用于颗粒的电穿孔的系统的制作方法

用于颗粒的电穿孔的系统
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求于2019年11月22日提交的题为“用于靶细胞连续流富集、洗涤和电转染的端对端细胞治疗生物加工装置”，序列号为62/939,191的美国临时专利申请的优先权，其通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.基因修饰的t细胞的使用可用于治疗各种血液癌症，导致第一次fda批准的细胞疗法治疗。成功的细胞疗法治疗已经导致新的细胞疗法研究和对细胞疗法制造的增加的需求。目前的制造管道通常依赖于设计用于研究用途而不是大规模制造的过时的细胞生物加工设备。这可能导致长的处理时间(例如，大约数周)和非常昂贵的治疗，在一些情况下，患者的成本达到每剂量约400,000美元。


技术实现要素：

4.本公开描述了用于细胞生物加工和细胞疗法制造的系统和方法。在一些实施方式中，本公开的技术可以使用基于微流体的技术的组合来简化和自动化用于细胞疗法的细胞生物加工或制造过程。本公开的系统和方法可以利用制造过程中的几个步骤，包括从血液或血液制品中靶细胞的富集、细胞洗涤或培养基交换以及通过电转染进行基因递送。在一些实施方式中，所有这些处理步骤可以在连续流中完成，使得能够在没有人为干预的情况下在完全自动化的过程中在几小时内处理大约10亿个细胞。
5.在一些实施方式中，用于细胞生物加工和细胞疗法制造的系统可以主要由微流体模块构建，并且可以实现连续流的端对端细胞生物加工。传统上，微流体方案可能受到低吞吐量的限制。然而，本文公开的技术可以使用平行化和中尺度几何形状(例如，1mm宽的微通道)来克服这些限制，从而以临床规模制造细胞疗法。本公开还描述了用于对关键参数(诸如流速和电场量值)进行自动精确控制的反馈传感器。这可以帮助确保最终产物在大样本的整个处理过程中是一致的，该大样本可以包括超过500,000个细胞。因此，本公开提供了可以提供增加的自动化、减少的接触劳动、增加的吞吐量和对用于细胞生物加工和细胞疗法制造的过程的更精确控制的技术。
6.本公开的至少一个方面涉及一种系统。该系统可以包括入口通道，该入口通道接收包括目标颗粒的目标流体流。该系统可以包括声泳装置，其从入口通道接收包括目标颗粒的目标流体流，并将目标颗粒从目标流体流移动到包括负荷颗粒(cargo particle)的缓冲液流体流。该系统可包括电穿孔设备，其接收包含目标颗粒和负荷颗粒的缓冲液流体流。电穿孔设备可以向缓冲液流体流施加电场，以使缓冲液流体流中的一部分目标颗粒吸收一部分负荷颗粒。该系统可包括出口通道，其提供来自电穿孔设备的输出缓冲液流体流。
7.在一些实施方式中，声泳装置可以包括中心通道，其接收来自缓冲液流体的源的包含负荷颗粒的缓冲液流体流和来自入口通道的目标流体流。在一些实施方式中，声泳装置可以包括耦接到中心通道的压电换能器，其使目标颗粒从目标流体流移动到第二通道中
的缓冲液流体流。在一些实施方案中，电穿孔设备可包括中心通道，其接收从声泳装置输出的缓冲液流体流和来自第二通道的导电缓冲流。在一些实施方式中，电穿孔设备可包括电耦接到中心通道的一部分以提供电流的电极。
8.在一些实施方式中，输入流体流中的目标颗粒可以是淋巴细胞。在一些实施方式中，输入流体流还包括废弃物颗粒，废弃物颗粒包括红细胞、粒细胞或单核细胞中的至少一种。在一些实施方式中，该系统可以包括第二入口通道，其接收包括目标颗粒和废弃物颗粒的输入流体流。在一些实施方式中，声学分离装置从输入流体流接收包括目标颗粒和废弃物颗粒的输入流体流，并将输入流体流分离成包括目标颗粒的目标流体流和包括废弃物颗粒的废弃物流体流。在一些实施方式中，废弃物流体流可以经由一个或多个通道输送到废弃物贮存器。在一些实施方式中，从声学分离装置输出的目标流体流经由第二通道输送到目标贮存器中。在一些实施方式中，该系统可以包括泵，该泵将目标流体流从目标贮存器经由入口通道输送到声泳装置。
9.在一些实施方式中，该系统可以包括第一泵，该第一泵将目标流体流从输入贮存器经由入口通道输送到声泳装置。在一些实施方式中，系统可以包括第二泵，其将从声泳装置输出的包含目标颗粒和负荷颗粒的缓冲液流体流经由中间通道输送到电穿孔设备。在一些实施方式中，系统可以包括在入口通道、声泳装置、电穿孔设备或出口通道中的两个或更多个之间的一个或多个保持贮存器。在一些实施方式中，该系统可以包括分离装置，该分离装置从输出通道接收输出缓冲液流体流并将输出缓冲液流体流中的富集的目标颗粒与输出缓冲液流体流中的废弃物颗粒分离。在一些实施方式中，该系统可以包括从分离装置接收富集的目标颗粒的输出贮存器。
10.在一些实施方式中，至少入口通道、声泳装置、电穿孔设备或出口通道之间的连接件包括聚氯乙烯管或硅胶管中的至少一种。在一些实施方式中，该系统可以包括与至少一个连接件耦接的一个或多个流体电容器，该流体电容器被配置为调整系统中流体的流速。在一些实施方式中，系统可以包括一个或多个传感器，其被配置为向控制器装置发送表示目标流体流、缓冲液流体流或输出缓冲液流体流中的至少一个中的目标颗粒或废弃物颗粒的密度值的信号。在一些实施方式中，系统可包括一个或多个流传感器，其向控制器装置传输表示流过入口通道、声泳装置、电穿孔设备或出口通道中的至少一个的流体的流速或电导率的信号。
11.本公开的至少一个其他方面涉及一种系统。该系统可包括电穿孔设备上游的传感器，其测量流入电穿孔设备的流体的电导率。该系统可包括在电穿孔设备中产生电压的电信号发生器。该系统可以包括控制器装置，该控制器装置包括耦接到存储器的一个或多个处理器。控制器装置可识别要在流过电穿孔设备的流体中引起的期望电场量值。控制器装置可从传感器接收流入电穿孔设备的流体的电导率。控制器装置可基于电导率和由电信号发生器产生的电压来确定当流体流过电穿孔设备时流体中的预期电场量值。控制器可以基于预期电场量值和期望电场量值来计算用于电信号发生器的调整电压。控制器可以向电信号发生器提供表示调整电压的信号，使电信号发生器在电穿孔设备中产生第二电压。
12.在一些实施方式中，系统可包括电导率探针，其在流体流过电穿孔设备时测量流体的第二电导率。在一些实施方式中，系统可包括电流传感器，该电流传感器在流体流过电穿孔设备时测量通过流体的电流。在一些实施方式中，系统可包括光学传感器，该光学传感
器在流体通过电穿孔设备时测量流体的中心部分的宽度。在一些实施方式中，控制器装置可以基于第二电导率、电流和流体的中心部分的宽度来确定预期电场量值。
13.在一些实施方式中，流过电穿孔设备的流体包括来自第一流体输入的第一流体和来自第二流体输入的第二流体。在一些实施方式中，控制器装置可以基于第二电导率、电流和流体的中心部分的宽度来计算第一流体或第二流体中的至少一个的调整流速。在一些实施方式中，控制器装置可以向控制第一流体或第二流体的流动的泵提供表示调整流速的第二信号，使得第一流体或第二流体以第二流速流动。
14.在一些实施方式中，流过电穿孔设备的流体可包括来自第一流体输入的第一流体和来自第二流体输入的第二流体。在一些实施方式中，电穿孔设备可包括第二传感器，其确定电穿孔设备的输入端处的第一流体的第一流速和电穿孔设备的输入端处的第二流体的第二流速。在一些实施方式中，控制器装置可以基于第一流速或第二流速中的至少一个来计算第一流体或第二流体中的至少一个的调整流速。在一些实施方式中，控制器装置可以向控制第一流体的第一流速或第二流体的第二流速的泵提供表示调整流速的第二信号，使得第一流体或第二流体以第三流速流动。
15.本公开的又一方面涉及一种方法。该方法可以由具有一个或多个处理器和存储器的控制器装置执行。该方法可包括识别要在流过电穿孔设备的流体中引起的期望电场量值。该方法可包括当流体流入电穿孔设备时从第一传感器接收流体的电导率。该方法可包括基于电导率和由电信号发生器产生的电压来确定当流体流过电穿孔设备时流体中的预期电场量值。该方法可以包括基于预期电场量值和期望电场量值来计算用于电信号发生器的调整电压。该方法可包括向电信号发生器提供表示调整电压的信号，使电信号发生器在电穿孔设备中产生第二电压。
16.在一些实施方式中，该方法可包括从检测来自电穿孔设备中的流体的信号的一个或多个第二传感器接收流体的第二电导率、通过流体的电流和流体的中心部分的宽度。在一些实施方式中，该方法可以包括基于第二电导率、电流和流体的中心部分的宽度来确定预期电场量值。在一些实施方式中，从第一流体流和第二流体流接收流入电穿孔设备的流体。在一些实施方式中，该方法可以包括从至少一个流速传感器接收第一流体流的第一流体流速和第二流体流的第二流体流速。在一些实施方式中，该方法可以包括计算用于第一流体流或第二流体流中的至少一个的调整流速。在一些实施方式中，该方法可以包括向控制第一流体流或第二流体流的泵提供表示调整流速的信号，使得第一流体流或第二流体流以第二流速流动。
17.下面详细讨论这些和其他方面和实施方式。前述信息和以下详细实施例包括各个方面和说明书的说明性示例，并且提供用于理解所要求保护的方面和实现的性质和特性的概述或框架。附图提供了对各个方面和实施方式的说明和进一步理解，并且被并入本说明书中并构成本说明书的一部分。各方面可以组合，并且将容易理解，在本发明的一个方面的上下文中描述的特征可以与其他方面组合。各方面可以以任何方便的形式实现。
附图说明
18.附图不旨在按比例绘制。各个附图中相同的附图标记和名称指示相同的元件。为了清楚起见，并非每个部件都可以在每个附图中标记。通过参考结合附图进行的以下说明
书，本公开的前述和其他目的、方面、特征和优点将变得更加明显和更好地理解，其中：
19.图1示出了根据一个或多个实施方式的细胞疗法制造方法的示例性处理流的图；
20.图2示出了根据一个或多个实现方式的可以用于实现图1的处理流的第一阶段的示例模块；
21.图3示出了根据一个或多个实现方式的可以用于实现图1的处理流的第二阶段的示例模块；
22.图4示出了根据一个或多个实现方式的可以用于实现图1的处理流的第三阶段的示例模块；
23.图5a、5b和5c示出了根据一个或多个实现方式的用于实现与图1中所示的处理流类似的处理流的系统的框图；
24.图6示出了根据一个或多个实现方式的图4的模块中的细胞所经历的电场的曲线图；
25.图7a-7d示出了根据一个或多个实施方式的用于控制图4的模块中的细胞所经历的电场的示例控制系统的框图；以及
26.图8、图9a、图9b和图9c示出了根据一个或多个实现方式的示出图5a、图5b和图5c的系统的实验结果的曲线图；
27.图10示出了用于控制在类似于图5a、图5b和图5c所示的系统中流动的流体所经历的流速或电场的示例系统的框图；
28.图11示出了控制在类似于图5a、图5b和图5c所示的系统中流动的流体所经历的流速或电场的示例方法的流程图；以及
29.图12描绘了可以用于实现本文描述和示出的系统和方法的各种元件的计算机系统的一般架构的框。
具体实施方式
30.上面介绍并在下面更详细讨论的各种概念可以以多种方式中的任何一种来实现，因为所描述的概念不限于任何特定的实现方式。提供具体实施方式和应用的示例主要是为了说明的目的。
31.本公开描述了用于细胞生物加工和细胞疗法制造的系统和方法。在一些实施方式中，本公开的技术可以使用基于微流体的技术的组合来简化和自动化细胞疗法的制造过程。本公开内容的系统和方法可以利用细胞生物加工或细胞疗法制造过程中的几个步骤，包括对来自血液或血液制品中的靶细胞的富集、细胞洗涤或培养基交换以及通过电转染的基因递送。在一些实施方式中，所有这些处理步骤可以在连续流中完成，使得能够在没有人为干预的情况下在完全自动化的过程中在几小时内处理大约10亿个细胞。
32.在一些实施方式中，用于细胞生物加工和细胞疗法制造的系统可以主要由微流体模块构建，并且可以实现连续流的端对端细胞生物加工。例如，每个实施不同技术的一系列模块可以彼此耦接以在细胞疗法制造链中执行各种单元操作，从而使得能够直接处理血液或血液制品样本。在一些实施方案中，样本可以是基于白细胞单采术获得的白细胞。该系统可以自动且连续地将样本处理成基因修饰的淋巴细胞或t细胞以用于细胞治疗。在一些实施方式中，由系统中的每个模块实施的技术可以包括微流体声泳、微流体声泳培养基交换
或细胞洗涤以及连续流微流体电转染的任何组合。实施这些微流体技术的模块可以与塑料管(例如，硅树脂或乙烯基管)或定制歧管互连，作为集成的自动化系统的一部分。
33.图1示出了细胞疗法制造方法100的示例性处理流图。处理流图100包括三个阶段。在第一阶段105中，血液样本可以针对淋巴细胞(或其他类型的细胞，例如t细胞，在其他实施方式中)进行声泳富集。例如，可以将血液制品引入到被配置成使用声学分离来富集淋巴细胞的样本的模块中。可以丢弃废弃物细胞，并且可以将富集的样本引入第二阶段110。第二阶段110可以例如使用培养基交换设备来实现。在第二阶段110中，可以将靶细胞声泳转移到培养基交换模块中的电穿孔培养基中。在第二阶段1100中，声泳可用于将细胞移动到含有负荷的低电导率电穿孔缓冲液中，负荷可包括核酸、蛋白质或这些物质的组合。在一些实施方案中，负荷可以包括mrna。然后，可以将含有靶细胞的培养基递送到第三阶段115。在一些实施方式中，第三阶段115可以使用电穿孔设备来实施。在第三阶段115中，可以在连续流式电穿孔设备中对细胞进行电穿孔。
34.图1中所示的阶段105、110和115的布置仅是说明性的。在一些其它实施方式中，实施第一阶段105、第二阶段110和第三阶段115的模块可以各种序列或排列配置，或以各种串联和并联网络配置且互连以使所要的工作流自动化。例如，在一些实施方式中，在较早阶段进行培养基交换和电穿孔之后，可以在最后阶段进行靶细胞的声学富集。除了图1中所示的阶段之外，本公开提供了用于维持从一个阶段到下一个阶段的连续流的基础设施、在搅拌下的废弃物贮存器以在装置的前端和处理步骤之间维持细胞悬浮、控制器、传感器和反馈控制以及泵，所有这些都在下面进一步描述。在一些实施方式中，可以封闭整个系统以保持无菌。
35.图2示出了可以用于实现图1的处理流100的第一阶段105的示例模块200。在模块200中，声泳可用于从包括血液或血液制品的样本中富集淋巴细胞并消耗红细胞。模块200包括具有入口205和三个出口210a、210b和215的一组微通道。在一些实施方式中，入口通道205的壁可以耦接到超声振荡器，例如压电换能器，并且换能器可以被电驱动以激励入口通道205，使得一些细胞在流过通道时朝向通道的轴向中心流迁移。细胞的迁移速率可以取决于它们的尺寸、密度和相对于周围培养基的可压缩性，因此细胞固有性质的差异可以使得一些细胞类型将比其他细胞类型迁移得更快，并且可以在中心出口215中收集，而剩余的细胞将在侧出口210a和210b中收集。在图2的示例中，红细胞、粒细胞和单核细胞可以在中心出口215中富集，并且淋巴细胞可以在侧出口210a和210b中富集。流到中心出口215的细胞和培养基可以是废弃物，其可以被丢弃。可以收集流到侧出口210a和210b的细胞和培养基并将其引入系统的后续阶段(例如，图1的阶段110)。在一些实施方式中，对培养基的修改、颗粒的添加或将细胞引起成其他状态/表型或聚集体可以进一步帮助模块200中的分离过程。
36.图3示出了可以用于实现图1的处理流的第二阶段的示例模块300。在模块300中，声泳可用于将细胞从一种培养基移动到另一种培养基中。特别地，模块300可将靶细胞从初始培养基(例如，血浆或细胞培养基)移动到与上游微流体电穿孔模块兼容的电穿孔培养基中。模块300可以包括三个入口，包括中心入口310和两个侧入口315a和315b。模块300可以包括三个出口，包括中心出口320和两个侧出口325a和325b。中心通道330可以将三个入口与三个出口耦接。压电换能器335可以与中心通道330耦接。
37.在模块300中，可以以层流状态建立三个平行流，每个流对应于两个侧入口315a或315b中的一个或中心入口310。中心通道330中的流之间的混合可以通过扩散和分散来主导。由压电换能器335产生的声辐射场可以用于相对于中心通道330中的流来操纵颗粒，并且因此可以用于将颗粒从一个流移动到另一个流。中心通道330可以是由硬衬底(例如硅、玻璃或石英)或具有高声阻抗的聚合物(例如聚苯乙烯)制造的微通道。中心通道330的横截面可以是矩形，宽度和高度尺寸可以在100μm至1000μm的范围内。中心通道的长度可以在5mm至200mm的范围内。在图3所示的构造中，中心流体流的密度可以等于或大于侧流的密度。在一些实施方式中，可以使用添加剂来调整中心流的密度以实现所需的密度对比度。
38.在由压电换能器335产生的声辐射场的影响下，培养基可以主要保留在它们各自的流中，而在侧入口315a和315b中引入的细胞迁移到中心流中。可以从中心出口320收集具有细胞的中心流。流到侧出口325a和325b的培养基可以作为废弃物丢弃。因此，感兴趣的细胞从其初始培养基中移出并进入经由中心入口310引入的培养基中，该培养基可以被收集以引入后续阶段(例如，图1的第三阶段115)。
39.图4示出了可以用于实现图1的处理流的第三阶段的示例模块400。在模块400中，可以在连续流中对细胞进行电穿孔。模块400可以包括三个入口，包括中心入口410和两个侧入口415a和415b。模块400可以包括三个出口，包括中心出口420和两个侧出口425a和425b。中心通道430可以将三个入口与三个出口耦接。一对电极435a和435b可以与中心通道430耦接。在一些实施方式中，细胞和负荷可以经由中心入口410被引入低电导率培养基中的中心流中。与刺激电极435a和435b接触的高电导率培养基流可以经由侧入口415a和415b被引入，并且可以位于中心流的侧面。这种配置可以保持细胞不与电极435a和435b直接接触，同时将它们暴露于高量值电场。
40.在一些实施方式中，模块400可以向连续流中的靶细胞施加脉冲电场以暂时透化它们，使它们易于摄取负荷和基因操作。在一些实施方式中，中心通道430可以是由硬塑料(例如，环烯烃共聚物、kapton、聚苯乙烯、ultem等)制成的微通道，并且可以支持具有三个平行的层流的鞘流或共流配置。在一些实施方式中，模块400中的通道尺寸的范围可以是宽度为500μm至3mm，长度为1cm至5cm，高度为125μm至500μm。
41.电极435a和435b可以是被图案化到中心通道430的底板上的共面矩形电极。电极435a和435b可以具有100μm至250μm的宽度和8μm至45mm的长度的尺寸。在一些实施方式中，电极435a和435b可以经由到焊盘的连接与电源对接。在一些实施方式中，电极435a和435b可以位于远离中心通道430的壁50μm和300μm之间。电极435a和435b可以由电化学稳定的材料形成，例如铂。
42.中心通道430中的中心流体流可以含有悬浮在低电导率电穿孔缓冲液(例如，0.01-0.1s/m)中的细胞和负荷，其可以经由中心入口410引入。中心通道430中的侧流可以包括高电导率细胞培养缓冲液(例如，1-2s/m)。电穿孔的相关参数可以是侧流电导率与中心流电导率的比率。在一些实施方式中，该比率可以是20或更大。例如，当侧流传导率在20-40s/m的范围内时，中心流传导率可以在1-2s/m的范围内。可以调整中心通道430中的中心流与侧流相比的相对流速，使得电极435a和435b仅与侧流接触。在该配置中，中心流可以主导电路的电阻，使得当电压施加到电极435a和435b时，大部分电压在中心流上下降。在一些实施方式中，施加的电压可以采用周期范围为10ns至10ms的正弦曲线的形式。在一些实施
方式中，施加的电压可以采取脉冲宽度范围为10ns至10ms的脉冲串的形式。在一些实施方式中，施加的电压的量值可以变化，以便在中心流上产生范围为约2-600kv/m的电场，脉冲宽度范围为10ns至10ms。含有转染细胞的样本可以通过中心出口420收集，而来自侧出口425a和425b的培养基可以作为废弃物处理并丢弃。
43.在一些实施方式中，本文描述的微流体模块或装置(例如，模块200、模块300、模块400等)可以彼此互连以形成处理流，类似于本文结合图5a、5b和5c描述的处理流系统500。本文所述的微流体模块可以设置在层或衬底内。例如，每个微流体装置或通道可以设置在单个衬底片内，其可以形成层。在一些实施方式中，不同的衬底可以用于本文所述的一个或多个微流体模块或装置，并且每个衬底可以经由管道、其他微流体衬底通道或其他流体连接装置连接。此外，微流体阀可以与本文所述的任何其他微流体部件或特征(例如，泵、传感器、贮存器、废弃物瓶、夹管阀等)一起嵌入形成层的一个或多个微流体衬底中，以在流体流过微流体通道时控制流体的流动，类似于结合系统500描述的部件。
44.在一些实施方式中，微流体装置可以形成处理流的层的一部分，其可以通过跨多个平行层复用微流体通道来缩放。处理流中的每个层可以包括一个或多个微流体模块或装置(例如，模块200、模块300、模块400等)、在微流体模块或装置之间输送流体的微流体通道、以及其他微流体装置(例如，流体电容器、流体贮存器、阀、泵、本文所述的任何其他微流体特征等)。应当理解，微流体装置的任何层可以在处理流中的任何阶段包括任何数量的端口(例如，入口端口、出口端口等)，以引入流体或从特定层移除流体。端口可以包括一个或多个连接器(例如，螺纹连接器、卡扣连接器、摩擦配合连接器、压配合连接器等)，其可以联接到其他流体管线，例如来自一个或多个贮存器的流体管线。因此，在具有多层微流体装置或特征的实施方式中，可以通过多路复用从流体源到每个层的入口端口的流体管线来将来自该流体源的流体提供给多个层。
45.在一些实施方式中，来自一层的端口可以连接到另一层的端口，从而允许流体在每个层之间流动。多个层可用于形成微流体层和装置的堆叠。在一些实施方式中，微流体层堆叠可以具有与微流体堆叠中的其他层类似的部件，从而允许由微流体装置(例如，模块200、模块300、模块400等)限定的处理流被限定在微流体装置的平行网络中。平行层可以以横向层设计或通过添加用于诸如细胞分离或转导的步骤的微通道网络的垂直层来限定微流体路径(例如，下文结合图5a、5b和5c等描述的微流体路径或通道)的平行微流体部分。换句话说，可以使用一层或多层微流体装置来扩展或缩放处理流系统或微流体组件，所述微流体装置可以以横向(例如，顺序等)布置或平行布置或其任何组合布置。
46.图5a、5b和5c示出了用于实现与图1所示的处理流100类似的处理流的系统500的框图的部分。除了微流体装置之外，系统500还示出了连接和支撑所需的部件。在一些实施方式中，图5a、5b和5c中所示的至少一些微流体装置可以对应于图2-4的模块，其可以用于实施图1的处理流100的各阶段。微流体装置，例如图2-4的模块200、300和400的实例，以及阀、传感器和保持贮存器，分别以蓝色示出。图5a中包括图例，其指示用于系统500中的阻尼器和夹管阀的符号，如图5a、图5b和图5c所示。圆圈可以表示蠕动泵，其可以驱动流体通过系统500并且可以帮助维持正确的流速。
47.现在参考图5a，在系统500的前端，用户可以将培养基中的靶细胞沉积到保持贮存器505中。贮存器505可以具有搅拌机构以保持细胞悬浮，例如磁力驱动的叶轮。在一些实施
方式中，搅拌机构可以被配置成以足够温和而不损坏细胞的方式搅拌培养基。在系统500的前端处的贮存器500可以经由管道连接到声泳快速培养基交换装置的中心入口，该声泳快速培养基交换装置在图5a中被描绘为模块300。图5a的模块300可以是图3所示的模块300的实例。蠕动泵510可以使管道变形以致动通过模块300的流动。含有悬浮或溶解在电穿孔缓冲液中的待转染负荷(例如mrna)的另一个贮存器515可以连接到模块300的侧入口。来自模块300的废弃物可以收集在贮存器520中。另一个蠕动泵525可以将流从贮存器515驱动到模块300的侧流入口中。如上所述，模块300中的声场可以将细胞从侧流驱动到中心流中，并且它们可以从中心出口离开，悬浮在具有负荷的电穿孔培养基中。在模块300的出口处，侧流可以作为废弃物收集到贮存器520中。快速培养基交换模块300的中心出口可以通过管道连接到保持贮存器530的入口，该保持贮存器530可以具有搅拌机构以保持细胞悬浮。
48.现在参考图5b，图5a中描绘的保持贮存器530的出口可以通过管道连接到流通电导率测量传感器535，其可以连接到流式电穿孔设备的中心入口，其在图5b中表示为模块400。图5b的模块400可以是图4所示的模块400的实例。蠕动泵540可以驱动细胞悬浮流从保持贮存器530的出口流过电导率探针535，并流过电穿孔模块400的中心流。包含高电导率细胞培养基(例如，texmacs)的另一个外部贮存器545经由管道连接到模块400的侧入口。通过每个侧入口的流由另一对蠕动泵550和555驱动。当细胞通过模块400时，施加电压脉冲以转染它们。从模块400的侧出口出来的流体可以作为废弃物收集到贮存器560中。从模块400的中心出口出现的载有转染细胞的流体可以流入另一个保持贮存器565，其可以具有搅拌机构以帮助维持细胞悬浮。
49.现在参考图5c，来自图5b中描绘的保持保持贮存器565的细胞悬浮液可以通过作用在连接保持贮存器565和模块200的管道上的最终蠕动泵570而被驱动到图5c中表示为模块200的微流体声学单采模块的单个入口中。图5c的模块200可以是图2所示的模块200的实例。施加到模块200的声致动可以在模块200的出口处富集淋巴细胞的细胞悬浮液。将模块200出口处的样本作为最终产物(例如，转染的淋巴细胞)收集在贮存器575中。来自该模块200的废弃物出口的流体可以被收集在最终废弃物贮存器580中。如本文所述，每个模块(例如，模块200、300和400等)、泵(例如，泵510、525、540、550、555、570等)可以经由从控制器1005接收的一个或多个信号来控制。
50.在一些实施方式中，系统500的部件之间的连接可以使用各种类型的聚合物管来进行，包括例如可以通过蠕动泵进给的0.44”内径pvc管，可以在部件之间使用的1/8”和1/6”内径tygon管，以及用于与模块200、300和400接口的较小(例如，0.011
”‑
0.025”内径)硅胶管。根据需要，适配器也可以用于在不同尺寸的管道之间转换。
51.在一些实施方式中，如上所述，整个系统500中的流可以由一系列流体泵驱动。在一些实施方式中，这些泵可以是蠕动泵。因为蠕动泵中的流动固有地是脉动的，所以还可以在每个泵之后引入柔性流体电容器以平滑流速的波动，因为模块200、300和400可能需要稳定的流动以正确地起作用。出于说明的目的，由这些泵产生的标称流速在图5a、图5b和图5c中示出，然而应当理解，这些流速在其他实施方式中可以变化，并且这些流速可以随着系统500的操作而变化。在一些实施方式中，泵可以将流体和样本从贮存器移动到系统500中。因此，阀可被用于在用于启动和设置系统500的输入管线与用于使样本通过系统500的其他管线之间切换。在一些实施方式中，流传感器可以放置在流体路径中的各个位置处(例如，在
模块200、300和400的入口和出口处)，并且可以用于泵的反馈控制(例如，通过本文结合图10描述的控制器1005等)。
52.如图5a、图5b和图5c所示，在模块200、300和400中的每一个之间可以存在保持贮存器。这些保持贮存器可以提供压载(ballast)，以使系统500针对一个模块的输出与下一个模块的输入之间的意外流速差异是鲁棒的。在一些实施方式中，可以使用诸如磁驱动叶轮的搅拌机构来维持细胞悬浮并防止在这些保持贮存器中沉降。为了在各种部件(例如，基于声泳的部件)产生热量的同时将系统500保持在一致的温度，在一些实施方式中，可以使用用于模块200、300和400中的每一个的共享散热器或单独的散热器。这种散热器也可以与闭环热电冷却系统组合。
53.在一些实施方式中，传感器可以集成到系统500中，以使得能够询问系统500的操作故障和反馈或前馈控制机制。例如，传感器可以集成为系统范围的部件，或者直接集成到模块200、300和400中。可以集成到系统500中的可能的传感器包括用于控制流速、电导率探针、鞘流中的流宽度的视觉测量以及电流测量的流传感器。在一些实施方式中，光学传感器还可以用于评估系统500中使用的鞘流的质量，其又可以用于根据需要调整流速以产生正确的稳定流。在一些实施方式中，光学传感器也可以用于校准和调谐声泳模块，其中可以通过观察出口部分之一中的细胞浓度来自动确定压电部件的最佳驱动频率。
54.吸收度或阻抗传感器也可以并入系统500中，用于实时估计细胞浓度或细胞密度中的任一个或两个。这可以提供关于系统500中的处理吞吐量的信息，并且如果细胞恢复低，则可以帮助确定系统500中可能存在损失的位置。来自细胞浓度测量的信息可用于闭环控制，以调整模块200、300和400的入口或出口中的流速，调整声功率或频率，或调整系统500中试剂的自动添加。
55.在一些实施方式中，可以将传感器添加到模块200、300和400中的任何一个，或者添加到系统500中这些模块之间的位置，以指示由这些模块执行的功能的操作质量或效率。例如，可以将传感器添加到模块200中，或者在系统中模块200下游的点处，以指示或检测在模块200中发生的细胞的声泳分离的效率。这样的传感器可以被配置为在流体通过模块200期间或之后识别流体内的细胞。在一些实施方式中，可以将传感器添加到模块400或在模块400下游的点处，以指示由于模块400的操作而发生的转染的效率。这样的传感器可以确定多少负荷已经通过由模块400执行的电转染操作被引入流体样本的细胞中。在一些实施方式中，传感器可以包括在系统500中以监测细胞活力。
56.这些传感器中的任何一个可以提供实时输出，其也可以与控制系统(例如控制器1005)耦接，以用作反馈或前馈控制机构。例如，基于这样的传感器的输出，可以控制模块200、300和400中的任一个的可调整参数(例如，流体流速、流体样本比、施加的电压或电场等)。因此，可以将与电转染效率、分离效率或细胞活力相关的实时信息并入控制数据中，以在细胞处理期间改变系统500的操作特性。
57.在一些实施方式中，可以基于作为整体的系统500的特性来选择系统500的各个组件(诸如模块200、300和400)的控制以及各个组件的设计参数。例如，系统的部件的参数可以以相互依赖的方式选择，而不是针对每个单独的部件独立地选择。因此，一些部件可以被设计或控制为以小于该部件的最大可实现能力的能力(例如，流速)操作，以便整体上提高系统500的能力。在一些实施方式中，可以以这种方式选择的设计参数可以包括在系统500
被制造之后可能不可调整的特征，诸如尺寸特征(例如，通道高度、通道宽度、通道横截面积、通道横截面形状等)。即使参数选择单独地导致系统500的一个或多个组件的次优或降低的操作能力，也可以根据全局地改进系统500的操作的例程或算法来选择这些参数。
58.还应当理解，也可以以相同的方式选择或控制每个部件的可调整参数。对于可调整参数，合适值的选择可以随时间变化，即使在系统500的操作期间也是如此。可以以可以导致一个组件的吞吐量降低的方式选择可调整参数，以便实现系统500作为整体的提高的性能(例如，提高的总吞吐量、提高的细胞活力、提高的细胞分离效率等)。在一个示例中，电穿孔组件(诸如模块400)的参数可以被选择成降低该组件的吞吐量，以便全局地改善另一组件(例如，用于细胞分离的模块200)或系统500的性能。在一些实施方式中，可以使用可以结合机器学习的例程或算法来选择这种可调整参数以及固定或不可调整的设计参数，以便在全局范围上改善系统500的操作，而不是通过彼此独立地选择系统500的每个部件的参数。
59.如本文所述，图5a、5b和5c中描绘的处理流系统500的每个组件、通道或阶段可以被建立在一层或多层微流体装置上。例如，层可以以平行方式布置，其中每个微流体装置(例如，模块200、模块300、模块400等)跨平行微流体层复制，并且通过(例如，使用阀、接头或其他流体连接等)平行地跨一个或多个层多路复用流体流来馈送输入流体流。在一些实施方式中，微流体通道可以在单层上的不同部件(例如，模块200、300和400、本文所述的任何其他微流体特征或部件等)之间多路复用。上文结合图5a、图5b和图5c所述的泵可用于驱动流体流过一个或多个平行层或一个或多个横向层。在一些实施方式中，每个微流体层可以具有其自己的相应泵，其基于该特定层的条件(例如，由传感器提供给控制器，例如控制器1005等)驱动流体流动。
60.应当理解，传感器，例如上文所述的设置在图5a、5b和5c的系统500内的传感器，可以并入每个微流体层中。换句话说，上文所述的处理流系统500中的一些或全部可以嵌入单个微流体层中或形成为单个微流体层的一部分。通过平行或横向地复制所述层，可以在不影响系统吞吐量的情况下缩放处理流500。提供给控制器装置(例如，下文结合图10描述的控制器1005等)和从控制器装置提供的信号可用于独立地操纵和监测每层中的流体的流动。因此，控制器1005的功能可用于监测和控制本文所述的处理流系统500的缩放处理。
61.多层处理流配置具有许多显著的优点。微流体连续流系统(例如，本文所述的系统500等)在减少的处理时间和增加的安全性方面的一个优点源于以下事实：中间产物可以在完成处理步骤后立即以连续方式移动到下一操作。这种能力可以减少处理循环时间并通过避免由于重复不必要地暴露于高细胞力而导致的细胞损坏来提高安全性。因此，连续流处理流系统为细胞处理技术提供了显著的优点。然而，可能存在以分批模式执行处理可能是有益的情况(例如，以分批方式执行处理，并且一旦整个批次完成就将该批次移动到后续阶段等)。根据需要，通过将来自一个步骤的产物在其进入后续批处理之前保持在贮存器中，可以在单个系统内采用连续处理和批处理。在一些实施方式中，这样的批处理贮存器可以设置在单独的横向层或平行层的横向堆叠之间，每个横向层或平行层的横向堆叠限定批处理部分中的阶段。也就是说，连续流系统和批处理系统的缩放可以使用平行和横向层布置来缩放。
62.多个微流体装置(例如，模块200、300、400、本文所述的任何其他微流体特征等)可
以经由一个或多个微流体多路复用器连接在单层上。微流体多路复用器可以用于层中以限定微流体通道的互连网络之间的多个路径，并且可以用于限定上文结合图5a、5b和5c描述的处理流系统500的一个或部分或路径。微流体多路复用器可以包括一个或多个接合点、入口和出口，并且可以用于将流体从多个微流体通道引导通过一个或多个层。
63.图6示出了曲线图600，其示出了图4的模块400中的细胞所经历的电场。通常，递送到细胞的电场可能受到侧流溶液与中心流溶液相比的相对电导率以及侧流与中心流相比的相对流速的影响，这可以确定侧流与中心流相比的宽度。更高的电导率比可以导致跨中心流的更多压降和更高的电场量值。较高的流速比可以使中心流变窄，从而减小跨细胞的电压下降的距离，并增加电场量值。曲线图600示出了在通道宽度为1.5mm的电穿孔模块的一个实施方式中，对于65v的施加电压，细胞所经历的电场量值。图600中的红色虚线指示可以操作模块400的示例性流量比，并且框指示可用于将mrna递送至原代人t细胞的电场量值的范围。曲线图600没有考虑扩散的影响，扩散的影响会给电场增加空间不均匀性。这可以形成一种可能的前馈控制机制的框架，其中测量电导率并调整流速以实现期望的电场。下面进一步描述这种控制机制。
64.图7a-7d示出了用于控制图4的模块400中的细胞所经历的电场的示例性控制系统的框图。施加到模块400中的细胞的电场的量值(大小)可以是重要的参数。电场量值可以取决于施加的电压、模块400中的侧流动流和载有细胞的中心流动流的电导率的比率、以及载有细胞的中心流体流的宽度，载有细胞的中心流体流的宽度又可以取决于侧流动流和中心流动流的流速的比率。在一些实施方式中，所施加的电压可以由模块400的用户指示并且可以被很好地控制。流速比也可以由用户指示，并且如果实现使用流传感器的反馈控制机制，则可以很好地控制流速比。然而，在一些实施方式中，样本流的电导率可以根据样本的制备、所用负荷的量和类型以及细胞供体而变化。如图7a-7d所示，可以使用几种不同的机制来控制施加到模块400中的细胞的电场。图7a-7d中所示的任何控制机制可以由下文结合图10描述的控制器1005实现。
65.参考图7a，描绘了控制系统700。控制系统700是前馈控制系统，其中可以在模块400的上游测量细胞和负荷悬浮液电导率。使用控制系统700，可以响应于电导率变化来调整侧流和中心流的流速比，以实现期望的(例如，预定的)电场。参考图7b，描绘了控制系统720。类似于图7a的控制系统700，图7b的控制系统720也是前馈控制系统，其中可以在模块400的上游测量细胞和负荷悬浮液电导率。使用控制系统720，调整施加的电压，而不是如图7a的控制系统700中所示的侧流和中心流的流速，以实现期望的电场。
66.参考图7c，描绘了控制系统740。控制系统740是反馈控制系统，而不是如图7a和7b所示的前馈控制系统。使用控制系统700，可以使用模块400中的中心流宽度、溶液电导率和电流的测量值来计算施加的电场，并且可以调整流速比以达到期望的设定点。图7d示出了也实现反馈控制系统的控制系统760。使用控制系统760，可以使用模块400中的中心流宽度、溶液电导率和电流的测量值来计算施加的电场，并且可以调整施加的电压(而不是流速比)以达到期望的设定点。
67.为了考虑伴随样本电导率变化的电场量值变化，可以通过图7a-7d的系统(例如，使用图10中描绘的控制器1005等)实现电场的前馈或反馈控制(或前馈和反馈控制)。在一些实施方式中，可以在模块400的上游测量电导率。在前馈控制系统中，该信息可用于调整
侧流和中心流流速比以缩小或加宽载有细胞的中心流，或调整施加的电压，或者既调整流速比又调整施加的电压。在一些实施方式中，可以使用光学传感器直接测量中心流的宽度，并且通过模块400的电流可以在向细胞施加电场波形期间被测量。在一些实施方式中，电导率传感器可以放置在模块400的侧出口处，并且出口处的电导率测量可以用于估计中心流的宽度。结合溶液电导率的测量，该信息可用于计算递送到细胞的电场量值的空间平均值。
68.在一些实施方式中，电场测量可以用于反馈控制。例如，可以调整侧流或中心流流速比或施加的电压中的任一个或两个以接近期望的电场量值设定点。在一些实施方式中，传感器电极可以集成到模块400中。例如，这种传感器电极可以实现为位于通道底板上的薄膜电极。这种传感器电极可用于直接测量施加的电场。在一些实施方式中，反馈和前馈控制机制可以串联使用。
69.为了证明本公开内容的系统和方法的功能，将leukopak样本(白细胞去除术产物)引入类似于图5a、5b和5c中所示的系统500的系统中，并处理以产生瞬时表达称为mcherry的荧光报告蛋白的淋巴细胞。因为微流体电转染模块(例如，图4的模块400)可能需要细胞和负荷悬浮在低电导率培养基中(例如，比用于鞘流的培养基低约20倍)，所以在电穿孔之前使用类似于模块300的模块将靶细胞声泳移动到电穿孔培养基中。这种电导率的降低不能通过在低电导率电穿孔培养基中简单地稀释起始细胞样本来实现，因为血液制品中的组分干扰电转染。直接稀释方法可能需要至少1:10 0的样本与稀释剂的比例以使电转染成为可能，即使在不明确需要低电导率培养基的商业批量电穿孔设备中也是如此，如图8的曲线图800所示。然而，1:100或更大的稀释度也可以将靶细胞密度降低至0.25-0.35m细胞/ml。在1ml/min的流速下，10亿个细胞将需要多天来处理，这在一些情况下可能是处理用于细胞治疗的患者样本的不可接受的吞吐量水平。因此，其中将细胞重悬于培养基中用于电穿孔的活性培养基交换步骤可以是有用的。这传统上是使用离心法的触摸劳动密集型批处理过程来完成的。为了解决该技术挑战，本公开提供了图3所示的模块300，以使用声泳自动且连续地实现交换。
70.使用图5a、5b和5c中所示的系统500的处理流和参数处理含有约5亿个原代人淋巴细胞的leukopak样本。使用高压釜或环氧乙烷对所有组件和管道进行灭菌，并将其组装在生物安全柜中进行无菌操作。在引入系统500之前，将leukopak样本离心，并将细胞在texmacs中重新悬浮在1：2稀释液中，以降低细胞溶液重量密度，维持合理的细胞浓度，并减少处理时间和所需mrna的量。使用图3中所示的快速培养基交换模块300将靶细胞移动到含有编码mcherry的mrna(32μg/ml)的电穿孔缓冲液中，使用图4中所示的微流体电转染模块400进行电穿孔(165kv/m下的三个250μs脉冲)，最后使用图2中所示的微流体声学单采模块200对淋巴细胞进行富集。整个过程在约3.5小时内以连续流自动完成。转染效率超过75％，并且大于使用商业批量电穿孔方法转染的对照样本的转染效率，如图9a的图900所示。此外，相对于输入样本没有可测量到的活力降低，如图9b的图910所示，并且淋巴细胞群从约56％富集至约76％，如图9c的图920所示。
71.现在参考图10，描绘了用于控制在类似于图5a、5b和5c中描绘的系统500的系统中流动的流体所经历的流速或电场的示例系统1000的框图。系统1000可以用于实现图7a、图7b、图7c和图7d中描绘的控制系统。系统1000可以包括至少一个控制器1005、一个或多个传感器1040、一个或多个泵1050和一个或多个电信号发生器1055。控制器1005可以包括至少
一个电场识别器1010、至少一个传感器数据接收器1015、至少一个预期电场计算器1020、至少一个调整电压计算器1025、至少一个调整流速计算器1030和至少一个信号提供器1035。
72.系统1000的每个部件(例如，控制器1005、传感器1040、泵1050等)可以使用硬件部件或软件与计算系统(例如，本文结合图1200详述的计算系统1200、本文描述的任何其他计算系统等)的硬件部件的组合来实现。控制器1005的每个部件(例如，电信号发生器1055、电场识别器1010、传感器数据接收器1015、预期电场计算器1020、调整电压计算器1025、调整流速计算器1030、信号提供器1035等)可以执行本文详述的任何功能。控制器1005或其部件可以执行上文结合图7a、图7b、图7c和图7d描述的任何活动。
73.控制器1005可以包括至少一个处理器和存储器，例如处理电路。存储器可以存储处理器可执行指令，该处理器可执行指令在由处理器执行时使处理器执行本文描述的一个或多个操作。处理器可以包括微处理器、专用集成电路、现场可编程门阵列等或其组合。存储器可以包括但不限于能够向处理器提供程序指令的电子、光学、磁性或任何其他存储或传输设备。存储器还可以包括软盘、cd-rom、dvd、磁盘、存储器芯片、asic、fpga、只读存储器(rom)、随机存取存储器(ram)、电可擦除可编程rom(eeprom)、可擦除可编程rom(eeprom)、闪存、光学介质或处理器可以从其读取指令的任何其他合适的存储器。指令可以包括来自任何合适的计算机编程语言的代码。控制器1005可以包括任何或所有部件，并且执行本文结合图12描述的计算机系统1200的任何或所有功能。
74.多个传感器1040(有时称为“一个传感器1040”)可以是可以从控制器1005或其部件发送或接收数据的一个或多个传感器。传感器可以包括或类似于上面结合图5a-5c描述的流通电导率传感器535、流速传感器、光学传感器或如本文所述的其他类型的传感器。例如，传感器1040可以是集成到系统500或其他类似的流动系统中的任何传感器，以使得能够询问(例如，通过控制器1005的部件等)系统500的操作故障和反馈或前馈控制机制。例如，传感器可以集成为系统范围的部件，或者直接集成到模块200、300和400或本文所述的任何其他模块、贮存器、阀或流结构中。可以集成到系统500或其他类似的流系统中的可能的传感器包括用于控制流速、电导率探针、鞘流中的流宽度的视觉测量以及电流测量的流传感器。在一些实施方式中，光学传感器还可以用于评估系统500中使用的鞘流的质量，其又可以用于根据需要调整流速以产生正确且稳定的流。在一些实施方式中，光学传感器也可以用于校准和调谐声泳模块，其中可以通过观察出口部分之一中的细胞浓度来自动确定压电部件的最佳驱动频率。
75.传感器1040可以包括一个或多个吸收度或阻抗传感器，其也可以并入系统500或其他类似的流系统中，用于实时估计细胞浓度或细胞密度中的任一个或两个。这可以向控制器1005的部件提供关于系统500中的处理吞吐量的信息，并且如果细胞回收率低，则可以用于确定系统500或其他类似的流系统中可能存在损失的位置。来自细胞浓度测量的信息可用于闭环控制，以调整模块200、300和400的入口或出口中的流速，调整声功率或频率，或调整系统500或其他类似流系统中试剂的自动添加。
76.传感器1040可以添加到本文所述的任何模块(例如，模块200、300和400等)或添加到所述模块之间的流体系统(例如，系统500等)中的位置，以指示流系统和其中的模块的操作质量或效率。例如，传感器1040可以添加到分离模块(例如，模块200等)中，或者在分离模块下游的系统中的点处，以指示或检测在分离模块中发生的细胞的声泳分离的效率。这样
的传感器可以被配置成在流体通过分离模块期间或之后识别流体内的细胞。在一些实施方式中，可以将传感器添加到电穿孔模块(例如，模块400等)中，或添加在电穿孔模块下游的点处，以指示由于电穿孔模块的操作而发生的转染的效率。这样的传感器1040可以确定已经将多少负荷通过由模块400执行的电转染操作引入流体样本的细胞中。在一些实施方式中，传感器可以包括在系统500中以监测细胞活力。传感器1040可包括电导率探针，该电导率探针在流体流过电穿孔设备(诸如模块400)时测量流体的电导率。传感器1040可包括电流传感器，当流体流过电穿孔设备(诸如模块400)时，该电流传感器测量通过流体的电流。传感器1040可包括光学传感器，该光学传感器在流体通过电穿孔设备(诸如模块400)时测量流体的中心部分的宽度。
77.传感器1040可以经由一个或多个通信接口向控制器1005或其中的部件提供实时输出。从传感器1040接收的信息可以用作反馈或前馈控制机制的一部分。例如，基于这样的传感器的输出，可以控制模块200、300和400中的任一个的可调整参数(例如，流体流速、流体样本比、施加的电压或电场等)。因此，可以将与电转染效率、分离效率或细胞活力相关的实时信息并入控制数据中以在细胞处理期间改变系统500或类似流系统的操作特性。
78.泵1050可以使流体流过流体流系统中的一个或多个管道或通道，流体流系统例如本文结合图5a-5c描述的系统500。泵1050可以包括例如上文结合图5a-5c描述的泵510、泵525、泵540、泵550、泵555或泵570。泵1050可以是蠕动泵或本文所述的任何其他类型的泵。泵1050可以用于在类似于图5a-5c中描绘的系统500的整个流体系统中输送流体。泵1050可以与一个或多个流体连接器、流体贮存器、流体电容器或其他流体联接。泵1050输送流体的速率可以由从控制器(例如控制器1005(或其部件))接收的信号控制。例如，来自控制器1005的信号可以使一个或多个泵1050以期望的流速流动流体。可以在从控制器1005接收的信号中指示期望的流速。该信号可以是引起蠕动泵致动的电压信号，或者可以是可以调制或控制泵1050中的一个或多个可以输送流体的速率的另一类型的信号。
79.电信号发生器1055可以是上文结合图4描述的模块400的一部分。例如，电信号发生器1055可以跨上文所述的电极435a和435b产生期望电压。期望电压可以由从控制器1005(或其部件)接收的信号指示。电信号发生器1055可以是电压源，例如直流(dc)电压源或交流(ac)电压源。在一些实施方式中，电信号发生器1055可以是电流源，诸如dc源或ac源。电信号发生器1055可以电耦接到一个或多个电极，例如电极435a和435b。电信号发生器1055可以在一个或多个电极上产生电压差，从而形成电场。当电极耦接到一个或多个流体通道时，如在图4的模块400中，电信号发生器1055可以在流过模块的流体中产生电场。在一些实施方式中，由电信号发生器施加的电压可以采用周期范围为10ns至10ms的正弦曲线的形式。在一些实施方式中，由电信号发生器施加的电压可以采取脉冲宽度范围为10ns至10ms的脉冲串的形式。在一些实施方式中，由电信号发生器1055施加的电压的大小(量值)可以变化，以便在中心流上产生范围为约2-600kv/m的电场，脉冲宽度范围为10ns至10ms。然而，应当理解，其他的电场脉冲类型、电压量值和电场量值是可能的。
80.现在参考控制器1005的功能，电场识别器1010可以识别在流过电穿孔设备的流体中引起的期望电场量值。识别期望的电场可以包括从一个或多个外部源(诸如经由输入接口的用户输入)、从加载到控制器1005的存储器中的配置文件、或从内部设置(例如，诸如跳线的硬件设置等)接收期望的电场。在一些实施方式中，期望的电场可以作为一个或多个数
据结构中的变量存储在控制器1005的存储器中。在具有多于一个电穿孔设备(例如，多于一个模块400等)的流体系统中，电场识别器1010可识别每个电穿孔设备的期望电场量值的值。在这样的实施方式中，每个期望电磁场量值的值可以与量值的值所对应的电穿孔设备的标识符相关联地存储在一个或多个数据结构中。
81.传感器数据接收器1015可从传感器1040接收传感器值，包括流入或通过电穿孔设备的流体的电导率或流速。传感器数据接收器1015可以从传感器1040接收一个或多个信号，其表示流体的电导率的数值、流体的流速或其他传感器数据等。在一些实施方式中，传感器数据接收器1015可以响应于用户输入、基于周期性调度或另一类型的传感器查询过程，在预定的基础上查验或查询传感器1040中的一个或多个。响应于查询，传感器可以经由一个或多个通信接口发送或传输传感器信息，该传感器信息包括表示流体的物理性质的数值(例如，中心通道的宽度、流过流体的电流、管道或通道中的流体的流速、通过如本文所述的模块200、模块300或模块400中的任一个的流速等)或流体系统(例如，系统500等)的其他性质的数值。由传感器数据接收器1015从传感器1040接收的传感器信息可以以一个或多个数据结构存储在控制器1005的存储器中。传感器信息可以与各种标识符一起存储，例如，与进行传感器测量或接收传感器测量的时间相对应的时间戳，或者提供传感器测量的传感器1040的标识符等。
82.预期电场计算器1020可在流体流过电穿孔设备时确定流体中的预期电场量值。可以基于电穿孔设备中的流体流的电导率和由电信号发生器产生的电压来计算预期电场。例如，可使用欧姆定律计算电场强度，以确定流过电穿孔设备(例如，本文结合图4描述的模块400等)的流体所经历的预期电场量值。如图4所示，模块400可以接收中心流和两个侧流作为输入。在非湍流流动中，从每个输入通道接收到中心通道430中的流体可以不混合，而是保持与输入到模块400时的流相对应的流形状。每种流体的电导率可以不同。例如，电穿孔缓冲液中(例如，在中心通道等中)的细胞溶液可以具有比由侧通道提供的缓冲溶液更低的电导率。
83.当向中心通道施加电压电位时，每个流体流(例如，从中心入口410接收的流体流、由侧入口415a和415b接收的缓冲溶液等)可以在其宽度上经历不同的电压降，因此经历不同的电场。可以使用电场等式计算电场量值，其中e是电场量值，v
ab
是流体流上的电压降，并且d是流体流的宽度。由于从侧通道接收的缓冲溶液是高度导电的，因此可以假设跨中心通道(例如，包含待电穿孔的细胞的通道等)经历的电压降可以约等于跨电极的电压降。
84.因此，在一些实施方式中，由电信号发生器1055提供的电压可以是已知的，并且计算电场将基于电穿孔设备中的中心流的宽度(或在一些实施方式中，一个或多个其他通道的宽度)。如本文所述，中心流在流过中心通道430时的宽度可以是侧通道的流速与中心流的流速之比的函数。因此，可以使用侧通道的流速与中心流的流速的比率来估计中心流的宽度。该宽度可以用在具有电极415a和415b上的已知电压的上述等式中，以计算预期电场量值。如上文所述，侧通道和中心流的流速可以例如从传感器1040中的一个或多个接收。在一些实施方式中，中心腔室中的流体所经历的电压降可基于从侧通道415a及415b接收的流体及从中心通道420接收的流体的相对电导率而改变。如果进入中心通道的流体的电导率
是已知的(例如，从传感器1040中的一个或多个接收)，则可以使用分压器等式来计算中心流上的电压降。然后，电压降可以与中心流的估计宽度一起用于上面的等式中，以计算模块400中的中心流所经历的预期电场量值。
85.在一些实施方式中，预期电场计算器1020可以基于流过电场的流体的电导率、产生电场的电流和流体的中心流的宽度来确定预期电场量值。例如，模块400包括经由中心入口410引入到中心通道430的流体的中心部分。在一些实施方式中，传感器1040中的一个或多个(例如，光学传感器等)可以提供对应于中心流的宽度、中心流和侧流的电导率以及流过中心流和侧流的电流的值。使用这些值，可以计算预期电场强度。例如，可以通过将流过流的电流量除以相应流的电导率值来计算中心流和侧流上的电压降。使用从光学传感器接收的宽度值与上述等式，可以计算中心流在流过模块400时所经历的电场强度。中心通道(或流过模块400的其他流体)经历的预期电场可以存储在控制器1005的存储器中的一个或多个数据结构中。
86.调整电压计算器1025可以基于预期电场量值和期望电场量值来计算电信号发生器的调整电压。调整电压计算器1025可以计算流过模块400的流体所经历的电场量值与期望电场量值之间的差值(例如，通过减法等)。在一些实施方式中，调整电压计算器1025可以计算预期电场量值和期望电场量值之间的百分比差。因为电场与模块400中的中心流上的电压降成比例，所以调整电压计算器1025可以通过将电信号发生器1055的当前电压设置乘以百分比差来计算调整电压。例如，如果期望电场强度是中心流中的预期(例如，估计的)电场强度的200％，则调整电压计算器1025可以将调整电压计算为2.00*vc，其中vc是电信号发生器的当前电压设置。在一些实施方式中，控制器可以在一组操作条件(诸如图6中描绘的操作条件)内调整电压。
87.调整流速计算器1030可基于电导率值、电穿孔设备中的电流和流体的中心部分的宽度来计算进入电穿孔设备(诸如模块400)的一个或多个流体流的调整流速。在一些实施方式中，调整流速计算器1030可以基于第一流速或第二流速中的至少一个来计算用于第一流体或第二流体中的至少一个的调整流速。调整流速计算器1030可以确定由模块400的中心通道430接收的中心流或侧流中的一个或多个的调整流速。如本文所述，中心通道的宽度可以与中心通道经历的电场强度成反比。此外，中心通道的宽度可以是侧流的流速与中心流的流速之比的函数。因此，在一些实施方式中，调整流速计算器1030可以通过增加或减小侧流的流速来计算用于侧流的调整流速，以改变中心流的宽度。例如，如果预期电场量值小于期望电场量值，则调整流速计算器1030可以增加侧流的流速。在一些实施方式中，调整流速计算器1030可以减小中心流的流速以增加预期电场量值。同样，如果预期电场量值大于期望电场量值，则调整流速计算器1030可以降低侧流的流速。在一些实施方式中，调整流速计算器1030可以增加中心流的流速以减小预期电场强度。
88.在一些实施方式中，调整流速计算器1030可以调整中心流流速和侧流流速两者(例如，减小中心流流速并增加侧流流速、增加中心流流速并减小侧流流速、增加中心流流速和侧流流速两者、减小中心流流速和侧流流速两者等)。由调整流速计算器1030计算的流速的调整值可以存储在例如控制器1005的存储器中的一个或多个数据结构中。在一些实施方式中，每个调整流速值可以与控制正在被调整的流速的泵的标识符相关联地存储。应当理解，由调整流速计算器1030调整的流速值对应于存储在控制器1005的存储器中的值，该
值用于确定泵1050将流体传输通过流体系统(例如，系统500等)的速度或频率。
89.信号提供器1035可以向电信号发生器1055提供表示调整电压的一个或多个信号。信号可使电信号发生器1055在电穿孔设备中产生电压。例如，信号可以包括增加或减小由电信号发生器生成的一个或多个电信号的量值的指示。在一些实施方式中，信号可以是表示与由调整电压计算器1025计算的调整电压值成比例的值的模拟信号。在一些实施方式中，信号可以是表示与由调整电压计算器1025计算的调整电压值成比例的值的数字信号。由信号提供器1035生成和传输的信号可以在调整值由调整电压计算器1025或调整流速计算器1030计算时实时传输。在一些实施方式中，信号提供器1035可以控制电信号发生器1055产生通过模块400的中心通道430的电脉冲的频率。
90.信号提供器1035可以向控制第一流体(例如，侧流中的流体等)或第二流体(例如，中心流中的流体)的流动的泵提供表示调整流速的第二信号，使得第一流体或第二流体以第二调整流速流动。例如，信号提供器1035可以访问控制器1005的存储器以检索每个侧流和中心流的调整流速值。在一些实施方式中，信号提供器1035可以在调整流速值由调整流速计算器1030生成时检索调整流速值。信号提供器1035可以将信号传输到一个或多个泵1050，使得泵1050以由调整流速计算器1030计算的调整流速致动和传输流体通过模块400的中心通道430。在一些实施方式中，信号可以是表示与由调整流速计算器1030计算的调整流速值(例如，用于一个或多个侧流或中心流等)成比例的值的模拟信号。在一些实施方式中，信号可以是表示与由调整流速计算器1030计算的调整流速值成比例的值的数字信号。在一些实施方式中，信号提供器1035可以控制泵1050(例如，传输使泵1050周期性地致动的信号等)。在这样的实施方式中，信号提供器1035将信号传输到泵1050以使泵1050致动的频率可以是基于调整流速值的。
91.现在参考图11，描绘了用于控制在类似于图5a、5b和5c中描绘的系统中流动的流体所经历的流速或电场的示例方法1100的流程图。该方法可以例如由控制器装置(例如，控制器1005、计算机系统1200等)执行。在方法1100的简要概述中，方法1100可包括识别期望电场量值(框1102)，接收通过电穿孔设备(例如，模块400等)的流体流的电导率(框1104)，确定在电穿孔设备中流动的流体中的预期电场量值(框1106)，计算用于电信号发生器的调整电压(框1108)，向电信号发生器提供表示调整电压的信号(框1110)。
92.在方法1100的进一步细节中，方法1100可以包括识别期望电场量值(框1102)。识别期望电场可以包括从一个或多个外部源(诸如经由输入接口的用户输入)、从加载到控制器的存储器中的配置文件、或从内部设置(例如，诸如跳线的硬件设置等)接收期望电场。在一些实施方式中，期望电场可以作为变量存储在控制器的存储器中的一个或多个数据结构中。在具有多于一个电穿孔设备(例如，多于一个模块400等)的流体系统中，控制器可识别用于每个电穿孔设备的期望电场量值的值。在这样的实施方式中，每个期望的电磁场量值的值可以与量值的值所对应的电穿孔设备的标识符相关联地存储在一个或多个数据结构中。
93.方法1100可包括接收通过电穿孔设备(例如，模块400等)的流体流的电导率(框1104)。控制器可以从传感器(例如，传感器1040等)接收表示流体的电导率、流体的流速的数值或其他传感器数据等的一个或多个信号。在一些实施方式中，控制器可以响应于用户输入，基于周期性调度或另一类型的传感器查询过程，在预定的基础上查验或查询一个或
多个传感器。响应于查询，传感器可以经由一个或多个通信接口发送或传输传感器信息，该传感器信息包括表示流体的物理性质(例如，中心通道的宽度、流过流体的电流、管道或通道中的流体的流速、通过如本文所述的模块200、模块300或模块400中的任一个的流速等)的数值或流体系统(例如，系统500等)的其他属性的数值。由控制器从传感器接收的传感器信息可以存储在控制器的存储器中的一个或多个数据结构中。传感器信息可以与各种标识符一起存储，例如，与进行或接收传感器测量的时间相对应的时间戳，或者提供传感器测量的传感器的标识符等。
94.方法1100可包括确定在电穿孔设备中流动的流体中的预期电场量值(框1106)。可以基于电穿孔设备中的流体流的电导率和由电信号发生器产生的电压来计算预期电场。例如，可使用欧姆定律计算电场强度，以确定流过电穿孔设备(例如，本文结合图4描述的模块400等)的流体所经历的预期电场量值。如图4所示，模块400可以接收中心流和两个侧流作为输入。在非湍流流动中，从每个输入通道接收到中心通道430中的流体可以不混合，而是保持与输入到模块400时的流相对应的流形状。每种流体的电导率可以不同。例如，电穿孔缓冲液中(例如，在中心通道等中)的细胞溶液可以具有比由侧通道提供的缓冲溶液更低的电导率。
95.当向中心通道施加电压电位时，每个流体流(例如，从中心入口410接收的流体流、由侧入口415a和415b接收的缓冲溶液等)可以在其宽度上经历不同的电压降，因此经历不同的电场。可以使用电场等式计算电场量值，其中e是电场量值，v
ab
是流体流上的电压降，并且d是流体流的宽度。由于从侧通道接收的缓冲溶液是高度导电的，因此可以假设跨中心通道(例如，包含待电穿孔的细胞的通道等)经历的电压降可以约等于跨电极的电压降。
96.因此，在一些实施方式中，由电信号发生器(例如，电信号发生器1055等)提供的电压可以是已知的，并且计算电场将基于电穿孔设备中的中心流的宽度(或在一些实施方式中，一个或多个其他通道的宽度)。如本文所述，中心流在流过中心通道430时的宽度可以是侧通道的流速与中心流的流速之比的函数。因此，可以使用侧通道的流速与中心流的流速的比率来估计中心流的宽度。该宽度可以用在具有电极415a和415b上的已知电压的上述等式中，以计算预期电场量值。如上文所述，侧通道和中心流的流速可以例如从与控制器通信的一个或多个传感器接收。在一些实施方案中，中心腔室中的流体所经历的电压降可基于从侧通道415a及415b接收的流体及从中心通道420接收的流体的相对电导率而改变。如果进入中心通道的流体的电导率是已知的(例如，从传感器1040中的一个或多个接收)，则可以使用分压器等式来计算中心流上的电压降。然后，电压降可以与中心流的估计宽度一起用于上面的等式中，以计算模块400中的中心流所经历的预期电场量值。
97.在一些实施方式中，控制器可以基于流过电场的流体的电导率、产生电场的电流和流体的中心流的宽度来确定预期电场量值。例如，模块400包括经由中心入口410引入到中心通道430的流体的中心部分。在一些实施方式中，一个或多个传感器(例如，光学传感器等)可以提供对应于中心流的宽度的值、中心流和侧流的电导率的值以及流过中心流和侧流的电流的值。使用这些值，可以计算预期电场强度。例如，可以通过将流过流的电流量除以相应流的电导率值来计算中心流和侧流上的电压降。使用从光学传感器接收的宽度值与
上述等式，可以计算中心流在流过模块400时所经历的电场强度。中心通道(或流过模块400的其他流体)经历的预期电场可以存储在控制器的存储器中的一个或多个数据结构中。
98.方法1100可以包括计算用于电信号发生器的调整电压(框1108)。控制器可以基于预期电场量值和期望电场量值来计算用于电信号发生器的调整电压。控制器可以计算流过模块400的流体所经历的电场量值与期望电场量值之间的差值(例如，通过减法等)。在一些实施方式中，控制器可以计算预期电场量值和期望电场量值之间的百分比差值。因为电场与模块400中的中心流上的电压降成比例，所以控制器可以通过将控制器的当前电压设置乘以百分比差来计算调整电压。例如，如果期望电场强度是中心流中的预期(例如，估计的)电场强度的200％，则控制器可以将调整电压计算为2.00*vc，其中vc是电信号发生器的当前电压设置。在一些实施方式中，控制器可以在一组操作条件(诸如图6中描绘的操作条件)内调整电压。
99.控制器可基于电导率值、电穿孔设备中的电流和流体的中心部分的宽度来计算进入电穿孔设备(诸如模块400)的一个或多个流体流的调整流速。在一些实施方式中，控制器可以基于第一流速或第二流速中的至少一个来计算用于第一流体或第二流体中的至少一个的调整流速。控制器可以确定由模块400的中心通道430接收的中心流或侧流中的一个或多个的调整流速。如本文所述，中心通道的宽度可以与中心通道经历的电场强度成反比。此外，中心通道的宽度可以是侧流的流速与中心流的流速之比的函数。因此，在一些实施方式中，控制器可以通过增加或减小侧流的流速来计算侧流的调整流速，以改变中心流的宽度。例如，如果预期电场量值小于期望电场量值，则控制器可以增加侧流的流速。在一些实施方式中，控制器可以降低中心流的流速以增加预期电场量值。同样，如果预期电场量值大于期望电场量值，则控制器可以降低侧流的流速。在一些实施方式中，控制器可以增加中心流的流速以降低预期电场强度。
100.方法1100可以包括向电信号发生器提供表示调整电压的一个或多个信号(框1110)。信号可使电信号发生器(例如，电信号发生器1055等)在电穿孔设备中产生电压。例如，信号可以包括增加或减小由电信号发生器生成的一个或多个电信号的量值的指示。在一些实施方式中，信号可以是表示与在框1108中由控制器计算的调整电压值成比例的值的模拟信号。在一些实施方式中，信号可以是表示与调整电压值成比例的值的数字信号。在一些实施方式中，控制器可以控制电信号发生器产生通过模块400的中心通道430的电脉冲的频率。
101.在一些实施方式中，控制器可以向控制第一流体(例如，侧流中的流体等)或第二流体(例如，中心流中的流体)的流动的泵提供表示调整流速的第二信号，使得第一流体或第二流体以第二调整流速流动。控制器可以在框1108中生成调整流速值时检索调整流速值。控制器可以将信号传输到一个或多个泵(例如，泵1050等)，使泵以调整流速致动和传输流体通过模块400的中心通道430。在一些实施方式中，信号可以是表示与调整流速值成比例的值的模拟信号(例如，对于一个或多个侧流或中心流等)。在一些实施方式中，信号可以是表示与调整流速值成比例的值的数字信号。在一些实施方式中，控制器可以控制泵(例如，传输使泵周期性地致动的信号等)。在这样的实施方式中，控制器将信号传输到泵的频率可以是基于调整流速值。
102.图12示出了根据一些实施方式的可以用于实现本文讨论的任何计算机系统的说
明性计算机系统1200的一般架构。计算机系统1200可以用于类似于本文结合图10描述的系统1000的控制系统中。计算机系统1200可以控制一个或多个其他装置1230，其可以包括一个或多个泵(例如，泵1050、本文所述的任何其他泵等)、一个或多个电信号发生器(例如，电信号发生器1055、本文所述的任何其他电信号发生器等)或可以使用一个或多个信号控制的任何其他类型的装置或系统。图12的计算机系统1200包括通信地耦接到存储器1225的一个或多个处理器1220、一个或多个通信接口1205、以及一个或多个输出设备1210(例如，一个或多个显示单元)和一个或多个输入设备1215。处理器1220可以包括在本文描述的任何计算装置中。
103.在图12的计算机系统1200中，存储器1225可以包括任何计算机可读存储介质，并且可以存储计算机指令，诸如用于实现本文针对相应系统描述的各种功能的处理器可执行指令，以及由其生成或经由通信接口或输入设备(如果存在)接收的与其相关的任何数据。再次参考图12的系统1200，计算机系统1200可以包括存储器1225，以存储信息、变量、向量、数据结构或本文描述的其他计算机可读信息等中的任何信息。图12中所示的(一个或多个)处理器1220可以用于执行存储在存储器1225中的指令，并且在这样做时，还可以从存储器读取或向存储器写入根据指令的执行处理和/或生成的各种信息。
104.图12所示的计算机系统1200的处理器1220还可以通信地耦接到或控制通信接口1205，以根据指令的执行来发送或接收各种信息。举例来说，通信接口1205可耦接到有线或无线网络、总线或其它通信装置，且因此可允许计算机系统1200将信息传送到其它装置(例如，其它计算机系统)或从其它装置(例如，其它计算机系统)接收信息。虽然未在图12的系统中明确示出，但是一个或多个通信接口促进系统1200的组件之间的信息流。在一些实施方式中，通信接口可以被配置(例如，经由各种硬件组件或软件组件)为提供一个或多个接口(例如，应用接口、命令行接口、网站接口等)作为对计算机系统1200的至少一些方面的访问门户。通信接口1205的示例包括用户接口(例如，网页)、网络接口、网络端口、命令行协议或用户可以通过其与计算机系统1200通信的任何其他类型的通信接口。
105.通信接口1205可以包括一个或多个传感器接口，以从本文描述的任何传感器(包括本文结合图10描述的传感器1040)发送和接收信息。通信接口1205可以发送或接收控制本文描述的其他系统(包括系统500或系统1000)的参数的一个或多个信号。可以由计算机系统1200控制的一些示例参数包括一个或多个流体接合点之间的流速(例如，通过将信号传输到一个或多个泵以改变流体的流速等)，或由电信号发生器(例如，电信号发生器1055等)或本文所述的任何其他可控装置(例如，阀等)产生的电压。
106.可以提供图12中所示的计算机系统1200的输出设备1210，例如，以允许结合指令的执行来查看或以其他方式感知各种信息。例如，可以提供(一个或多个)输入设备1215以允许用户在指令的执行期间进行手动调整、进行选择、输入数据或以各种方式中的任何一种与处理器交互。本文进一步提供了与可以用于本文讨论的各种系统的通用计算机系统架构有关的附加信息。
107.本说明书中描述的一些主题和操作的实施方式可以在数字电子电路中实现，或者在有形介质上体现的计算机软件、固件或硬件中实现，包括本说明书中公开的结构及其结构等同物，或者它们中的一个或多个的组合。本说明书中描述的主题的实施方式可以实现为一个或多个计算机程序，例如，计算机程序指令的一个或多个组件，其编码在计算机存储
介质上以供数据处理装置执行或控制数据处理装置的操作。程序指令可以被编码在人工生成的传播信号上，例如，机器生成的电、光或电磁信号，其被生成以编码信息以便传输到合适的接收器装置以供数据处理装置执行。计算机存储介质可以是计算机可读存储设备、计算机可读存储基板、随机或串行存取存储器阵列或设备、或者它们中的一个或多个的组合，或者被包括在其中。此外，虽然计算机存储介质不是传播信号，但是计算机存储介质可以包括在人工生成的传播信号中编码的计算机程序指令的源或目的地。计算机存储介质还可以是一个或多个单独的物理组件或介质(例如，多个cd、磁盘或其他存储设备、本文描述的任何其他存储介质等)，或者被包括在一个或多个单独的物理组件或介质(例如，多个cd、磁盘或其他存储设备、本文描述的任何其他存储介质等)中。
108.虽然在附图中以特定顺序描绘了操作，但是不需要以所示的特定顺序或按顺序执行这些操作，并且不需要执行所有示出的操作。本文描述的动作可以以不同的顺序执行。
109.各种系统组件的分离不需要在所有实施方式中分离，并且所描述的程序组件可以包括在单个硬件或软件产品中。
110.现在已经描述了一些说明性实施方式，显而易见的是，前述内容是说明性的而非限制性的，已经通过示例的方式呈现。特别地，尽管本文呈现的许多示例涉及方法动作或系统元件的特定组合，但是那些动作和那些元件可以以其他方式组合以实现相同的目标。结合一个实施方式讨论的动作、元件和特征不旨在被排除在其他实施方式中的类似角色之外。
111.本文使用的措辞和术语是出于说明书的目的，并且不应被认为是限制性的。本文中对“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”、“特征在于”、“特征在于”及其变型的使用意在涵盖其后列出的项目、其等同物和附加项目，以及由其后排他地列出的项目组成的替代实施方式。在一个实施方式中，本文描述的系统和方法由所描述的元件、动作或组件中的一个、多于一个的每个组合或全部组成。
112.如本文所用，术语“约”和“基本上”将被本领域普通技术人员理解，并且将在某种程度上根据使用它们的上下文而变化。如果考虑到使用该术语的上下文，该术语的使用对于本领域普通技术人员来说是不清楚的，则“约”将意指高达特定术语的正负10％。
113.对本文中以单数形式提及的系统和方法的实现方式或元件或动作的任何引用也可以包含包括多个这些元件的实现方式，并且对本文中的任何实现方式或元件或动作的以复数形式的任何引用也可以包含仅包括单个元件的实现方式。单数或复数形式的引用并不旨在将当前公开的系统或方法、其组件、动作或元件限制为单个或多个配置。对基于任何信息、动作或元件的任何动作或元件的引用可以包括其中动作或元件至少部分地基于任何信息、动作或元件的实现方式。
114.本文公开的任何实现方式可以与任何其他实现方式或实施例组合，并且对“实施方式”、“一些实施方式”、“一个实施方式”等的引用不一定是相互排斥的，并且旨在指示结合实施方式描述的特定特征、结构或特性可以包括在至少一个实施方式或实施例中。如本文所使用的这些术语不一定都指代相同的实施方式。任何实施方式可以以与本文公开的方面和实施方式一致的任何方式包含地或排他地与任何其他实施方式组合。
115.除非明确相反指示，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”应理解为意指“至少一个”。
116.对“或”的引用可以被解释为包含性的，使得使用“或”描述的任何术语可以指示单个、多于一个和所有描述的术语中的任何一个。例如，对
“‘
a’和
‘
b’中的至少一个”的引用可以仅包括
‘
a’，仅包括
‘
b’，以及包括
‘
a’和
‘
b’两者。与“包括”或其他开放术语结合使用的这种引用可以包括附加项。
117.在附图、详细说明书或任何权利要求中的技术特征后跟有附图标记的情况下，包括附图标记以增加附图、详细说明书和权利要求的可理解性。因此，附图标记和它们的缺失都不对任何权利要求要素的范围具有任何限制作用。
118.本文描述的系统和方法可以在不脱离其特性的情况下以其他特定形式体现。前述实施方式是说明性的而不是限制所描述的系统和方法。因此，本文描述的系统和方法的范围由所附权利要求而不是前述说明书指示，并且在权利要求的等同物的含义和范围内的变化包含在其中。