降解敌草隆产生两种降解中间产物：3-(3,4
‑ꢀ
二氯苯基)-1-甲基脲见附图5，分子式c8h8cl2n2o；以及3,4-二氯苯脲见附图6，分子式c7h6cl2n2o。降解吡虫啉产生2种降解中间产物：脱硝基吡虫啉见附图8，分子式c9h
11
cln4；以及吡虫啉尿素见附图9，分子式c9h
10
cln3o。实验结果进一步表明，菌株iv-1-1具有降解敌草隆和吡虫啉的能力，具有环境
修复潜力。
98.3、降解率测定
99.1)自宁夏医科大学校区的一处无污染草坪中采集土壤样品。
100.2)取表层土壤5-20cm，剔除其中的石块、植株残体等，于阴凉处均匀摊开自然风干，过2mm筛备用。
101.3)称取土壤样品100g若干份，分别添加敌草隆和吡虫啉，使土壤农药最终浓度均为500mg/kg，搅拌均匀，铝箔纸封口，备用。
102.4)加入菌株iv-1-1菌悬液，保证土壤中的菌活数为106cfu/g，室温放置。
103.5)以不添加降解菌的农药污染土为空白对照。实验分组情况见表1。所有处理均在施药后4h和1、3、5、7d取0-5cm的土样，用密封袋装好，置于冰箱-20℃保存待测。
104.6)称取实验土壤4.5g于试管中，加入2倍体积的乙酸乙酯进行超声30min萃取，静置取上清液，共萃取三次。将萃取后的乙酸乙酯过ods c18小柱，收集溶液旋蒸蒸干后以甲醇溶解并挥干，用色谱甲醇溶解样品过0.22μm有机滤膜。高效液相色谱检测含量，并计算降解率。
105.表1菌株iv-1-1对敌草隆和吡虫啉的降解效果
[0106][0107][0108]
注：表中d为敌草隆；i为吡虫啉
[0109]
降解率计算公式：
[0110][0111]
注：c
x
：一定天数后土壤中农药的检出含量(mg/kg)
[0112]
c0：土壤中农药初始施用含量(mg/kg)
[0113]
分析采用高效液相色谱仪：岛津lc2030c色谱仪，色谱柱为 megers c18色谱柱(250
×
4.6mm，10μm)。流动相分别为：
[0114]
敌草隆：甲醇-水(体积比60:40)，流速0.8ml/min，检测波长254 nm，柱温30℃，进样体积10μl。
[0115]
吡虫啉：甲醇-水(体积比40:60)，流速0.8ml/min，检测波长254 nm，柱温30℃，进样体积5μl。
[0116]
降解实验结果表明，培养7d后，菌株iv-1-1对敌草隆的降解率为51.84％如附图10，对吡虫啉的降解率为71.83％如附图11。
[0117]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普
通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。