一株降解恩诺沙星的低温降解菌株及其应用

1.本发明属于环境微生物修复技术领域，特别涉及一株能够降解恩诺沙星的低温降解菌株及其应用。


背景技术：

2.恩诺沙星(enrofloxacin,enr)是一种人工合成的动物专用喹诺酮类抗生素，具有抗菌谱广、活性强等特点，常用于畜禽感染性疾病预防和治疗。进入畜禽体内的抗生素不会被全部吸收，约有30％～90％会随着尿液或粪便排出，进入环境。enr是一种两性分子(pka1＝5.88～6.06，pka2＝7.70～7.74)，正常环境下亨利定律常数极低，挥发损失可忽略不计，但其辛醇-水分配常数(kow)较低，易在土壤中积累和迁移，检出率高，威胁生态系统安全。
3.研究发现，在我国畜禽粪便中最常检出的抗生素为喹诺酮类，其中猪粪中enr平均检出浓度达到4.68mg
·
kg-1
。且我国农田土壤中enr的检出率高，残留浓度范围在0～1347.6μg
·
kg-1
，均值介于0～99.4μg
·
kg-1
之间，最大值接近澳大利亚农田土壤标准370μg
·
kg-1
的4倍。长三角典型城郊地区农田、林地和园地的enr检出率高达70％以上，农田的检出率达100％。调查东莞市18个区镇24个代表性蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素的含量，结果表明4种喹诺酮类抗生素的检出率均在90％以上，以恩诺沙星(平均含量19. 85μg
·
kg-1
)为主，部分含量超过了抗生素生态毒害效应触发值(100μg
·
kg-1
)。 enr等喹诺酮类抗生素进入环境带来的生态环境风险已经得到了关注。
4.微生物修复是解决土壤抗生素污染问题的有效手段。王强锋等从重金属污染的土壤中分离筛选出四株能降解土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶的真菌菌株，其中菌株ks272在初始浓度1500μg
·
l-1
、30℃、150r
·
min-1
条件下避光培养7d后，对土霉素、诺氟沙星的降解率分别达到40.29％、10.59％。 hirth等人从加拿大土壤中分离出有效降解磺胺二甲嘧啶的微杆菌 (microbacterium sp.)菌株。近年研究发现，苍白杆菌属(ochrobactrum sp.)、双头菌属(labrys sp.)和戈登氏菌属(gordonia sp.)对磺胺甲恶唑的降解率为 45.2％～62.2％。巩宗强等研究发现，将哈特草螺菌(herbaspirillum huttiense) 加入至含有1mg/l恩诺沙星的无机盐培养基中，接种量2％，15℃、150r
·
min-1
避光培养3d，对恩诺沙星的降解效果达58.27％(已扣除自然降解部分)。可以看出，微生物能够有效降解抗生素的含量，但目前针对低温条件下的菌株筛选和评估工作还不多见。
5.我国北方地区秋冬季气温低，周期长，较大限制了中高温菌的应用，因此，增强低温降解菌的研究对于低温地区的土壤抗生素污染治理具有重要意义。畜禽粪便堆放地土壤通常具有较高的含盐量和抗生素含量，因此筛选耐盐的恩诺沙星降解菌是很有必要的，目前关于适应北方低温耐盐环境的恩诺沙星降解菌还未见报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一株降解恩诺沙星的低温降解菌株及其应用。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
8.一株降解恩诺沙星的低温降解菌株，菌株为产碱杆菌属(alcaligenesammonioxydans)，命名为y-enr，已于2022年09月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏编号为：cgmcc no:25659。
9.一种所述菌株的应用，所述菌株在低温环境下对水体污染修复中的应用。
10.所述菌株在低温中性或低碱环境下对降解污染水体中抗生素中的应用。
11.所述抗生素为恩诺沙星；低温为0-15℃。
12.一种低温土壤污染修复菌剂，所述菌剂含所述菌株。
13.所述菌剂含有该菌株的培养液、培养液浓缩物或培养菌悬液。
14.所述菌剂培养液为将所述产碱杆菌属(alcaligenes ammonioxydans)置于lb液体培养基中培养至对数生长期，即获得培养液；培养液离心收集沉淀，沉淀经无菌生理盐水重悬至od
600
为0.8～1.2的菌悬液。
15.一种所述菌剂的应用，所述菌剂在中性或低碱环境下降解污染水体中抗生素的应用。
16.一种所述菌剂的使用方法，将所述菌剂施加至0-15℃低温环境下待处理污染水体中，按5～10wt％的接种量施加入待处理污染水体中。
17.本发明具有以下有益效果：
18.本发明从含有抗生素污染的原位畜禽养殖土壤中筛选分离得到一株具有恩诺沙星抗生素降解活性的嗜盐菌株，该菌经分子鉴定为alcaligenesammonioxydans(产碱杆菌属)，用于降解环境中的恩诺沙星。本发明确定了低温降解菌株的在不同ph、不同低温条件下的生长状态，以及对恩诺沙星的降解能力。在4～15℃的温度范围、中性或低碱环境(畜禽粪便堆放地) 中，低温降解菌株能够高效地降解恩诺沙星。15℃条件下，投加量为5％的低温降解菌株3d对恩诺沙星的降解率可达73.38％。4℃条件下，投加量为 5％的低温降解菌株14d对恩诺沙星的降解率可达34.31％。该菌具有降解恩诺沙星的功能，有利于丰富喹诺酮类抗生素降解菌的菌种资源库，为恩诺沙星类抗生素污染的治理提供有效的生物降解方法。该菌株的适应能力强，耐低温，可以实现在微生物适应的低温环境对恩诺沙星进行降解。
附图说明
19.图1为本发明实施例提供的菌株的生长曲线；
20.图2为本发明实施例提供的菌株对恩诺沙星的降解能力；
21.图3为本发明实施例提供的ph值对菌株生长的影响；
22.图4为本发明实施例提供的低温对菌株生长的影响；
23.图5为本发明实施例提供的低温对菌株恩诺沙星降解能力的影响。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
25.以下实施例中所涉及到的土壤来源为辽宁省海城市某畜禽养殖场粪便堆放区土壤。
26.以下实施例中所涉及到的培养基和试剂为：
27.lb液体培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠50g/l，ph7.2～7.4，高压蒸汽115℃灭菌20min。
28.lb固体培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠50g/l，ph7.2～7.4，琼脂20g/l，高压蒸汽115℃灭菌20min。
29.无机盐(msm)液体培养基：1l水、1g(nh4)2so4、1g khpo4、1gk2hpo4、2.5g nacl、0.05g fec13·
6h20、0.02g cac12·
h2o，0～10g葡萄糖， ph 7.2～7.4，高压蒸汽115℃灭菌20min。
30.恩诺沙星储备液：准确称取恩诺沙星标准品0.0100g，用乙腈:水(1:1) 超声溶解并定容于100ml容量瓶中，配制成浓度为100mg
·
l-1
的恩诺沙星标准液，在-20℃冰箱中避光保存，1个月内使用。实验中用到的各浓度梯度标准液(5～500μg
·
l-1
)均用甲醇(含1％甲酸)稀释。
31.在本发明的一些实施例中，所述低温条件包括4、8、15℃。
32.在本发明的一些实施例中，所述不同ph环境包括培养基不同的ph处理(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)。
33.实施例1菌株的分离和筛选
34.步骤(1)称取1.5g冷鲜土样置于装有30ml msm培养基的锥形瓶中，按5％接种量进行梯度驯化培养。将10mg
·
l-1
的恩诺沙星储备液加入至培养基各0.3、0.6、1.2、2.4ml，使培养基中恩诺沙星浓度分别为100、200、400、 800μg
·
l-1
，每个浓度下15℃、150r
·
min-1
避光振荡培养5d，定期观察培养基中菌液状态，培养基中液体由透明变浑浊，表明菌液生长良好；
35.步骤(2)经四次梯度培养后，选择恩诺沙星浓度为800μg
·
l-1
下筛得的能够耐受恩诺沙星的混合菌液转接到含有800μg
·
l-1
恩诺沙星的固体lb 培养基上进行划线培养，15℃避光条件下每隔5d对生长出来的微生物进行一次转接，共转接6次，使得培养基中菌株得以分离纯化，最终获得若干单一菌株；
36.步骤(3)将分离纯化的若干单一菌株以5wt％接种量接种到恩诺沙星含量为500μg
·
l-1
的msm培养基中进行降解实验，15℃、150r
·
min-1
避光振荡培养5d，测定培养基中恩诺沙星的含量，最终选择出一株对恩诺沙星降解效果最高的低温降解菌株。
37.上述获得菌株经过dna提取，pcr扩增，序列测序及序列比对，菌株 y-enr的16srdna序列与产碱杆菌属(alcaligenes ammonioxydans)同源性达99.86％以上，亲缘关系最近，鉴定为产碱杆菌属，简称为y-enr；已于2022年09月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：cgmcc no:25659。
38.实施例2
39.菌悬液的制备
40.将上述获得菌株以5wt％接种量接种至50ml lb液体培养基中， 150r
·
min-1
、15℃避光振荡培养48h，将菌液7500r/min下离心3min，倒出培养基，加入无菌水，涡旋2min，用无菌水调节菌液的od
600
为1.23，制成菌悬液，4℃冷藏保存。
41.1)菌株的生长曲线
42.采用无菌操作技术向50ml液体lb培养基中加入菌悬液2.5ml(未投加恩诺沙星)，15℃、150r
·
min-1
避光振荡培养6d，分别在0、2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、48、72、96、120、144h取样测定菌液浓度od
600
。以不接菌的空白培养基作对照，以培养时间为横坐标，od
600
为纵坐标，绘制生长曲线(参见图1)。
43.od
600
的测定方法：
44.用分光光度计测定细菌培养液在600nm处的吸光值，即od
600
。od
600
超过1，则稀释适当倍数后测定。
45.由图1可见菌株的生长过程经历先上升后达到稳定的过程，培养初期生长速率极为缓慢，48-72h接近稳定期，od
600
达到峰值2.483，随后略有下降。
46.2)ph值对菌株生长的影响
47.向20ml lb液体培养基中加入上述配置菌悬液1ml，利用hcl或naoh 溶液设置不同的培养基ph处理(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，每种处理均设置三个重复，15℃、150r
·
min-1
避光振荡培养，培养3d后取样测定不同ph 处理菌液的od
600
，结果见图3。
48.od
600
的测定方法：
49.用分光光度计测定细菌培养液在600nm处的吸光值，即od
600
。od
600
超过1，则稀释适当倍数后测定。
50.由上述图3可见，菌株在不同ph条件下的响应特征不同，在ph 5.0～9.0 范围内，菌株更适于中性环境，其在ph＝7.0生长良好，od
600
达到2.013，酸性和碱性环境中的od值显著小于ph＝7时的od值，且碱性越强，受抑制程度越强。
51.3)低温对菌株生长的影响
52.向20ml液体lb培养基中加入上述配置菌悬液1ml，在4、8、15℃温度下，150r
·
min-1
避光振荡培养15d，分别在0、1、3、6、9、12、15d 取样测定菌液浓度od
600
，直到菌株死亡，每种处理设置三个重复，结果见图4。
53.od
600
的测定方法：
54.用分光光度计测定细菌培养液在600nm处的吸光值，即od
600
。od
600
超过1，则稀释适当倍数后测定。
55.由图4可知，与图1的生长曲线对比，恩诺沙星抑制了菌株的生长。菌株在4～15℃的温度范围均能生长，但低温会在生长前期显著抑制微生物的生长。温度越低，菌株前期生长越缓慢。15℃条件下，菌株生长迅速， 0-9d的菌密度显著高于8℃和4℃。
56.4)低温对菌株恩诺沙星降解能力的影响
57.向20ml液体lb培养基中加入恩诺沙星标准储备液0.1ml，使恩诺沙星的浓度为500μg
·
l-1
，再加入菌悬液1ml，分别在4、8、15℃温度下， 150r
·
min-1
避光振荡培养，不接菌的空白培养基作为对照。培养14d取样测定培养基中恩诺沙星的含量，每个处理设置三个重复，结果见图5。
58.前处理方法：
59.实验样品取样测定时，取1ml摇匀的待测菌液，用0.22μm无菌滤膜过滤至1.5ml液相进样瓶中，避光保存于-20℃冰箱。
60.恩诺沙星测定方法：
61.利用超高效液相-三重四级杆质谱联用仪(triple quad 5500 qtrapready，美国ab sciex)进行测定。
62.色谱条件：
63.采用ailent eclipse plus c18(1.9μm,150mm
×
2.1mm)色谱柱，柱温40℃，柱平衡时间30min，流速0.4ml
·
min-1
，进样量10μl。流动相为5mmol
·
l-1
乙酸铵溶液(含1％甲酸)-乙腈，梯度为0～0.5min(98％a相，2％b相)、 0.5～3min(98％a相，2％b相)、3～5min(2％a相，98％b相)、5～5.1min(2％a 相，98％b相)、5.1～8min(98％a相，2％b相)。
64.质谱条件：
65.采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子源(esi)，多反应离子监测 (mrm)模式。辅助气体55ml
·
min-1，喷雾电压5500v，气帘30ml
·
min-1，蒸汽温度550℃，恩诺沙星母离子360.6m/z，子离子316.4/245.4m/z，碰撞电压20/27v，锥孔电压45v。
66.质量控制方法：
67.回收率测定采用实际样品加标的回收率，测得加标回收率为92.1％， rsd低于1％，空白对照组中均未检出恩诺沙星。
68.结果分析：
69.在5～500μg
·
l-1
浓度范围内基准曲线的相关系数r2》0.99。为屏蔽实验过程中恩诺沙星自降和土壤吸附对降解菌降解的影响，同时进行零时处理，降解率计算公式：c
ck
表示ck-空白enr含量，c表示接菌处理enr含量，c0表示ck-0d enr含量，降解率＝(c
0-c)/co×
100％。
70.由图5可知：低温抑制了恩诺沙星的非生物降解(后续的阐述中，恩诺沙星降解率的表达去除了对照中的自降部分)。同时，低温显著抑制了菌株对恩诺沙星的降解效果，温度越低降解效果越差，但即使在低温情况下，菌株对恩诺沙星依然有降解效果。15℃条件下，投加量为5％的低温降解菌株14d对恩诺沙星的降解率可达73.87％。4℃条件下，投加量为5％的菌株对恩诺沙星的降解率可达34.31％。
71.5)菌株对恩诺沙星的降解能力
72.向50ml液体lb培养基中加入上述配置获得恩诺沙星标准储备液 0.25ml，使体系内恩诺沙星的浓度为500μg
·
l-1
，再加入菌悬液2.5ml，8℃、 150r
·
min-1
避光振荡培养14d。由于14d后菌液浊度已经较高，细菌对恩诺沙星的吸附作用可能较强，因此为排除细菌吸附作用对恩诺沙星浓度的影响，分别设置不接菌的培养基和灭活菌液的对照处理，分别在0、2、4、6、 8、10、12、14d取样测定培养基中恩诺沙星的含量(灭活菌液处理取样后高压蒸汽115℃灭菌20min测定)，每个处理设置三个重复(参见图2)。
73.前处理方法：
74.实验样品取样测定时，取1ml摇匀的上述配置获得菌悬液，用0.22μm 无菌滤膜过滤至1.5ml液相进样瓶中，避光保存于-20℃冰箱。
75.恩诺沙星测定方法：
76.利用超高效液相-三重四级杆质谱联用仪(triple quad 5500 qtrapready，美国ab sciex)进行测定。
77.色谱条件：
78.采用ailent eclipse plus c18(1.9μm,150mm
×
2.1mm)色谱柱，柱温40℃，柱平衡
时间30min，流速0.4ml
·
min-1，进样量10μl。流动相为5mmol
·
l-1 乙酸铵溶液(含1％甲酸)-乙腈，梯度为0～0.5min(98％a相，2％b相)、0.5～3min(98％a相，2％b相)、3～5min(2％a相，98％b相)、5～5.1min(2％a 相，98％b相)、5.1～8min(98％a相，2％b相)。
79.质谱条件：
80.采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子源(esi)，多反应离子监测 (mrm)模式。辅助气体55ml
·
min-1
，喷雾电压5500v，气帘30ml
·
min-1
，蒸汽温度550℃，恩诺沙星母离子360.6m/z，子离子316.4/245.4m/z，碰撞电压20/27v，锥孔电压45v。
81.质量控制方法：
82.回收率测定采用实际样品加标的回收率，测得加标回收率为92.1％， rsd低于1％，空白对照组中均未检出恩诺沙星。
83.结果分析：
84.在5～500μg
·
l-1
浓度范围内基准曲线的相关系数r2》0.99。为屏蔽实验过程中恩诺沙星自降和土壤吸附对降解菌降解的影响，同时进行零时处理，降解率计算公式：c
ck
表示ck-空白enr含量，c表示接菌处理enr含量， c0表示ck-0d enr含量，降解率＝(c
0-c)/co
×
100％。
85.由图2可知，在8℃、培养14d过程中，不接菌对照处理中恩诺沙星含量有所下降，14d自降率为22.8％。通过灭活菌株的对照组对恩诺沙星的吸附能力可以看出，14d培养过程中菌株对恩诺沙星的吸附作用并不明显，可以排除细菌吸附作用对恩诺沙星浓度的影响。菌株对恩诺沙星具有较好的降解能力，对恩诺沙星的降解率随培养时间的增长呈上升趋势。菌株对恩诺沙星的降解率在12d达到最高，为48.1％；扣除对照中的自降部分后，仍可达到25.3％。
86.所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
87.尽管已经结合了本发明的具体实施例对本发明进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。